에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장 온 어 칩(gut-on-a-chip) 미세유체 장치에서 연동 운동과 같은 움직임 및 흐름에 따른 인간 장 세포의 융모 성장을 입증하고 이러한 세포를 살아있는 장내 마이크로바이옴과 공동 배양하는 방법을 보여주는 것입니다. 따라서 이 방법은 위장병학, 임상 미생물학 및 제약 과학 분야의 핵심 질문을 통해 질병 메커니즘을 식별하고 신약 화합물의 효능과 독성을 검증하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구원들이 미생물 생리학 시스템을 사용하여 체외에서 인간 생체 장의 실행 가능하고 기능적인 포스트 마이크로바이옴 생태계를 구축할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 궤양성 대장염이나 크론병과 같은 질병으로 확장될 수 있는데, 숙주 세포와 마이크로바이옴의 안정적인 공동 배양이 이러한 질병의 복잡성을 모방할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 장내 마이크로바이옴과 장내 면역 체계 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 피부, 생식기 또는 구강과 같이 숙주 미생물 상호 작용이 있는 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 gut-on-a-chip 미세유체 장치를 준비합니다.

이 장치는 유연한 다공성 PDMS 멤브레인으로 분리된 두 개의 병렬 마이크로 채널을 포함하는 투명한 가스 투과성 실리콘 폴리머로 구성됩니다. 채널의 각 측면에는 진공 챔버가 있으며, 이는 주기적인 기계적 변형을 적용하는 데 사용할 수 있습니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 채널을 통해 70% 에탄올이 흐르도록 장치를 살균합니다.

그런 다음 섭씨 60도의 건조 오븐에서 밤새 장치를 건조시킵니다. 다음 날, gut-on-a-chip 마이크로시스템과 연결된 튜브를 40분 동안 자외선과 오존에 동시에 노출시킵니다. 생물 안전 캐비닛의 자외선 아래에서 15분 동안 장치를 식히십시오.

다음으로, 100마이크로리터의 세포외 매트릭스 코딩 용액을 1밀리리터 주사기에 넣고 장치의 상단 마이크로채널에 분배합니다. 이 과정을 반복하여 하부 마이크로 채널도 코팅합니다. 전체 설정을 섭씨 37도 가습 5%CO2 인큐베이터에 1시간 동안 배치합니다.

배양 중에 50ml 여과 시스템의 0.45미크론 필터를 1분 동안 통과시켜 가스를 제거함으로써 완전한 배양 배지를 예열했습니다. 여과된 매체를 1분 동안 부드럽게 두드려 매체의 기포나 용해된 가스를 제거합니다. 그런 다음 가스가 제거된 완전한 매체를 3밀리리터 일회용 주사기 2개에 넣고 주사기를 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 주사기를 gut-on-a-chip의 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결하고 부드러운 펄스로 상부 및 하부 마이크로 채널로 완전한 매체를 흐르게 하여 코딩 용액을 씻어냅니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 가스가 제거된 완전한 세포 배양 배지를 장치의 상부 마이크로채널로 흐르게 하는 동시에 섭씨 37도 및 5%CO2에서 밤새 칩을 배양합니다.먼저 10ml의 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 헹구어 Caco-2 장 상피 세포가 완전히 결합된 T75 플라스크를 수확합니다.

그런 다음 PBS를 흡인하고 헹굼을 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 0.05% 트립신-EDTA 용액 1ml를 넣고 플라스크를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 분리되면 예열된 전체 세포 배양 배지 10ml를 추가하고 세포 현탁액을 3-5회 피펫팅한 후 원심분리 튜브로 옮깁니다.

세포 현탁액을 스핀다운합니다. 다음, 상등액을 제거하고, 150, 전 데워진 완전한 매체에서 제곱된 센티미터 당 000의 세포에 세포를 다시 중단하십시오. 500 게이지, 25/8 인치 바늘이 장착 된 1 밀리리터 일회용 주사기에 500 마이크로 리터의 셀 현탁액을 끌어 당깁니다.

그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 배출구 튜브를 통해 상부 마이크로채널로 분배합니다. 다음으로, 바인더 클립을 사용하여 상단 및 하단 마이크로 채널에 연결된 모든 입구와 출구를 고정합니다. 장 상피 세포가 다공성 막의 표면에 부착될 수 있도록 전체 설정을 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 클램프를 제거하고 상부 채널 튜브를 주사기 펌프에 놓인 배양 배지로 채워진 주사기에 연결합니다. 세포가 손상되지 않은 단층에서 나올 때까지 시간당 30마이크로리터로 배양 배지의 상부 마이크로채널로의 흐름을 재개합니다. 세포가 단층을 형성하면 하부 채널을 두 번째 주사기에 연결하고 배양 배지를 시간당 30마이크로리터의 동일한 유속으로 상부 내강과 하부 모세관 미세채널 모두에 관류합니다.

칩에서 연동 운동과 같은 움직임을 생성하려면 먼저 진공 펌프를 켜십시오. 스테인리스 스틸 커넥터가 있는 튜브를 통해 장치의 진공 챔버를 진공 컨트롤러에 연결합니다. 그런 다음 0.15Hz의 빈도로 평균 세포 변형률의 10%인 순환 부호 스트레칭 동작을 제공하도록 컨트롤러를 설정한 다음 시작을 클릭합니다.

융모 성장을 유도하기 위해 최소 80시간 동안 기계적 변형이 있는 상태에서 상부 및 하부 미세채널 모두에 유동 배양 배지를 유지하십시오. 오토클레이브 락토바실러스 MRS 육수와 강화 클로스트리듐 배지의 50/50 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 동결 건조된 프로바이오틱 박테리아 혼합물을 혼합물 10ml에 다시 현탁시킵니다.

600나노미터에서 혼합물의 광학 밀도를 측정하고 최종 셀 밀도를 약 0.2 광학 밀도 단위로 조정합니다. 조정된 미생물 세포 현탁액 3ml를 일회용 10ml 멸균 튜브에 분취합니다. 부분 표본을 혐기성 용기에 넣고 혐기성 가스 발생 봉지 2팩을 용기에 추가합니다.

용기 뚜껑을 단단히 닫고 인큐베이터에서 밤새 흔들지 않고 용기 설정을 배양합니다. 다음으로, 가스가 제거된 무항생제 세포 배양 배지를 준비하고 3mL 일회용 주사기에 넣습니다. 마이크로 엔지니어링 융모가 포함된 gut-on-a-chip 장치를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.

장치의 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결된 주사기를 제거하고 탈기된 무항생제 세포 배양 배지가 들어 있는 주사기로 교체합니다. 완료되면 장치를 CO2 인큐베이터에 다시 놓습니다. 그런 다음 마이크로바이옴을 장착하기 전에 12시간 동안 무항생제 배양 배지를 장치에 흘려보냅니다.

다음으로, 사전 배양된 프로바이오틱 박테리아 세포 혼합물을 스핀다운합니다. 상층액을 흡인한 다음 항생제가 없는 DMEM에 박테리아를 다시 현탁시킵니다. 이 셀 현탁액 약 100마이크로리터를 25게이지, 5/8인치 바늘에 부착된 1밀리리터 주사기에 로드합니다.

이전에 세균이 없었던 장 융모를 포함하는 미세채널의 내강 쪽에 박테리아를 주입합니다. 튜브를 고정하여 미생물 세포가 장 융모의 정점 표면에 1시간 30분 동안 흐름 없이 부착되도록 합니다. 그런 다음 사전 예열된 무항생제 배양 배지를 주기적인 리듬 변형으로 시간당 40마이크로리터의 상부 및 하부 미세채널 모두에 관류합니다.

이 공동 배양 프로토콜은 융모 간 공간에서 여러 종의 프로바이오틱 박테리아의 안정적인 군락을 가능하게 합니다. 생존 가능한 박테리아 마이크로 콜로니는 공동 배양에서 최대 2주 동안 유지될 수 있습니다. 여기에서 보이는 것은 GFP에 의하여 표한 대장균과 장 융모 둘 다로 이루어져 있는 다른 co-cultic입니다.

고출력 배율은 72시간 시점에서 박테리아 마이크로 콜로니의 위치를 명확하게 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 배양 초기 단계에서 상피 세포 단층이 손상되지 않도록 배양 배지를 미세유체 채널에 부드럽고 천천히 주입하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법을 기반으로 인간 면역 세포와의 공동 배양 방법은 마이크로바이옴이 면역 체계와 어떻게 상호 작용할 수 있는지, 그리고 최적의 장 건강을 위한 항상성에 영향을 미치는지에 대한 단서를 제공할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 장의 미시 환경을 재구성하는 방법과 미생물 군집과 인간 장 융모 간의 공동 배양을 in vitro에서 입증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 박테리아 및 인간 세포로 작업하는 것은 매우 위험하므로 생물 안전 캐비닛 내부에서 작업하는 것을 잊지 마십시오.