Name: 높은 처리량 유전자 태그에 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 학습하세요 Trypanosoma brucei에서 고처리량 단백질 태깅 방법을 통해 단백질 국소화와 기능을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 대규모 게놈 연구를 위한 효율적인 단백질 분석을 가능하게 합니다.

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SD는 Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]의 지원을 받았습니다. 이 연구는 Keith Gull 교수에게 수여된 Wellcome Trust 보조금 [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z]의 지원을 받았습니다. 도움이 되는 대화와 통찰력을 제공해 주신 Keith Gull 교수님께 감사드립니다.

1. 96 웰 긴 뇌관 PCR <ol><li> -80 ° C의 냉동고에서 사전 동결 96 웰 PCR 쿨러. </li><li> 10 ML 튜브에서, 마스터 섞어 준비 : 2,100 μL의 DDH 2 O, 105 ㎕의 PCR 학년 DMSO, 접시 당 2,415 μL의 총 부피 105 μL 10 밀리미터의 dNTPs, 105 ㎕의 pPOT 템플릿 (25 NG / μL) 9 . </li><li> 분취 량을 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 23 μL. </li><li> 각각 P20 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 잘로드에 프라이머를 풀링 100 μM의 2 μl를 추가합니다. 사전 냉장 PCR 쿨러에 필름, 장소 플레이트 인감 및 -80 ° C에서 20 분의 최소 고정 할 수 있습니다. </li><li> 10 ML 튜브에서, 마스터 믹스 B를 준비 : 2,048 μL의 DDH 2 O, 525 ㎕의 10 배 버퍼, 접시 당 2,626 μL의 총 볼륨의 52.5 μl를 중합 효소. </li><li> -80 ° C 냉장고에서 플레이트와 PCR 쿨러를 제거합니다. </li><li> PCR을 쿨러에 여전히 판으로, 동결의 상단에 25 μl의 마스터 믹스 B를 추가N 마스터 믹스 50 μL의 총 반응 볼륨. 이 시간이 중요하고, 혼합 A는 해동하기 전에 완료해야합니다. 필름 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> 다음과 같이 열 자전거 타는 사람을 설정 10 분 동안 94 ° C를, 다음 7 분 72 ° C의 최종 연장 기간 다음 2 분 15 초, 30 초 동안 65 ° C, 72 ° C 94 ° C의 30주기 . </li><li> 블록이 94 °의 C에 도달 한 후 PCR 플레이트를 넣습니다. </li></ol> 96 웰 긴 뇌관 PCR 2. 검증 <ol><li> 큰 1 % 캐스트 트리스 아세테이트 EDTA (TAE)에서 아가로 오스 겔 (/ V 승) 4 × 28 웰 빗으로 버퍼를 실행하는 우물의 4 행으로 겔을 제공 할 수 있습니다. 12 채널 멀티 채널 피펫의 팁 빗의 대체 치아를 맞 춥니 다. 차선가로드 된 후 조심스럽게 버퍼를 실행 TAE에서 젤 잠수함. </li><li> 1 차 및 28 일도의 각 행에로드 1킬로바이트의 DNA 사다리. </li><li> P20 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여, PCR 생성물의 DIR 2 μL를 전송할ectly 겔 (그림 1A)의 각 레인에. 앰플 리콘 오염의 가능성을 줄이기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다. <ol><li> (- 레인 3, A2 - 레인 5 ...... A11 - 레인 (23), A12 - 레인 (25) A1) 및 PCR 제품을로드 겔의 첫 번째 행의 홀수 차선으로 PCR 플레이트의 행 A로부터 PCR 제품을로드 겔의 1 차 행의 짝수 레인에 PCR 플레이트의 행 B에서 (B1 - 레인 4, A2 - 레인 6 ...... B11 - 레인 24, B12 - 레인 (26)). </li><li> 짝수 번째의 차선에 차선 행 D 홀수 행으로 C와, 상술 한 바와 같은 패턴을 사용하여 PCR 플레이트의 로우 C 및 D에서 PCR 제품로드. PCR을 플레이트의 각 웰 겔 상에 로딩 될 때까지 로딩 패턴을 계속한다. DNA 로딩 버퍼는이 겔을로드 할 필요가 없습니다. </li></ol></li><li> 실행중인 탱크에 젤을 놓고 겔 침수 될 때까지 버퍼를 실행 TAE와 탱크를 채우십시오. 30 분 동안 100 V에서 실행하고UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 예를 들어 겔 그림 1B를 참조하십시오. 주 : PCR 제품 몇 주 전에 형질 감염을 위해 -20 ℃에서 저장 될 수있다 </li></ol> 3. 96 - 웰 형질 <ol><li> T.를 사용하여 brucei procyclic 형태 세포주이 절차 SMOXP9 10 FCS 10 10 % 함유 SDM-79 미디어에서 성장. </li><li> 형질 당 1 × 10 7 세포를 사용 (1.1 × 109 세포의 총) N 개의 단백질의 말단 및 형질 당 2 × 10 7 세포에 태그 (2.2 × 109 세포의 합계)의 C 말단에 태그 단백질. 형질 감염 전에 몇 일 동안 중앙 로그 (1.2 × 10 6 -1 × 10 7 세포 / ㎖)의 세포를 유지하고, 5-8 × 106 세포 / ml의 밀도로 형질 감염을 위해 세포를 수확. </li><li> 형질 전환을위한 냉동 PCR 제품은 실온에서 해동하도록 허용합니다. </li><li> 헴를 사용하여 세포를 계산ocytometer 또는 자동 세포 계수기. </li><li> 10 분 동안 800 XG에 여러 50 ml의 튜브에 세포 펠렛 필요한 수. </li><li> 원심 폐기 상등액 후 10 ㎖의 세포를 재현 탁 변성 cytomix (0.8 mM의 EGTA, 24 mM의 KCl을 0.15 mM의 CaCl2를 10 mM의 인산 칼륨 완충액 pH7.6, 25 mM의 HEPES-KOH pH7.6, 2.6 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % (W / V) 포도당, 튜브 당 100 μg의 / ㎖ BSA, 1 ㎜의 하이포크 산틴, 144 MM의 자당). 하나의 관에 대한 모든 셀 솔루션을 전송하고 10 분 동안 800 × g으로 다시 스핀. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 5 × 107 세포 / ㎖의 최종 농도를 위해 수정 cytomix 23 ㎖ 중의 세포를 재현 탁. </li><li> 세포가 회전하는 동안, 4 × 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 SDM-79 미디어 1 ㎖를 추가한다. 판의 AD 레이블 및 플레이트 방향을 돕기 위해 영구 마커의 각 접시에 주위에 잘 A1을 반지를 그립니다. </li><li> electroporator에 판 핸들러를 연결합니다. electropora에토 부 1500 V의 전압을 100 마이크로 초까지의 펄스 길이와 12의 펄스 수 500 밀리의 펄스 간격을 설정한다. 판 핸들러에서이 그 electroporator가 전기 판의 12 열 각각에 단일 펄스를 적용 할 것을 보장 1에 펄스 수를 설정합니다. </li><li> P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 일회용 전기, 4mm 간격으로 PCR 플레이트에서 PCR 반응을 옮긴다. </li><li> 세포가 스펀 및 5 × 107 세포 / ㎖ (단계 3.7)의 최종 농도로 재현 탁 될 때, 시약 저장 용기에 옮긴다. 피펫 P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 전기 천공 플레이트의 각 웰에 세포 용액 200 μL를, 피펫 팅하여 PCR 생성물과 함께 혼합한다. </li><li> 조직을 사용하여 단락을 방지하기 위해 판의 상부에서 모든 액 적을 제거한다. </li><li> 일렉트로 플레이트, POS의 상단 플레이트 패키지에 제공되는 밀봉 막 적용이를 itioning 각 기둥의 상단과 하단에 드러난 전극 용 구멍 남도록. 필름을 가이드하는 데 상승 점을 덮는 피. </li><li> 판 핸들러에 전기 플레이트를 넣고 뚜껑을 닫습니다. electroporator 유닛을 눌러 &#39;펄스&#39;. </li><li> 전기 천공 후, 신속하게 4 × 24 웰 조직 배양 플레이트의 96 웰 플레이트에서 전기 천공 된 세포를 옮긴다. 셀을 전송하려면, 다른 모든 팁 누락으로 P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하는 등 나머지 6 팁 24 잘 조직 배양 접시에 6 행으로 줄 것이다. 24 웰 조직 배양 플레이트 (도 2A)에 미리 정의 된 패턴으로 96- 웰 플레이트에서 electroporations 일렉트릭 세포 이동. </li><li> P200 피펫 팁을 준비 - 각 96 웰의 형질을 제거 다른 모든 컬럼 (96) 팁이 상자를 준비합니다. <ol><li> 96 웰 전기 판에 전송 우물 A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11에행 B로 24 웰 조직 배양 플레이트의 행 A, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11를 접시, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 행 C로 및 D1 / D3 / D5 / D7 24 웰 플레이트의 96 웰 플레이트를 6 웰의 각 세트의 전송 후에 행 D.로 / D9는 / D11, 96 웰 플레이트의 웰을 다음 24에 해당하는 웰로부터 매체로 세척 웰 플레이트 및 세척 후, 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li><li> 행 B에 E1은 / E3가 / E5는 / E7이 / E9 / E11 96 - 웰 전기 판에 24 웰 플레이트 B 행 (A)에, F1은 / F3는 / F5는 / F7은 / F9가 / F11 전송 우물, G1 / G3 / G5 / 96에서 행 C와 H1 / H3는 / H5 / H7은 / H9 24 웰 플레이트에 96 웰 플레이트 6 우물의 각 세트의 전송 후 행 D.에 / H11, 우물에 G7은 / G9 / G11 웰로 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li><li> 24 웰 플레이트 C 행 A, B2 / B4 / B6 / B에 96 웰 전기 판에 전송 우물 A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12 행 B에, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 행 C와 96에서 6 우물의 각 세트의 전송 후 행 D.에 D2가 / D4는 / D6는 / D8은 / D10 / D12에 24 웰 플레이트 웰로는 96- 웰 플레이트의 웰을 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li><li> 전송 우물 E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24 웰 플레이트 D 행 (A)에 96 - 웰 전기 판에, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / 행 B에 F12, G2 / G4 / G6 / 행 C로 G8 / G10 / G12 및 H2는 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 행 D.로 24 웰 플레이트에 96 웰 플레이트 6 우물의 각 세트의 전송 후, 96 웰 웰로 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li></ol></li><li> 역 위상차 현미경을 사용하여 세포를 확인하기 위해 각각의 열로부터도 1을 검토한다. A의 라이브와 죽은 세포의 혼합물이있을 것이다세포 파편의 상당량. 그들은 위상차 현미경 하에서 밝은 것 및 이동되기 때문에 생균 사균과 구별 될 수있다. </li><li> 꽉 밀봉을 형성하는 뚜껑 깨끗하고 플라스틱 상자에 24 웰 플레이트를 놓습니다. 28 ° C 배양기에서 상자를 넣습니다. </li><li> 시간 6-8 년 사이에 후, 각 웰에 2 배 선택적 항생제를 포함하는 10 % FCS와 SDM-79 1 ㎖를 추가합니다. 우리의 경험에서, 유전자의 N 말단에 태그 된 세포주 선택적 약물의 높은 농도에 내성이다. 따라서, N 말단에 태깅, 예를 들어 블라스트 사용하여 용액 및 C 말단에 태깅 / ㎖ 블라스트 10 μg의 최종 농도를 필요로 블라스트 / 20 μg의 최종 농도를 필요로한다. 참고 : 형질 전환 세포주가 형질 전환 후 볼 수 9-10일 될 것입니다. </li><li> 회 이상 신선한 미디어 약물 및 사전 분석 통로.도 2b는 전형적인 96- 웰 transfe의 결과를 나타낸다상기 N 말단에 96 서로 다른 단백질을 태그에 대한 ction. 건강한, 약제 내성 세포가 포함되어 있는지 확인 위상차 현미경으로 각 웰을 평가합니다. 건강 잘 위상 계약 현미경의 밝은 주로 (&lt;95 %)이 높은 활성 셀이 포함되어 있습니다. 표면 형광 현미경 또는 웨스턴 블롯에 의해 후속 분석 단백질에 태그가되었는지를 결정하기 위해 요구된다. </li></ol>

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지난 5-10년에서 단백질 체학 및 transcriptomics 방법의 감도에 극적인 개선은 유전자와 그들의 제품의 수천에 중요한 데이터를 제공하고 있습니다. 그러나 도구는이 단백질의 기능이 속도를 유지하지 않은 해결합니다. 단백질에 태그를 지정하면 그 기능을 결정하기 위해 다양한 실험을 용이하게한다. 예를 들어, 단백질은 지역화 공동 지역화 연구를 용이하게하기 위해 서로 다른 색상의 다양한 형광 단백질에 융합 될 수있다. 태그는 APEX2 또는 miniSOG 11, 12 등의 전자 현미경을 위해 개발 된 태그 단백질의 미세 현지화 할 수 있습니다. 같은 TAP 태그 및 ProtC-TEV-의 동지 (PTP) 등의 생화학에 대한 태그, 7,13 바인딩 파트너의 식별 또는 생체 외 생화학 적 분석에서 단백질과 관련된 단지의 정화를 허용 태그. protoc의 성공에 중요한 특정 단계상기 PCR 마스터 믹스 (1)에 DMSO 혼입 마스터 믹스 (2), 마스터 믹스 (2)의 상업용 폴리머의 사용과 cytomix 전기 천공 버퍼의 변형 예의 첨가하기 전에 PCR 마스터 믹스 한 동결 : 올이다. 우리의 경험에서, 양성의 웰과 유사한 비율을 달성하기 위해 N 말단 태깅 형질 감염 용으로 C 말단 태깅을 위해 형질 세포의 두 수를 사용하는 것이 필요하다. 따라서 설명한 모든 단계가 수행되어야한다. 이 기술은 곤충 procyclic 양식 트리파노소마를 형질 때 성공에만 가능성이있다. 혈류 형태는 또한 그들이 때문에 선택적 약물 관련이 농도 의존적 독성 선택시 사망 할 가능성이 낮은 형질 전환 효율 (14)이있다. 따라서, 우리의 이전 프로토콜은 혈류 형태의 트리 파노 솜 (9)의 태그의 현재 최고의 기술을 나타낸다. 또한 트랜스 것으로 보인다fection 효율은 특정 트리파노소마의 분리에 의존 달라질 수 있습니다. 다른 균주 추가 최적화를 요구할 수있다 -이 프로토콜은 927 SMOX procyclic 양식을 사용하여 최적화 하였다. 성공 확률을 증가시킬 조치 포함, PCR 증폭 물 양을 증가 형질 감염에 포함되는 세포의 수를 증가시킨다. 우리는 단백질의 수백 병렬로 태그 할 수있는 방법을 제시한다. 이는 기존의 대규모 데이터 세트를 보완하고 지역 사회에 귀중한 정보를 제공, 현지화 및 상호 작용에 대규모 연구를 촉진 할 것이다. 프라이머 템플릿 요청 및 플라스미드 템플릿 목록에 따라 사용할 수 있습니다에서 사용할 수 http://www.sdeanresearch.com/

트리파노소마 (Trypanosoma) brucei는 가축에서 인간의 아프리카 trypanosomasis 및 nagana을 일으키는 원생 동물 기생충이다. T. brucei 인해 고품질 게놈 수많은 프로테오믹스 및 transcriptomics 데이터 세트와 잘 개발 툴 1-3 분자의 결합으로 단백질 기능 분석을위한 이상적인 유기체이다. 단백질 체학 및 시퀀싱의 발전은 잠재적으로 흥미있는 유전자 4-6 강조 대규모 데이터 세트 이어질; 그러나, 많은 유전자는 기존의 데이터베이스와 연관된 최소한의 정보를 가지고있다. 단백질의 기능적 특성을 돕기 위해 고 처리량 방법이 요구된다. 태그가 단백질의 발현은 단백질의 기능에 대한 통찰력의 다양성을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 단백질 또는 에피토프 태그 단백질은 PROT에 대한 정보를 제공 형광 현미경에 의해 국부적 수EIN은 생물학적 효과를 발휘 될 수 있습니다. 대안 적으로, TAP 7 태그 단백질은 HaloTag 8 또는 그의 태그 생화학 분석법과의 상호 작용 파트너의 식별을 위해 정제 될 수있다. 우리는 최근 T.에 대한 강력한 태그 방법론을 개발 brucei 9. 이 형질의 DNA를 생성하기 위해 긴 프라이머 PCR을 사용하여 병렬 단백질의 수십개의 태그 허용 - 기존 프로토콜에 대한 주요 개선. 우리는 지금 크기의 순서에 의해 procyclic 형태의이 프로토콜의 확장 성을 개선했다. 여기서, 우리는 24 웰 플레이트에서 발생 회수 및 선택과 함께 96 웰 플레이트에 PCR 및 형질 전환을 수행하는 우리의 방법을 제시한다. 단백질 수백 이제 병렬로 태그 될 수있는 바와 같이,이 방법은 전체 게놈 트리파노소마 태그를위한 비용 효율적이고 실현 가능한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>Life 기술</td><td>na</td><td>desalt 전용(추가 정제를 사용하지 않음)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Expand HiFi 팩에 포함</td> 평판이 좋은 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>PCR 등급<td>dNTP</td></tr>여야 합니다. <tr><td>Expand HiFi 중합효소</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 플레이트 핸들러</td><td>하버드 장치</td><td>HT-200</td><td>96 웰 eletroplates 처리</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4mm</td><td>하버드 장치</td><td>45-0452</td><td>96 웰 electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225cm TC 플라스크, 경사 넥, 페놀 캡</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 배양 플레이트</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; PCR 쿨러, 96웰 플레이트 및 PCR 튜브용 얼음 없는 냉장 보관 시스템</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&reg; 옆 치마를 가진 PCR 판</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (trypanosoma) brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

질량분석법, 염기서열분석법, 생물정보학의 발전으로 잠재적으로 흥미로운 유전자에 대한 대규모 데이터셋이 생성되었습니다. 이러한 단백질에 태그를 지정하면 세포 내 단백질의 위치를 파악하고 상호 작용 파트너를 식별할 수 있으므로 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리는 최근 내인성 유전자 자리에서 태그가 지정된 단백질을 발현하는 Trypanosoma brucei 세포주를 생성하는 빠르고 확장 가능한 방법을 발표했습니다. 이 방법은 우리가 생성한 플라스미드를 기반으로 했으며, 이 플라스미드는 긴 프라이머 PCR과 결합할 때 유전자를 수정하여 양쪽 말단에 태그가 지정된 단백질을 암호화하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 통해 수십 개의 트리파노솜 단백질을 병렬로 태깅할 수 있어 관심 있는 후보 유전자의 대규모 검증을 용이하게 할 수 있습니다. 이 시스템은 국소화(형광 단백질, 항원결정기 태그 또는 전자 현미경 태그 사용) 또는 생화학(TAP(탠덤 친화성 정제) 태그와 같은 정제용 태그 사용)을 위해 단백질을 태그하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 24웰 플레이트에서 발생하는 형질전환 트리파노좀의 회수 및 선택과 함께 96-well 플레이트에서 긴 프라이머 PCR 및 전기천공을 수행하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 워크플로우를 사용하면 수백 개의 단백질을 병렬로 태깅할 수 있습니다. 이는 이전 프로토콜에 비해 크게 개선된 것이며 이제 게놈 규모 태깅이 가능합니다.

이 대표 형질에서, 프라이머는 TagIt 펄 스크립트 (9)를 사용하여 설계 및 상업적으로 합성 하였다. 96 웰 PCR 수행되고 설명 (도 1a)로 확인되었다; 이 예에서, 95/96의 PCR (그림 1B)에 성공했습니다. 우리의 경험에 의하면, 성공적인 PCR 발생하지 않습니다 원래 프라이머 또는 재 합성 프라이머와 하나 실패 반응을 반복. 앰플 리콘은 전기 (도 2A)에 대해 96- 웰 전기 판에 전사 한 후 회수 및 선택 24- 웰 배양 플레이트로 옮겼다. 선택이 발생할 수 있도록 충분한 시간 후, 우물은 추가 분석을하기 전에 생존을 득점했다. 이 예에서, 96분의 88 웰 (92 %)는 15 일 선택 후옵니다. <img의 고도 = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1 :. PCR의 유효성 검사를 위해 아가로 오스 겔 96 웰 PCR 플레이트에서 PCR 제품을 전송하기위한 긴 프라이머 PCR (A) 패턴의 확인. (나) N 말단에 95 유전자를 태그에 대한 대표 96 - 웰 PCR 검증 젤, 및 형질 전환에 부정적인 제어 역할을 할 5 &#39;대상 동성을 포함하지 않는 1 앰플 리콘. 샘플은 1 %에로드 (w / v)의 아가로 오스 겔 30 분 동안 100 V에서 해결됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> 도 2 : 96 웰 전기 및 선택 96- 웰 전기 천공 전기 천공 작은지면으로부터 세포를 전달하기위한 (A) 패턴.24- 웰 조직 배양 플레이트에 전자. (B) 개략적 인 24 웰 플레이트의 선택 15 일 후 일반적인 라이브 / 죽은 득점을 표시합니다. 녹색 회색은 죽은 세포로 잘이고, 성공적인 형질을 나타냅니다. 이 예에서, 우물 96분의 88 (92 %)을 성공적으로 형질 기생충이 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

단백질에 태그를 추가하는 것은 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻는 강력한 방법입니다. 여기에서는 게놈 규모 태깅이 가능하도록 수백 개의 Trypanosoma brucei 단백질을 병렬로 내인성으로 라벨링하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

이 방법의 전반적인 목표는 Trypansoma brucei의 단백질을 고효율 방식으로 태깅하는 것입니다. 이 방법은 단백질 대규모 집단의 위치 및 잠재적 기능에 관한 키네토플라스티드(kinetoplacid) 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수많은 단백질을 병렬적으로 빠르고 쉽게 태깅할 수 있다는 점입니다.이 방법은 세포 내 위치를 파악하는 데 유용한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 태그를 사용하여 대규모 단백질 집단의 상호작용을 조사할 수도 있습니다. 예를 들어, Bio-ID 근접 매핑 실험을 위한 BirA 태그가 있습니다. 본 실험 절차는 저희 연구실의 연구원인 Ross Madden이 시연하겠습니다.본 절차를 시작하기 전에 96-well PCR 쿨러를 -80 °C 냉동고에 미리 얼려둡니다. 10 mL 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 Master Mix A를 준비합니다: 증류 탈이온수 100 µL, PCR 등급 DMSO 105 µL, 10 mM dNTPs 105 µL, 그리고 pPOT 템플릿 105 µL.Master Mix A를 시약 리저버에 붓고 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 Master Mix A 23 µL씩 분주합니다. P20 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여, 분주된 각 웰에 100 µM pooled primers 2 µL를 첨가합니다. 플레이트를 필름으로 밀봉합니다.이를 미리 냉각시킨 PCR 쿨러 위에 놓고 -80°C에서 최소 20분 동안 동결시킵니다. 특정 핫 스타트 중합효소를 사용하는 경우라도, PCR Master Mix A를 동결시키는 것은 효율적인 핫 스타트 반응을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이를 통해 재현성 있고 수율이 높은 증폭이 가능해집니다.PCR 플레이트가 냉동고에 있는 동안 마스터 믹스 B를 준비합니다. 10 milliliter 튜브에 증류 탈이온수 2,048 microliters, 10X 버퍼 525 microliters, 폴리머라아제 52.5 microliters를 혼합하여 플레이트당 총 부피 2,626 microliters가 되게 합니다. -80 °C 냉동고에서 PCR 플레이트와 PCR 쿨러를 꺼냅니다.플레이트를 PCR 쿨러 위에 둔 상태에서, 각 웰의 냉동된 Master Mix A 위에 Master Mix B 25 µL를 빠르게 첨가하여 총 반응 부피를 50 µL로 맞춥니다. 이 과정은 시간에 매우 민감하므로 Master Mix A가 녹기 전에 완료해야 합니다. 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.열 순환기(thermal cycler)를 다음과 같이 설정합니다. 94 °C에서 10분간 처리한 후, 94 °C에서 15초, 65 °C에서 30초, 72 °C에서 2분간 처리하는 과정을 30회 반복하며, 마지막으로 72 °C에서 7분간 최종 신장(final extension) 단계를 거칩니다. 블록 온도가 94 °C에 도달하면 PCR 플레이트를 열 순환기에 넣고 증폭 프로그램을 시작합니다.Tris-acetate EDTA 또는 TAE 전기영동 완충액을 사용하여 웰이 4행으로 구성된 대형 1% agarose gel을 준비함으로써 이 절차를 시작하십시오. 각 행의 첫 번째와 28번째 웰에 1 kb DNA ladder를 로딩합니다. 다음 단계로, DNA 로딩 완충액 없이 PCR 산물 2 µL를 여기에 표시된 패턴에 따라 겔의 각 레인에 직접 옮깁니다.예를 들어, PCR 플레이트의 A행과 B행에서 얻은 PCR 생성물을 겔 첫 번째 행의 홀수 번호 레인과 짝수 번호 레인에 각각 로딩합니다. 증폭산물의 오염 가능성을 줄이기 위해 신속하게 작업하며, PCR 플레이트 A행의 PCR 생성물을 겔 첫 번째 행의 홀수 번호 레인에 로딩합니다. 그런 다음, PCR 플레이트 B행의 PCR 생성물을 겔 첫 번째 행의 짝수 번호 레인에 로딩합니다.동일한 패턴을 사용하여 PCR 플레이트의 C행과 D행에 있는 PCR 산물을 로딩합니다. C행은 겔의 두 번째 줄 중 홀수 번호 레인에, D행은 짝수 번호 레인에 로딩합니다. PCR 플레이트의 모든 웰이 겔에 로딩될 때까지 이 로딩 패턴을 반복합니다. 겔을 전기영동 탱크에 넣고 겔이 완전히 잠길 때까지 TAE running buffer를 채웁니다.100V에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다. UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 시각화합니다. 여기 제시된 것은 대표적인 96-웰 PCR 검증 아가로스 겔로, 96개의 PCR 중 95개가 성공적으로 수행되었습니다.실패한 PCR은 H11이었습니다. 이 절차에는 Trypansoma brucei, procyclic form, 세포주 SMOXP9가 사용됩니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 세포를 적절한 밀도까지 배양하고, 800 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 필요한 수의 세포를 수확하십시오.세포를 원심분리하는 동안 전기천공법 설정을 시작하십시오. 플레이트 핸들러를 전기천공기에 연결합니다. 전기천공기 본체에서 전압은 1,500 volts, 펄스 길이는 100 microseconds, 펄스 횟수는 12회, 펄스 간격은 500 milliseconds로 설정하십시오.플레이트 핸들러에서 펄스 횟수를 1회로 설정하십시오. P200 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트의 PCR 반응물을 96웰 일회용 전기천공 플레이트로 옮기십시오. 세포를 10 milliliters의 변형된 cytomix로 세척하고 800 ×g에서 10분 동안 다시 원심분리하십시오.세포를 23 mL의 변형된 cytomix에 재현탁하여 최종 농도가 5 × 10⁷ cells/mL가 되도록 합니다. 세포 현탁액을 시약 저장조로 옮깁니다. 전기천공 플레이트의 각 웰에 세포 용액 200 µL를 분주하고, 피펫팅을 통해 PCR 생성물과 혼합합니다.단락을 방지하기 위해 티슈를 사용하여 플레이트 상단의 물방울을 제거하십시오. 전기천공 플레이트 상단에 밀봉 필름을 부착하되, 각 열의 상단과 하단에 있는 전극용 구멍이 드러나도록 위치시킵니다. 필름 가이드용 돌출 부위가 덮이지 않도록 주의하십시오.전기천공 플레이트를 플레이트 핸들러에 넣고 덮개를 닫습니다. 전기천공 장치의 "pulse" 버튼을 누릅니다. 전기천공 후, 세포 회복을 위해 웰당 1 mL의 SDM-79 배지가 들어 있는 4개의 24-웰 조직 배양 플레이트로 세포를 신속하게 옮겨야 합니다.P200 12채널 멀티채널 피펫의 팁을 하나씩 건너뛰어 제거하여, 남은 6개의 팁이 24웰 조직 배양 플레이트의 6개 행과 일치하도록 합니다. 세포를 96웰 플레이트에서 24웰 플레이트로 옮긴 후, 24웰 플레이트의 해당 웰에 있는 배지를 사용하여 96웰 플레이트의 웰들을 세척합니다. 그런 다음, 세척액을 다시 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.전기천공된 세포를 96-well 전기천공 플레이트에서 여기에 표시된 미리 정의된 패턴에 따라 24-well 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 예를 들어, 96-well 플레이트 A열의 홀수 번호 well에 있는 세포는 플레이트 A의 A열로 옮기고, 96-well 플레이트 A열의 짝수 번호 well에 있는 세포는 플레이트 C의 A열로 옮깁니다. 96-well 플레이트에서 24-well 플레이트로 세포를 옮길 때마다, 96-well 플레이트의 well을 24-well 플레이트의 해당 행에 있는 배지로 세척합니다. 그런 다음, 세척액을 다시 24-well 플레이트로 옮깁니다.세포를 24-웰 플레이트로 옮기는 과정이 혼란스러울 수 있으나, 결과물인 세포주를 정확한 유전자 ID와 매칭하여 추적할 수 있어야 합니다. 세포의 건강 상태를 유지하기 위해 이 단계를 신속하게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 전기천공된 모든 세포를 4개의 24-웰 플레이트로 옮긴 후, 24-웰 플레이트를 밀폐 가능한 뚜껑이 있는 깨끗한 플라스틱 상자에 넣습니다. 이 상자를 28 °C 인큐베이터에 넣으십시오.6~8시간 후에, 선택적 항생제가 포함된 10% FCS 함유 SDM-79 1 mL를 각 웰에 첨가합니다. 형질전환 세포주가 보일 때까지 28°C에서 9~10일 동안 배양합니다. 96가지 서로 다른 단백질의 말단 터미너스 태깅을 위한 96-웰 트랜스펙션 후, 회복 및 선택을 위해 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.그 후 각 웰을 평가하여 건강한 약제 내성 세포가 포함되어 있는지 확인합니다. 건강한 웰은 위상차 현미경으로 보았을 때 밝게 보이는 활성도가 높은 세포들이 주로 포함되어 있습니다. 이 예시 도식에서 녹색은 트랜스펙션이 성공한 웰을 나타내며, 회색은 사멸한 세포만 있는 웰을 나타냅니다.선별 후 15일이 지나면 96개 웰 중 88개, 즉 92%의 웰에 형질전환이 성공한 기생충이 포함됩니다. 이 과정에 숙달되면 세포 계수부터 전기천공법 후 플레이팅까지 약 1시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때 형질전환 6~8시간 후에 선별 약물을 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후에는 Trypanosoma brucei에서 대규모 단백질 코호트를 태깅하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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