높은 처리량 유전자 태그에

이 방법의 전반적인 목표는 Trypansoma brucei의 단백질을 고효율 방식으로 태깅하는 것입니다. 이 방법은 단백질 대규모 집단의 위치 및 잠재적 기능에 관한 키네토플라스티드(kinetoplacid) 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수많은 단백질을 병렬적으로 빠르고 쉽게 태깅할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 세포 내 위치를 파악하는 데 유용한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 태그를 사용하여 대규모 단백질 집단의 상호작용을 조사할 수도 있습니다. 예를 들어, Bio-ID 근접 매핑 실험을 위한 BirA 태그가 있습니다. 본 실험 절차는 저희 연구실의 연구원인 Ross Madden이 시연하겠습니다.

본 절차를 시작하기 전에 96-well PCR 쿨러를 -80 °C 냉동고에 미리 얼려둡니다. 10 mL 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 Master Mix A를 준비합니다: 증류 탈이온수 100 µL, PCR 등급 DMSO 105 µL, 10 mM dNTPs 105 µL, 그리고 pPOT 템플릿 105 µL.

Master Mix A를 시약 리저버에 붓고 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 Master Mix A 23 µL씩 분주합니다. P20 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여, 분주된 각 웰에 100 µM pooled primers 2 µL를 첨가합니다. 플레이트를 필름으로 밀봉합니다.

이를 미리 냉각시킨 PCR 쿨러 위에 놓고 -80°C에서 최소 20분 동안 동결시킵니다. 특정 핫 스타트 중합효소를 사용하는 경우라도, PCR Master Mix A를 동결시키는 것은 효율적인 핫 스타트 반응을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이를 통해 재현성 있고 수율이 높은 증폭이 가능해집니다.

PCR 플레이트가 냉동고에 있는 동안 마스터 믹스 B를 준비합니다. 10 milliliter 튜브에 증류 탈이온수 2,048 microliters, 10X 버퍼 525 microliters, 폴리머라아제 52.5 microliters를 혼합하여 플레이트당 총 부피 2,626 microliters가 되게 합니다. -80 °C 냉동고에서 PCR 플레이트와 PCR 쿨러를 꺼냅니다.

플레이트를 PCR 쿨러 위에 둔 상태에서, 각 웰의 냉동된 Master Mix A 위에 Master Mix B 25 µL를 빠르게 첨가하여 총 반응 부피를 50 µL로 맞춥니다. 이 과정은 시간에 매우 민감하므로 Master Mix A가 녹기 전에 완료해야 합니다. 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.

열 순환기(thermal cycler)를 다음과 같이 설정합니다. 94 °C에서 10분간 처리한 후, 94 °C에서 15초, 65 °C에서 30초, 72 °C에서 2분간 처리하는 과정을 30회 반복하며, 마지막으로 72 °C에서 7분간 최종 신장(final extension) 단계를 거칩니다. 블록 온도가 94 °C에 도달하면 PCR 플레이트를 열 순환기에 넣고 증폭 프로그램을 시작합니다.

Tris-acetate EDTA 또는 TAE 전기영동 완충액을 사용하여 웰이 4행으로 구성된 대형 1% agarose gel을 준비함으로써 이 절차를 시작하십시오. 각 행의 첫 번째와 28번째 웰에 1 kb DNA ladder를 로딩합니다. 다음 단계로, DNA 로딩 완충액 없이 PCR 산물 2 µL를 여기에 표시된 패턴에 따라 겔의 각 레인에 직접 옮깁니다.

예를 들어, PCR 플레이트의 A행과 B행에서 얻은 PCR 생성물을 겔 첫 번째 행의 홀수 번호 레인과 짝수 번호 레인에 각각 로딩합니다. 증폭산물의 오염 가능성을 줄이기 위해 신속하게 작업하며, PCR 플레이트 A행의 PCR 생성물을 겔 첫 번째 행의 홀수 번호 레인에 로딩합니다. 그런 다음, PCR 플레이트 B행의 PCR 생성물을 겔 첫 번째 행의 짝수 번호 레인에 로딩합니다.

동일한 패턴을 사용하여 PCR 플레이트의 C행과 D행에 있는 PCR 산물을 로딩합니다. C행은 겔의 두 번째 줄 중 홀수 번호 레인에, D행은 짝수 번호 레인에 로딩합니다. PCR 플레이트의 모든 웰이 겔에 로딩될 때까지 이 로딩 패턴을 반복합니다. 겔을 전기영동 탱크에 넣고 겔이 완전히 잠길 때까지 TAE running buffer를 채웁니다.

100V에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다. UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 시각화합니다. 여기 제시된 것은 대표적인 96-웰 PCR 검증 아가로스 겔로, 96개의 PCR 중 95개가 성공적으로 수행되었습니다.

실패한 PCR은 H11이었습니다. 이 절차에는 Trypansoma brucei, procyclic form, 세포주 SMOXP9가 사용됩니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 세포를 적절한 밀도까지 배양하고, 800 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 필요한 수의 세포를 수확하십시오.

세포를 원심분리하는 동안 전기천공법 설정을 시작하십시오. 플레이트 핸들러를 전기천공기에 연결합니다. 전기천공기 본체에서 전압은 1,500 volts, 펄스 길이는 100 microseconds, 펄스 횟수는 12회, 펄스 간격은 500 milliseconds로 설정하십시오.

플레이트 핸들러에서 펄스 횟수를 1회로 설정하십시오. P200 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트의 PCR 반응물을 96웰 일회용 전기천공 플레이트로 옮기십시오. 세포를 10 milliliters의 변형된 cytomix로 세척하고 800 ×g에서 10분 동안 다시 원심분리하십시오.

세포를 23 mL의 변형된 cytomix에 재현탁하여 최종 농도가 5 × 10⁷ cells/mL가 되도록 합니다. 세포 현탁액을 시약 저장조로 옮깁니다. 전기천공 플레이트의 각 웰에 세포 용액 200 µL를 분주하고, 피펫팅을 통해 PCR 생성물과 혼합합니다.

단락을 방지하기 위해 티슈를 사용하여 플레이트 상단의 물방울을 제거하십시오. 전기천공 플레이트 상단에 밀봉 필름을 부착하되, 각 열의 상단과 하단에 있는 전극용 구멍이 드러나도록 위치시킵니다. 필름 가이드용 돌출 부위가 덮이지 않도록 주의하십시오.

전기천공 플레이트를 플레이트 핸들러에 넣고 덮개를 닫습니다. 전기천공 장치의 "pulse" 버튼을 누릅니다. 전기천공 후, 세포 회복을 위해 웰당 1 mL의 SDM-79 배지가 들어 있는 4개의 24-웰 조직 배양 플레이트로 세포를 신속하게 옮겨야 합니다.

P200 12채널 멀티채널 피펫의 팁을 하나씩 건너뛰어 제거하여, 남은 6개의 팁이 24웰 조직 배양 플레이트의 6개 행과 일치하도록 합니다. 세포를 96웰 플레이트에서 24웰 플레이트로 옮긴 후, 24웰 플레이트의 해당 웰에 있는 배지를 사용하여 96웰 플레이트의 웰들을 세척합니다. 그런 다음, 세척액을 다시 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.

전기천공된 세포를 96-well 전기천공 플레이트에서 여기에 표시된 미리 정의된 패턴에 따라 24-well 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 예를 들어, 96-well 플레이트 A열의 홀수 번호 well에 있는 세포는 플레이트 A의 A열로 옮기고, 96-well 플레이트 A열의 짝수 번호 well에 있는 세포는 플레이트 C의 A열로 옮깁니다. 96-well 플레이트에서 24-well 플레이트로 세포를 옮길 때마다, 96-well 플레이트의 well을 24-well 플레이트의 해당 행에 있는 배지로 세척합니다. 그런 다음, 세척액을 다시 24-well 플레이트로 옮깁니다.

세포를 24-웰 플레이트로 옮기는 과정이 혼란스러울 수 있으나, 결과물인 세포주를 정확한 유전자 ID와 매칭하여 추적할 수 있어야 합니다. 세포의 건강 상태를 유지하기 위해 이 단계를 신속하게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 전기천공된 모든 세포를 4개의 24-웰 플레이트로 옮긴 후, 24-웰 플레이트를 밀폐 가능한 뚜껑이 있는 깨끗한 플라스틱 상자에 넣습니다. 이 상자를 28 °C 인큐베이터에 넣으십시오.

6~8시간 후에, 선택적 항생제가 포함된 10% FCS 함유 SDM-79 1 mL를 각 웰에 첨가합니다. 형질전환 세포주가 보일 때까지 28°C에서 9~10일 동안 배양합니다. 96가지 서로 다른 단백질의 말단 터미너스 태깅을 위한 96-웰 트랜스펙션 후, 회복 및 선택을 위해 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.

그 후 각 웰을 평가하여 건강한 약제 내성 세포가 포함되어 있는지 확인합니다. 건강한 웰은 위상차 현미경으로 보았을 때 밝게 보이는 활성도가 높은 세포들이 주로 포함되어 있습니다. 이 예시 도식에서 녹색은 트랜스펙션이 성공한 웰을 나타내며, 회색은 사멸한 세포만 있는 웰을 나타냅니다.

선별 후 15일이 지나면 96개 웰 중 88개, 즉 92%의 웰에 형질전환이 성공한 기생충이 포함됩니다. 이 과정에 숙달되면 세포 계수부터 전기천공법 후 플레이팅까지 약 1시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때 형질전환 6~8시간 후에 선별 약물을 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 Trypanosoma brucei에서 대규모 단백질 코호트를 태깅하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.