반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼

본 절차의 전반적인 목표는 간 조직 공학 응용을 위해 세포외 기질이 코딩된 PEG 기반의 역오팔 콜로이드 결정 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 간 조직 공학은 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 매우 유망한 영역입니다. 당사는 간세포가 장기간 동안 그 기능을 유지할 수 있도록 하는 3D 공학 스캐폴드를 제작하고 있습니다.

이 기술의 영향은 약물 테스트로까지 확장될 수 있는데, 본 시스템으로 배양된 간세포는 기능을 더 오래 유지하고 약물에 더 잘 반응할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 조직 공학에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 줄기세포를 사용하는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 시연 절차는 저희 연구실의 대학원생인 Hitomi가 진행하겠습니다.

마이크로비즈 몰드를 준비하려면, 먼저 0.2 milliliter 내열 마이크로원심분리 튜브의 팁을 40 microliter 높이에서 절단합니다. 방수 접착제를 사용하여 절단된 튜브의 윗부분을 유리 현미경 커버슬립에 부착한 다음, 몰드 주변을 접착제로 고정합니다. 다음으로, 폴리스티렌 마이크로스피어 바이알 내의 물을 70% ethanol로 교체합니다.

구체 용액을 초음파 세척기에 넣고 30 watts에서 3분 동안 초음파 처리하여 응집된 구체들을 분산시킵니다. 마이크로구체가 준비되면, 각 몰드에 에탄올 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 그다지 200 µL 피펫 팁의 윗부분을 4 mm 절단한 후, 이를 사용하여 폴리스티렌 마이크로구체 25 µL를 몰드에 두 번 분주합니다.

몰드를 로킹 쉐이커(rocking shaker) 위에 놓고 120 RPM으로 설정합니다. 샘플을 쉐이커 위에서 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 몰드를 현미경 아래에 놓고 구체들이 육각형으로 배열되었는지 확인합니다.

에탄올을 실온에서 이틀 밤 동안 증발시키십시오. 그 후, 몰드와 비드 복합체를 130 °C 오븐에 6시간 동안 조심스럽게 넣어 폴리스티렌 비드를 어닐링하고 3D 스캐폴드의 음형을 형성하십시오. 먼저, 다음 두 참고 문헌에 설명된 기설정된 프로토콜을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 매크로머를 합성하십시오.

다음으로, 탈이온수에 PEGDA 50% 용액을 조제하고 혼합물이 완전히 용해될 때까지 원심분리합니다. 세포외 기질 결합 스캐폴드의 경우, 50% PEGDA 용액에 크릴 오일 PEG NHS 10%를 추가로 첨가합니다. 그런 다음, 70% 에탄올에 광개시제 20% 스톡 용액을 조제합니다.

PEGDA 혼합물 1 mL당 광개시제 용액 50 µL를 첨가합니다. 그 다음, 혼합물을 1분 동안 볼텍싱합니다. 이어서, 유리 슬라이드에서 몰드를 벗겨내고 스패튤라를 사용하여 격자를 조심스럽게 밀어낸 후, 각각 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.

각 튜브에 PEGDA 용액 300 µL를 피펫으로 넣은 다음, 튜브를 원심 분리하여 PEGDA 용액이 폴리스티렌 격자 내부로 침투하도록 합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 튜브에서 격자를 꺼내고 표면에 남은 과잉 PEGDA 용액을 조심스럽게 닦아냅니다. 격자의 평평하고 둥근 면이 위를 향하도록 파라핀 필름이 덮인 유리 위에 놓습니다.

그런 다음, UV 스팟 램프를 사용하여 스캐폴드를 365 nanometer 자외선에 5분 동안 노출시킵니다. 약 10개의 PEGDA 중합 결정 격자를 새 바이알에 넣고 20 milliliters의 THF를 추가합니다. 오비탈 쉐이커에서 300 RPM으로 6시간 동안 바이알을 흔들어 섞어줍니다.

1~2시간마다 바이알을 꺼내 폴리머가 포함된 용매를 신선한 THF로 교체합니다. 마지막 세척 후, 사용한 THF 용액에 물을 추가하여 PS 구체가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 용액이 하얀색이면 용액이 투명해질 때까지 추가 세척을 수행합니다.

스캐폴드를 멸균하려면, 스캐폴드당 2 mL의 70% ethanol을 넣은 50 mL 마이크로원심분리 튜브를 준비하고 스패튤라를 사용하여 스캐폴드를 튜브에 넣습니다. 스캐폴드를 ethanol에 1시간 동안 담가 둡니다. 1시간 후, ethanol을 조심스럽게 따라내고 동일한 부피의 멸균 PBS로 교체합니다.

그 다음, 스캐폴드를 원심 분리하여 기포를 제거합니다. 원심 분리한 스캐폴드를 4°C에서 보관하며, 1~2시간마다 꺼내어 용액을 신선한 PBS로 교체합니다. PBS를 몇 차례 교체한 후, 콜라겐을 코팅할 스캐폴드를 꺼내어 코팅할 스캐폴드당 1 mL의 collagen type one이 들어 있는 튜브에 넣습니다.

다음으로, 이전과 동일하게 튜브를 원심분리한 후, 오비탈 셰이커에서 400 RPM으로 30분 동안 스캐폴드를 흔들어 줍니다. 스캐폴드를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 간암 세포를 10 mL의 배지가 담긴 100 mm 세포 배양 접시에서 배양합니다.

세포 밀도가 배양 표면의 75~80%에 도달할 때까지 3일마다 배지를 교체하십시오. 세포가 준비되면, 스캐폴드의 평평한 면이 위를 향하도록 하여 24-well plate에 조심스럽게 배치하십시오. 그런 다음, 각 스캐폴드를 2 mL의 PBS로 헹굽니다.

PBS를 흡입하여 제거하고 지지체에 성장 배지 2 mL를 첨가합니다. 30분 후 배지를 제거하고 지지체를 1시간 동안 건조시킵니다. 다음으로, 트립신 소화법을 사용하여 간암 세포를 수확합니다.

세포를 펠렛화한 후, 상층액을 제거하고 25 µL당 100만 개의 세포가 되도록 펠렛을 재부유합니다. 각 스캐폴드 위에 세포 현탁액 25 µL를 천천히 피펫팅하여 분주합니다. 그런 다음, 플레이트를 덮고 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 스캐폴드를 조심스럽게 새로운 24-웰 플레이트로 옮기고, 각 웰에 배지 2 mL를 파이펫으로 분주한 후 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다. 여기에 스캐폴드의 주사전자현미경 사진이 나와 있습니다. 이는 평균 직경 100~105 µm의 기공들이 육방최밀충진 구조로 배열되어 있으며, 이 기공들은 주로 직경 35~40 µm 사이인 인접 기공들과 상호 연결되어 있습니다.

간암 세포를 분주했을 때, 세포는 collagen type one이 사전 코팅된 스캐폴드 상에서는 성장 및 증식하였으나, 코팅되지 않은 스캐폴드 상에서는 수가 증가하지 않았습니다. 또한, collagen이 코팅된 스캐폴드 상의 간암 세포는 농도 의존적인 방식으로 더 높은 세포 기능을 나타냈습니다. 14일째에 400 µg/mL로 코팅된 ICC 스캐폴드에서 배양된 간암 세포는 코팅되지 않은 스캐폴드에서 배양된 세포보다 3배 이상의 albumin을 분비했습니다.

이 절차를 수행할 때, 격자 내의 폴리스티렌 구체들이 적절하게 배열되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 배열 상태가 좋지 않으면 상호 연결성이 떨어져 세포 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 코팅 처리가 된 세포화된 PEG 기반 역콜로이드 결정 스캐폴드를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran)을 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 실험 절차를 수행하는 동안에는 항상 흄 후드 내에서 작업하고 장갑과 보호 안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.