Name: 반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 학습하세요 PEG 기반 반전 콜로이드 결정체 비계 제작 방법을 통해 간 세포의 장기간 기능 유지를 가능하게 하는 삼차원 배양 플랫폼을 구축하는 기술을 익히세요. 이 방법은 약물 테스트 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 국립 연구 재단 원정대 (NRF -NRFF2011-01)과 경쟁 연구 프로그램 (NRF-CRP10-2012-07)의 지원을 인정하고 싶습니다.

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

조직 공학 발판 빠르게 모든, 재생 유지, 또는 약물, 질병을 연구, 개발, 장기 교체 응용 프로그램에 대한 조직을 복구하는 데 필요한 물리적, 생화학 적 단서, 그리고 많은 다른 57를 제공하기 위해 진화하고있다. 간 조직 공학에서 차 인간 간세포 빠르게 한 번 몸에서 격리 대사 기능, 엔지니어링 발판을위한 훌륭한 필요성을 생성하고 간 기능을 유지하기 위해 플랫폼 개발을 잃게됩니다. 체외 간세포 배양 플랫폼에서 현재는 다른 생체 재료를 사용했다. 이 분야의 연구는 이러한 ECM 단백질 구성 58, 59, 60, 61 공 배양하고 (62)과 같은 미세 가공 생체 간 미세 다양한 기능을 모방 중심으로하고있다. 그러나, 제어 다공성 및 높은 공간 조직과 비계의 부족이 있었다. 이와 관련하여, 설명 된 ICC 세포 배양 platfORM, 그 등방성 특성과 높은 조직이 무효을 해결합니다. 우리는 ICC PEG...

간은 혈액 해독, 생체 이물질의 대사 및 혈청 단백질의 생산을 포함하여 다양한 기능을 가진 매우 혈관 기관이다. 간 조직은 여러 종류의 세포, 담즙 누소관, 정현파 및 다른 biomatrix 조성물 및 다른 산소 농도의 영역으로 포함하는 복잡한 3 차원 마이크로 구조를 갖는다. 이러한 복잡한 구조를 고려할 때 시험 관내 (1) 적절한 간 모델을 만드는 것이 어려웠다. 그러나, 시험 관내 모델에서 기능 테스트 약물 독성 2 플랫폼 인간 간세포를 호스팅 간 3과 관련된 질환을 연구하는 수요가있다. 현재 간암 조직 공학 플랫폼 조나의 생화학 적 조성물을 분리, 또는 간장의 파라미터 중, 몇 개의 셀 (4) 즉, 공존 배양을 집중하여 간암의 복잡성을 단순화 한L 개의 미세 환경 5 유동 역학 6,7 및 biomatrix 8의 구성. biomatrix 구성은 지지체 물질, 세포 외 기질 (ECM) 단백질 조성물, 매트릭스 경도뿐만 아니라 지지체의 디자인 및 구조와 같은 파라미터로 나눌 수있다. 조정 하이드로 겔의 기계적 특성, 생체 활성 및 열화 율에 기능 부여, 합성 하이드로 겔, 특히 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)을 사용하여 하이드로 겔 9 조직 공학 연구의 증가가 있었다. 간 관련 연구와 관련하여, 생체 적합성 하이드로 겔은 간 질환 3의 바이러스 감염 연구에 적용 하였다. 간세포 플랫폼 설계로서 수많은 연구는 생체 내 미세 환경에서 모방 필수적인 차원 환경과 셀 ECM 및 세포 - 세포 상호 작용을 제공하기 위해 하이드로 겔 (12, 13) 내에서 간세포 샌드위치 배양 10,11 세포 캡슐화를 이용했다. 하우버전, 이러한 플랫폼은 지지체 (14)를 통해 비 균일 한 특성을 선도, 제어 및 공간 조직의 높은 수준을 가지고 있지 않습니다. 반전 결정 콜로이드 (ICC)는 14 비계 먼저 2000 년대 초반에 도입 된 세포 배양을위한 매우 조직 차원의 발판이다. 발판의 독특한 구조는 콜로이드 성 결정 가변 직경의 콜로이드 입자의 정 합체를 이용하여 간단한 제조 공정에 기인 할 수있다. 간략하게, 프로세스를 요약하기 위해, 입자는 깔끔하게 배치 격자를 형성하는 열을 이용하여 어닐링된다. 고 표면적을 갖는 육방 충전 구형 캐비티 (15)의 중합 된 겔 결과, 유기 용매에 의한이 격자의 침출. 이 높은 순서 지지체 이전 (아크릴 아미드) 16-21, 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산), 폴리에 한정 15,22-30, 합성 및 천연 재료 모두에서 만들어진 포함하되되었는지폴리 (에틸렌 글리콜) (31, 32), 폴리 (2- 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트) 21,33-35, 키토산 36-39. 비 오염 물질로 만들어진 ICC의 발판이 공동 14,23,40 내에서 세포 회전 타원체를 촉진하는 경향이있다. 여러 종류의 세포가 성공적으로 셀 (43, 44)을 확산이 구성에서 차별화 기능 연골 41, 골수 간질 세포 (42)를 포함하고, 줄기 밝혀졌다. 간세포 대해서는 연구 된 ICC 나 2 SiO3과 폴리 (아크릴 아미드)로 이루어지는 지지체 아니라 PEG로 수행되었다. 간단한 바이오 콘쥬 게이션 전략 (즉, EDC / NHS를 통해 아민 커플 링), ECM 단백질 공역 PEG 기반의 발판이 환경과 같은 생체 내에서 더를하고 간 기능을 향상시키기 위해 더 많은 세포 결합 부위를 입증 할 수있는, 제조 할 수있다. 이 원고 및 관련 비디오에서 세부 사항에게 ICC 지지체의 제조를 우리(허 7.5) 배양 간암에 최적화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 및 폴리스티렌 미세 구조 격자를 사용. 우리는 비계 토폴로지 및 전지 성능의 관점에서 일반적으로 비 접착식 베어 PEGDA의 ICC의 발판과 콜라겐 코팅 PEGDA의 ICC 지지체의 차이점을 보여줍니다. 세포 생존 및 기능이 허 - 7.5 셀 행동을 평가하는 정 성적 및 정량적으로 측정한다.

<table><tbody><tr><td>0.2ml PCR 튜브</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td><td>종기 방지</td></tr><tr><td>고릴라 접착제 Gorilla</td><td>Glue, Inc.</td><td>공급업체에 따라 다릅니다. 이것은 지역 상점에서 구입했습니다.</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>치수: 24&times; 60 mm2</td></tr><tr><td>폴리스티렌 구체</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>직경 = 140 &마이크로; m; 3x104 밀리리터당 입자 및 1.4% 크기 분포</td></tr><tr>분석 EMSURE를 위한<td>에탄올</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>절대; Milli-Q 물 초음파 수조로 70%로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Furnace</td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>장비</td></tr><tr><td>200 &마이크로; l 피펫 팁</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>흔들림</td><td>쉐이커 VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; PEG 단량체의 아크릴화와 생성된 침전물의 정제는 Mw = 4.6&nbsp인 PEGDA 단량체를 생성합니다. kDa</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>장비</td></tr><tr><td>아크릴레이트-폴리(에틸렌 글리콜) - 숙시니미딜 발레레이트</td><td>레이산 바이오</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3.4 kDa</td></tr><tr><td>2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논</td><td>시그마 알드리치</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>와류</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>장비</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 필름</td><td>파라필름 M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>9"로 유지되며 10.84의 강도를 허용합니다. mW/cm2</td></tr><tr><td>Bluewave 200 UV 스포트라이트</td><td>블레이즈 기술&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>테트라하이드로푸란(THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>쥐에서. 1x, caCl 없음2 & MgCl<이하 >2</이하 >; pH = 7.2</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V AQ. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>장비</td></tr><tr><td>프리존 4.5 동결 건조기</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>장비</td></tr><tr><td>스퍼터 코터</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>장비</td></tr><tr><td>주사전자현미경</td><td>전(주)</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 타입 I에 대한 안티-마우스 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 2차 항체 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>플레이트, 조직 배양 24 웰, 플랫 바텀 (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L 포도당 w/ L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning 비처리 배양 접시</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>장비; 37&nbsp; &데그; C, 5%</td></tr><tr><td>습도 Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>포유류 세포용 Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 분석</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>모노나트륨-염 시약(MSR)</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO 마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin Human ELISA kit</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 라벨링 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC 물</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>나노드롭 2000c 분광광도계</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript 역전사 Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR은 CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td>Primers를 위한 마스터 믹스</tr><tr><td>를 선택합니다(선택 예정)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 실시간 시스템, C-1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

, 생체 이물질 &#39;독성 테스트 바이러스 감염 연구 및 간암을 대상으로 약물을 개발하기위한 목적으로, 시험 관내 간세포의 기능을 유지하는 능력은 세포 적당한 생화학 적 및 기계적 신호를 수신 한 플랫폼이 필요하다. 최근 간 조직 공학 시스템은 높은 수분 보유하고 세포에 필요한 기계적인 자극을 제공 할 능력이 주어 합성 또는 천연 하이드로 겔로 구성된 3 차원 지지체를 이용 하였다. 반전 콜로이드 결정 (ICC) 지지체에 대한 관심이 증가되고있다, 높은 공간 조직 동형과 이형 세포의 상호 작용뿐만 아니라, 세포 외 기질 (ECM)의 상호 작용을 가능하게하는 최근에 개발. 여기서, 우리는 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA) 및 입자 침출 방법을 이용하여 ICC 지지체를 제조하는 프로토콜을 기술한다. 간략하게, 격자는 미세 입자로부터 만들어지는 전 후 polymeR 용액 중합 적절히 첨가되고, 입자는 유기 용매 (예 : 테트라 히드로 푸란)을 사용하여 제거하거나 침출된다. 제어 된 기공 크기 및 미디어보다 쉽게​​ 세포에 도달 할 수 있도록 상호 연관성이있는 다공성 지지체의 격자 결과의 용해. 이 독특한 구조는 세포뿐만 아니라 쉽게 기공 사이의 통신, 및 단백질과 PEGDA의 ICC 지지체는 전지 성능에 현저한 효과를 나타낸다 코팅 할 수있는 능력에 부착하기위한 고 표면적을 허용한다. 우리는 가능성의 관점에서, 골격의 형태뿐만 아니라, 간암 세포 (허 7.5) 동작을 분석하고 ICC 구조 ECM 코팅의 효과를 조사하는 기능을한다. 전반적으로,이 논문은 조직 공학에서 다양한 응용 프로그램, 특히 간 조직 공학을 가진 새로운 발판의 상세한 프로토콜을 제공합니다.

국제 형사 재판소 지지체의 구조 특성 및 간세포를 배양의 각 ICC의 발판 조건의 효능의 비교에 대한 대표적인 결과가 표시하고 아래에 설명되어 있습니다. 이러한 결과에서 사용 ICC 골격 조건은 0 μg의 / ㎖ (맨발), 20 ㎍ / ㎖ (콜라겐 20), 200 ㎍ / ㎖ (콜라겐 200) 및 400 ㎍ / ㎖ (400 콜라겐) 및 초기의 콜라겐 코팅되어 허-7.5 셀 시드 수는 1 × 6입니다. ICC 기공 상호 및 발판 토폴로지의 특성. SEM 영상은 ICC 지지체의 고정 및 동결 건조 후, 제 ICC 기공 사이의 적절한 상호 접속이 형성되었는지 여부를 결정하고, 골격 토폴로지 변화 콜라겐 농도의 접합의 효과를 확인 하였다. ...

이 원고는 새로운 3차원 간세포 배양 플랫폼, 역콜로이드 결정 골격 및 간세포 거동을 평가하기 위한 수반되는 기술의 제작을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 크기 조절 가능한 기공, 상호 연결성 및 세포 외 기질 단백질을 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 골격에 접합하는 능력은 Huh-7.5 세포 성능을 향상시킵니다.

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

본 절차의 전반적인 목표는 간 조직 공학 응용을 위해 세포외 기질이 코딩된 PEG 기반의 역오팔 콜로이드 결정 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 간 조직 공학은 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 매우 유망한 영역입니다. 당사는 간세포가 장기간 동안 그 기능을 유지할 수 있도록 하는 3D 공학 스캐폴드를 제작하고 있습니다.이 기술의 영향은 약물 테스트로까지 확장될 수 있는데, 본 시스템으로 배양된 간세포는 기능을 더 오래 유지하고 약물에 더 잘 반응할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 조직 공학에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 줄기세포를 사용하는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 시연 절차는 저희 연구실의 대학원생인 Hitomi가 진행하겠습니다.마이크로비즈 몰드를 준비하려면, 먼저 0.2 milliliter 내열 마이크로원심분리 튜브의 팁을 40 microliter 높이에서 절단합니다. 방수 접착제를 사용하여 절단된 튜브의 윗부분을 유리 현미경 커버슬립에 부착한 다음, 몰드 주변을 접착제로 고정합니다. 다음으로, 폴리스티렌 마이크로스피어 바이알 내의 물을 70% ethanol로 교체합니다.구체 용액을 초음파 세척기에 넣고 30 watts에서 3분 동안 초음파 처리하여 응집된 구체들을 분산시킵니다. 마이크로구체가 준비되면, 각 몰드에 에탄올 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 그다지 200 µL 피펫 팁의 윗부분을 4 mm 절단한 후, 이를 사용하여 폴리스티렌 마이크로구체 25 µL를 몰드에 두 번 분주합니다.몰드를 로킹 쉐이커(rocking shaker) 위에 놓고 120 RPM으로 설정합니다. 샘플을 쉐이커 위에서 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 몰드를 현미경 아래에 놓고 구체들이 육각형으로 배열되었는지 확인합니다.에탄올을 실온에서 이틀 밤 동안 증발시키십시오. 그 후, 몰드와 비드 복합체를 130 °C 오븐에 6시간 동안 조심스럽게 넣어 폴리스티렌 비드를 어닐링하고 3D 스캐폴드의 음형을 형성하십시오. 먼저, 다음 두 참고 문헌에 설명된 기설정된 프로토콜을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 매크로머를 합성하십시오.다음으로, 탈이온수에 PEGDA 50% 용액을 조제하고 혼합물이 완전히 용해될 때까지 원심분리합니다. 세포외 기질 결합 스캐폴드의 경우, 50% PEGDA 용액에 크릴 오일 PEG NHS 10%를 추가로 첨가합니다. 그런 다음, 70% 에탄올에 광개시제 20% 스톡 용액을 조제합니다.PEG

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생명공학

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