높은 처리량 유전자 태그에 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei

이 방법의 전반적인 목표는 고처리량 방식으로 Trypansoma brucei의 단백질을 태그하는 것입니다. 이 방법은 대규모 단백질 코호트의 국소화 및 잠재적 기능에 대한 kinetoplacid 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 단백질을 빠르고 쉽게 병렬로 태깅할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 국소화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 태그를 사용하여 대규모 단백질 코호트의 상호 작용을 조사할 수도 있습니다. 예를 들어, bio-ID 근접 매핑 실험을 위한 BirA 태그가 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교인 Ross Madden이 될 것입니다.

이 절차를 시작하기 전에 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 96웰 PCR 냉각기를 사전 동결하십시오. 10 밀리리터 튜브에 다음을 결합하여 마스터 믹스 A를 준비합니다. 2, 증류수 100마이크로리터, PCR 등급 DMSO 105마이크로리터, 105마이크로리터의 10밀리몰 dNTP 및 105마이크로리터의 pPOT 템플릿.

Master Mix A를 시약 저장소에 붓고 23마이크로리터의 Master Mix A를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분취합니다. P20 12채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 100마이크로몰 풀링 프라이머 2마이크로리터를 각 적재 웰에 추가합니다. 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.

미리 식힌 PCR 쿨러에 올려 놓고 섭씨 영하 20도에서 최소 80분 동안 얼립니다. PCR Master Mix A의 동결은 특정 핫스타트 중합효소를 사용하는 경우에도 효율적인 핫스타트 반응을 보장하는 데 중요합니다. 이는 재현 가능하고 높은 수율의 증폭으로 이어집니다.

PCR 플레이트가 냉동고에 있는 동안 10밀리리터 튜브에 다음을 결합하는 마스터 믹스 B를 준비합니다. 2, 048 마이크로 리터의 증류수 탈이온수, 525 마이크로 리터의 10X 버퍼 및 52.5 마이크로 리터의 중합 효소, 총 부피 2, 플레이트 당 626 마이크로 리터. 영하 80도의 냉동고에서 PCR 플레이트와 PCR 쿨러를 꺼냅니다.

플레이트를 PCR 냉각기에 그대로 둔 상태에서 각 웰의 냉동 Master Mix A 위에 25마이크로리터의 Master Mix B를 빠르게 추가하여 총 반응 부피를 50마이크로리터로 만듭니다. 이것은 시간이 중요하며 마스터 믹스 A가 해동되기 전에 완료해야 합니다. 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.

열 순환기를 다음과 같이 설정합니다. 섭씨 94도에서 10분, 94도에서 15초, 65도에서 30초, 72도에서 2분씩 30회 주기, 7분 동안 섭씨 72도의 최종 연장 주기가 이어집니다. 블록이 섭씨 94도에 도달한 후 열 순환기에 PCR 플레이트를 로드하고 증폭 프로그램을 시작합니다.

Tris-acetate EDTA 또는 TAE 러닝 버퍼에 4줄의 웰이 있는 대형 1% 아가로스 겔을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 1kb DNA ladder를 각 열의 첫 번째 및 28번째 well에 로드합니다. 다음 단계는 여기에 표시된 패턴에 따라 DNA 로딩 버퍼없이 2 마이크로 리터의 PCR 산물을 겔의 각 레인으로 직접 옮기는 것입니다.

예를 들어, PCR 플레이트의 A열 및 B열의 PCR 산물은 각각 겔의 첫 번째 열의 홀수 및 짝수 레인에 로드됩니다. 앰플리콘 오염 가능성을 줄이기 위해 신속하게 작업하여 PCR 플레이트의 A열에서 PCR 산물을 겔 첫 번째 열의 홀수 번호 레인으로 로드합니다. 그런 다음 PCR 플레이트의 B열에서 PCR 산물을 겔의 첫 번째 열의 짝수 번호 레인으로 로드합니다.

이와 동일한 패턴을 사용하여 PCR 플레이트의 C열 및 D열에서 PCR 산물을 로드하되, C행은 홀수 레인으로, D행은 겔 두 번째 열의 짝수 레인으로 로드합니다. PCR 플레이트의 각 웰이 겔에 로드될 때까지 이 로딩 패턴을 계속합니다. 겔을 러닝 탱크에 넣고 겔이 잠길 때까지 탱크에 TAE 러닝 버퍼를 채웁니다.

100볼트에서 30분 동안 실행합니다. UV 투과광기를 사용하여 시각화합니다. 여기에 표시된 것은 대표적인 96-well PCR validation agarose gel이며, 96개의 PCR 중 95개가 성공적이었습니다.

실패한 PCR은 H11이었습니다. 이 절차는 Trypansoma brucei, procyclic form, 세포주 SMOXP9를 사용합니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 적절한 밀도로 세포를 성장시키고 10분 동안 800배 G에서 원심분리를 통해 필요한 수의 세포를 수확합니다.

세포가 원심분리되는 동안 electroporation 설정을 시작합니다. 플레이트 핸들러를 electroporator에 연결합니다. electroporator 장치에서 전압을 1, 500볼트로, 펄스 길이를 100마이크로초로, 펄스 수를 12로, 펄스 간격을 500밀리초로 설정합니다.

플레이트 핸들러에서 펄스 수를 1로 설정합니다. P200 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트의 PCR 반응을 96웰 일회용 전기천공법 플레이트로 옮깁니다. 10ml의 변형된 사이토믹스로 세포를 세척하고 800배 G에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.

23 ml의 변형된 cytomix에 세포를 재현탁시켜 최종 농도를 10의 5배에서 1ml당 7번째 세포로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 시약 저장소로 옮깁니다. 200 마이크로리터의 셀 용액을 electroporation 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 피펫팅으로 PCR 산물과 혼합합니다.

합선을 방지하기 위해 티슈를 사용하여 플레이트 상단의 물방울을 제거하십시오. electroporation 판의 정상에 바다표범 어업 필름을 적용하고, 전극을 위한 구멍이 각 란의 정상 그리고 바닥에 덮지 않기 위하여 남겨두기 위하여 두십시오. 필름을 안내하는 데 사용되는 돌출된 부분을 덮지 마십시오.

electroporation 플레이트를 플레이트 핸들러에 넣고 뚜껑을 닫습니다. electroporator 장치에서 pulse"를 누릅니다. 전기천공법 후, 세포는 회수를 위해 웰당 1ml의 SDM-79 배지가 들어 있는 4개의 24웰 조직 배양 플레이트로 신속하게 이동해야 합니다.

다른 모든 팁이 누락된 P200 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여 나머지 6개의 팁이 24웰 조직 배양 플레이트의 6개 행과 정렬되도록 합니다. 세포가 96웰 플레이트에서 24웰 플레이트로 이동된 후, 24웰 플레이트에 있는 해당 웰의 매체로 96웰 플레이트의 웰을 세척합니다. 그런 다음 세척물을 24웰 플레이트의 웰로 다시 옮깁니다.

전기천공된 세포를 96웰 전기천공판에서 24웰 조직 배양 플레이트로 여기에 표시된 사전 정의된 패턴으로 옮깁니다. 예를 들어, 96-웰 플레이트의 행 A의 홀수 번호 웰로부터의 세포는 플레이트 A의 행 A로 전달되는 반면, 96-웰 플레이트로부터 행 A의 짝수 번호 웰로부터의 세포는 플레이트 C의 행 A로 전달되며, 96-웰 플레이트로부터 24-웰 플레이트로의 세포의 각 전달 후에, 96웰 플레이트의 웰을 24웰 플레이트의 해당 행에서 매체로 세척합니다. 그런 다음 세척제를 24웰 플레이트로 다시 옮깁니다.

세포를 24웰 플레이트로 옮기는 것은 혼란스러울 수 있지만, 세포를 건강하게 유지하기 위해 이 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요 ID.It 결과 세포주를 올바른 유전자로 추적할 수 있어야 합니다. 모든 전기천공된 셀을 4개의 24웰 플레이트로 옮긴 후 24웰 플레이트를 단단히 밀봉되는 뚜껑이 있는 깨끗한 플라스틱 상자에 넣습니다. 상자를 섭씨 28도의 인큐베이터에 넣습니다.

6-8시간 후, 선택적 항생제가 함유된 10%FCS가 함유된 SDM-79 1mL를 각 웰에 첨가합니다. 형질전환 세포주가 보일 때까지 섭씨 28도에서 9-10일 동안 배양합니다. 말단 말단에서 96개의 서로 다른 단백질을 라벨링하기 위한 96-well transfection 후, 세포는 회수 및 선택을 위해 24-well 조직 배양 플레이트로 옮겨집니다.

그런 다음 각 웰을 평가하여 건강한 약물 내성 세포가 포함되어 있는지 확인합니다. 건강한 우물에는 주로 활성이 높은 세포가 포함되어 있으며, 이는 위상차 현미경 검사에서 밝습니다. 이 예시 회로도에서 녹색은 transfection이 성공한 well을 나타내고 회색은 dead cells만 있는 well을 나타냅니다.

96개 웰 중 88개 웰 또는 92%는 선택 15일 후에 성공적으로 transfection된 기생충을 함유하고 있습니다. 마스터하면 세포 계산에서 전기천공 후 도금까지 약 한 시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안, transfection 후 6-8시간 후에 선택적 약물을 추가해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Trypansoma brucei에서 대규모 단백질 코호트를 태그하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.