Name: 에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 배우세요 인간 장내 융모와 생활 마이크로바이옴의 공동 배양 방법을 미세유체 장치를 이용하여. 이 기술은 위장병 및 신약 개발 연구에 활용될 수 있습니다.

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GFP 표지된 대장균 균주를 제공해 주신 Sri Kosuri(하버드 대학교 Wyss Institute)에게 감사드립니다. 이 작업은 협력 계약 번호 W911NF-12-2-0036에 따라 국방고등연구계획국(Defense Advanced Research Projects Agency), 계약 #HHSF223201310079C에 따른 식품의약국(Food and Drug Administration), 하버드 대학의 Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering의 지원을 받았습니다. 이 문서에 포함된 견해와 결론은 저자의 견해이며 육군 연구소, 육군 연구소, 식품의약국 또는 미국 정부의 명시적이든 묵시적이든 공식 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 미국 정부는 본 문서에 저작권이 명시되어 있음에도 불구하고 정부 목적을 위해 재인쇄물을 복제하고 배포할 수 있는 권한이 있습니다.

창자 - 온 - 어 - 칩 장치 1. 마이크로 주 : 창자 - 온 - 칩은 플렉시블 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미소 유로 (1mm 폭 × 150 μm의 높이 X 1cm 길이)를 포함하는 투명 가스 투과성 실리콘 중합체 (폴리 디메틸 실록산, PDMS)로 이루어지는 미세 유체 소자이며 기공 (세공 직경 10 ㎛의 간격, 공극 25 μm의 세공을 위해) 막을 PDMS 5,9. 제공되는 단계에 따라 창자 - 온 - 어 - 칩 (왼쪽 그림 1A)를 제작. <ol><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 5,9의 미세 절차. <ol><li> PDMS의 예비 중합체와 경화제를 혼합하여 경화되지 탈기 PDMS 준비 (15 w / w 1), 30 분 동안 진공 건조기에 배치. </li><li> 30g 각각 SU-8 위의 기반 미세 패턴과 장 - 온 - 어 - 칩의 낮은 마이크로있는 각 실리콘 몰드 상에 미 경화, 탈기 PDMS의 3g을 따르십시오. 이어서 L에 대한 건조 오븐에서 60 ℃에서 경화동쪽 4 시간. </li><li> 수술 용 메스를 이용하여 주변 에지 절단에 의해 각 실리콘 주형으로부터 상하부 PDMS 층 탈형. 조직 검사 구멍을 뚫는 (구멍 직경 2.0 mm)를 사용하여 6 홀 (두 개의 입구, 두 개의 출구, 2 개의 진공 챔버)를 펀치. </li><li> w 1 : 평면과 중첩 원형 기둥 (직경 10 μm의 높이가 25 μm의) 포스트 어레이를 포함하는 실란 화 된 실리콘 웨이퍼 상에 경화되지 않은 탈기 PDMS의 10g을 주입하여 다공성 막을 제조, PDMS 지지층 (15 실란 화 / w; 1cm 두께). 설정에 3kg 중량 누름을 넣고 12 시간 이상 60 ℃에서 폴리머를 경화. </li><li> 신중 웨이퍼로부터 슬래브의 모서리를 들어 올려, 다공질 PDMS 막을 완전히 웨이퍼로부터 분리 될 때까지 박리하여 실리콘 웨이퍼의 PDMS지지 슬래브에 부착 다공성 PDMS 막의 설정 탈형. </li><li> 는 PL 및 공막 측 : 상위 계층의 채널 사이드 (1, w / w PDMS 15) 폭로ASMA은 각각 1 분, 3 초를위한 휴대용 코로나 treater에 의해 생성. </li><li> 기포없이 병렬로 각 조각을 배치하여 등각 접촉 다공질 PDMS 막의 상부 미세 층의 플라즈마 처리 한 표면에 놓는다. </li><li> 두 PDMS 층의 비가 역적 결합 80 ° CO / N에서 전체 설치를 품어. </li><li> 주의 지지층의 모서리를 들어 올려, 상기 지지층을 완전히 막과 상층으로부터 분리 될 때까지 박리하여 다공성 막과 상층의 어셈블리에서 PDMS 지지층 벗겨. </li><li> 중공 진공 챔버를 만들기 위해 미세한 팁 핀셋을 이용하여 진공 챔버 (메인 채널의 양쪽에 위치하는 두 챔버) 위에 위치하고이 멤브레인의 일부를 절취. </li><li> 내가 설명 된대로 상단 부분과 같은 방법으로 플라즈마에 낮은 조각에 새겨진 채널 측면에 부착 된 막으로면을 노출n은 1 분간 1.1.6 단계. </li><li> 입체경 하에서 기포없이 병렬로 각 조각을 배치함으로써 균일 한 접촉 다공성 멤브레인 미세 상부 층과 하부 층을 맞추고. </li><li> 미세 유체 채널 셀에 다음의 두 중공 진공 챔버를 포함하는 완전한 규모 창자 - 온 - 칩 마이크로 유체 소자를 제작하기 위해 80 ° CO / N에서 건조 오븐에서 온 설정을 치료. </li></ol></li><li> 90 ° 굴곡 스테인레스 스틸 무딘 엔드 바늘을 통해 장 - 온 - 어 - 칩의 상부 또는 하부 마이크로 채널에 연결된 각 포트의 입구와 출구에 튜브를 연결합니다. </li><li> 90 ° 절곡 스테인리스 평활 말단 바늘을 이용하여 상기 진공 챔버에 연결되는 구멍에 튜브를 연결한다. </li><li> 일회용 주사기를 소독 1 ml에 사용 70 % (v / v)의 에탄올을 흐르는하여 마이크로 및 튜브를 소독. </li><li> 60 ° C 건조 오븐 O / N에서 마이크로 및 튜브를 건조. </li></ol> 마이크로 엔진 2. 성장창자 - 온 - 어 - 칩 장치에 겹 장내 융모 <ol><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 5,9에 씨앗 장내 상피 세포 (예 : 카코 2BBE). <ol><li> 70 %와 60 ℃ 건조 오븐 O에서 건조시켜 1 ㎖의 멸균 일회용 주사기를 사용하는 (V / V) 에탄올 (단계 1.4 참조) 장치를 소독 / N은 ​​표면 활성화하기 전에 (단계 150 참조). </li><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 전체 설정을 노출 (즉,의 몸 장 - 온 - 어 - 칩 튜브에 연결) 동시에 40 분 동안 자외선 (253.7 ㎚) 및 오존. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에 UV 빛 아래 15 분 동안 실온에서 장치를 냉각. </li><li> 일회용을 사용하여 두 상하 미세로 - I 콜라겐를 50㎍ / ㎖의 유형 및 혈청이없는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 희석하고 300 μg의 / ml의 세포 외 기질 혼합물의 혼합 용액 - 전자 재료 피막의 100 μl를 소개 멸균 1 ML의 주사기. </li><li> Incuba37 ° C에서 전체 셋업 테 1 시간 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습. </li><li> 드가 예열 ​​된 (37 ℃)에서 완전 배양 배지 (DMEM, 20 % V / V, 소 태아 혈청 (FBS), 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 50 ㎖, 3 ㎖의 분취 1 분 동안 BSC 50 ㎖의 여과 시스템 (기공 크기 0.45 μm의)을 이용하여 일회용 주사기). <ol><li> 여과 시스템을 통해 사전 예열 매체에 합격 한 분은 중간에있는 거품 또는 용해 가스를 제거하기위한 여과 매체에 부드럽게 누릅니다. </li></ol></li><li> 37 ° C에서 3 ㎖ 일회용 주사기에 탈기 완전한 매체의 나누어지는을 놓고 품어 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기를 가습. </li><li> 상부 및 하부 마이크로에,이 3 ㎖ 일회용 주사기가 탈기 함유 미리 예열 전체 문화 매체를 연결합니다. </li><li> 체적에서 주사기 펌프를 사용하여 상부에 마이크로 탈기 전체 세포 배양 배지 흐름37 ° C에서 (0.02 다인 / ㎠의 전단 응력에 상당) 30 μL / hr의 유량은 O / N, 5 % CO 2 인큐베이터 가습. </li></ol></li><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 Microengineered 카코 2 융모의 형성. <ol><li> 50과 65 사이의 통로 번호 카코 2BBE 세포를 사용합니다. </li><li> 37 ° C에서 완전 배양 배지를 함유하는 T75 플라스크에 카코 -2 세포 성장이 완전히 융합 세포를 수득 4-5 일 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습. </li><li> 완전히 T75 플라스크에 성장 합류 카코 2 셀, 다음, 세포를 씻어 PBS를 대기음하는 PBS - 무료 2 + 칼슘과 마그네슘의 10 ML을 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 37 ° C에서 0.05 % 트립신 / EDTA 용액 1 ㎖를 추가하고 품어 5 분 동안 5 % CO 2 배양기를 가습. </li><li> 로 pipetting 의해 3~5 배 하 (FBS)와 예열 된 전체 세포 배양 배지 10 mL로 해리 된 세포를 재현 탁. </li><li> C로 세포 현탁액을 스핀5 분 500 XG에 entrifugation 후 상등액을 제거합니다. </li><li> 다시 1 ml의 장치에서 ~ 1.5 × 10 5 세포 / cm 2의 세포 밀도를 조정하는 완전 배지를 미리 예열을 Resuspend. 세포 밀도를 추정 혈구를 사용한다. </li><li> 상부에 연결된 마이크로 튜브의 출구에 25 G5 / 8 바늘에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 위치시킴으로써 상부 마이크로 (내강 측)에 재현 탁하고, 카코 -2 세포 100 μl를 주입. </li><li> 바인더 클립을 사용하여 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결된 모든 입구와 튜브의 출구를 조인다. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C, 가습 5 % CO 2 배양기에서 전체 설치를 품어 다공성 막 표면에 부착 카코 2 세포를 해리 허용합니다. </li><li> 클램프를 제거하고 세포를 24-36 시간 동안 온전한 단일 층을 형성 할 때까지 주사기 펌프를 사용하여 30 μL / 시간 상부 마이크로에 배양액의 흐름을 재개. 위상 콘트라을 사용하여t 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경은 세포 단층의 세포 - 세포 접합을 확인합니다. </li><li> 세포 단일 층을 형성 할 때, 30 μL / hr의 동일한 유량의 두 상부 (루멘)로 배지 낮은 모세관을 미세 관류. </li><li> 연동 운동과 같은 운동 5,9을 흉내 낸 기계적인 변형의 응용 프로그램입니다. <ol><li> 인장 장비를 갖춘 진공 펌프를 켭니다. </li><li> 스테인레스 스틸 튜브 커넥터를 통해 진공 컨트롤러에 진공 챔버를 연결한다. </li><li> 진공 제어 소프트웨어에 대한주기적인 사인 함수 모드 0.15 Hz의 주파수에서 10 %의 평균 세포주의 스트레칭 운동을 설정 한 다음 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> ~ 100 시간 동안 기계적 변형 하에서 합류 카코 -2 단층을 모두 상단 및 하단의 마이크로 배양액의 일정한 흐름 (30 μL / 시간) (10 %, 0.15 Hz로)를 유지한다. 참고 : 카코 2 세포가 spontaneously 상피 마이크로 5,8-10의 루멘으로 확장 파상 3D 돌기 융모 형태 형성을 겪는다. </li></ol></li><li> , 창자 - 온 - 어 - 칩 (10)의 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 살아있는 인간의 소장의 기관 수준의 기능을 모방 한 바와 같이 단계를 수행하십시오. <ol><li> 2.1에서 2.2 단계를 반복하여 microengineered 카코 2 융모 성장. </li><li> 미리 예열 공동 배양액의 흐름 (완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물을 1 : 1 v / v)의 30 μL / 시간 상하 마이크로한다. </li><li> 해리 정상적인 인간의 모세 혈관의 미세 혈관 내피 세포 100 ㎕ 소개 (HMVECs, 최종 셀 밀도를 ~ 5.0 × 10 5 세포 / cm 2) 2.2.3에서 2.2.9로 단계에 설명 된 동일한 방법으로 낮은 마이크로에. </li><li> 경화 직사각형 PDMS 조각을 배치 (0.5 cm × 1 cm × 1 cm, 폭 X 길이 x 높이; 15 : 1, w/ 엘라스토머 W : 경화제) 창자 온 칩 디바이스 위에 후 거꾸로 전체 장치 설치 플립 () 즉, 상부 마이크로이 아래쪽에 대향하고, 상기 하부 마이크로은 위쪽에 직면한다. </li><li> 해리 HMVECs 하부 미세 다공질 막의 표면에 부착 할 수 있도록, 1 시간 동안 37 ° C, 가습 된 5 % CO 2 인큐베이터에서 인큐베이션 설정. </li><li> 이산화탄소 배양기에서 전체 설치를 꺼내, 다시 통해 설정을 뒤집습니다. </li><li> 기계적 스트레칭 운동에 30 μL / 시간 모두 상하 미세으로 ((1 V / V 한 완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물) 예열 된 공동 배양 배지 흐름 적어도 3 일 동안 10 %, 0.15 Hz로)는 내피 세포의 단층 세포 연접을 형성한다. </li></ol></li></ol> 3. 굿 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 마이크로 바이 옴 공동 문화를 호스트 굿 <ol><li> O를 사전 문화를 수행F 박테리아 세포를 microengineered 장 융모에하는 공동 문화 공생 장내 마이크로 바이 옴을 다음과 같이. <ol><li> 멸균 유산균 MRS 국물 강화 중간의 클로스 트리 디움 (1, V / V 1)의 혼합물 10ml에 동결 건조 생균제 세균 분말 혼합물을 재현 탁. </li><li> 10 ㎖의 일회용 멸균 튜브에 분취 한 후, 균체 현탁액의 3 ㎖를 매체의 적당량을 첨가하여 (600 nm에서) 약 0.2 광학 밀도 단위로 최종 세포 밀도를 조정한다. </li><li> 장소 관은 혐기성 용기에 미생물 세포를 재현 탁 함유. 컨테이너에서 혐기성 가스 발생 향 주머니의 두 팩을 추가합니다. 37 ° C에서 흔들림없이 컨테이너 설치를 단단히 용기 뚜껑을 닫고 품어 5 % CO 2 인큐베이터 O / N를 가습. </li></ol></li><li> 장내 상피 세포 5, 10과 마이크로 바이 옴과 공동 문화의 접종. <ol><li> 탈기 antibioti를 포함하는 3 ㎖ 일회용 주사기를 준비합니다C 무 세포 배양 배지 (예, 20 % FBS를 가진 DMEM). 문화 매체의 탈 절차 2.1.6를 참조하십시오. </li><li> 이산화탄소 배양기에서 microengineered 융모를 포함하는 장 - 온 - 어 - 칩 디바이스의 전체 설정을 가지고, 다음 바이오 안전성 캐비닛로 이동합니다. </li><li> 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결 튜빙에 연결된 주사기를 제거합니다. 다음 이전 마이크로 바이 옴의 파종에 12 시간 동안이 항생제없는 배지 흐름, 다시 CO 2 배양기에 가져, 장치에 3.2.1에서 제조 된 주사기를 연결합니다. </li><li> 5 분 동안 10,000 XG에서 미리 배양 바이오 틱 박테리아 혼합물 세포​​ (3.1 단계 참조) 스핀 다운. 진공을 이용하여 상등액 대기음 후 (~ 최종 세포 밀도가 1.0 × 107 CFU / ㎖) 항생제가없는 DMEM 배지에 재현 탁. </li><li> 25에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 &quot;무균&quot;장내 융모를 함유하는 마이크로 채널의 내강 측에 세포 현탁액을 주입G5 / 8 바늘. 의 장 융모의 혀끝의 표면에 미생물 세포의 부착을 허용 ~ 모든 튜브 끝으로 클램핑하여 흐름없이 1.5 시간. </li><li> 40 μL / 환상 리듬 변형과 시간 (10 %, 0.15 Hz로) 모두에서 상하로 미세 예열 항생제가없는 배지를 관류. </li><li> 녹색 형광 단백질의 공 배양 (GFP)을 표지 된 E.를 들어 콜라이 (E. coli에 GFP 비 - 병원성 DH5 알파 E. 콜라이 숙주) microengineered 융모와 10,11 세포 사전 배양 GFP E. 12 시간 동안 상태 (200 RPM)를 진탕하에 37 ℃에서 멸균 LB 배지에서 대장균 세포. E. GFP의 공존 배양을 수행 3.2.5에서 3.2.6에 절차를 반복 microengineered 융모와 대장균 세포. </li></ol></li><li> 이미지 셀 5,8-10 <ol><li> 미생물 및 상피 형태 5,8,10를 기록 DIC, 표면 형광 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다. <ol><li> DIC 이미징 들어, CO 2 배양기에서 장 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 설정을 가지고 현미경의 무대 장치 설치를 배치 한 다음 세포 형태를 기록합니다. </li><li> 융모 상피 형광 이미징의 경우, 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. <ol><li> 4 % 15 분 (w / v)의 파라 포름 알데히드와 융모를 수정합니다. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. </li><li> 0.3 %과 융모를 Permeabilize 하시려면 (v / v) 트리톤 X-100의 PBS 10 분간 소 혈청 알부민 (BSA) (/ V W) 2 %를 함유하는 희석. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. </li><li> 2 %와 블록 세포를 1 시간 동안 PBS에서 BSA 용액 (/ V w). 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. </li><li> 4 300 nM의 &#39;빛의 보호 아래 핵 염색을 위해 PBS에 희석, 6-diamidino-2-페닐 인돌 디 하이드로 클로라이드 (DAPI) 솔루션을 추가합니다. </li><li> 형광 팔로이 딘의 25 단위 / ㎖ 추가빛 보호 아래 F - 굴지 염색을 위해 PBS에 용해 (Phalloidin의-CF647 접합체). </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광 염색 된 세포의 이미지를 기록. 참고 : 25X 목적은 공 초점 현미경 동안 적절한 광학 줌으로 적용되었다. 도 3b에서, 약 525X의 배율을 사용 하였다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Donald E. Ingber는 Emulate Inc.의 창립자이며 회사의 지분을 보유하고 있으며 과학 자문 위원회 의장을 맡고 있습니다. 다른 저자는 재무 공개가 없습니다.

호스트 마이크로 바이 옴의 상호 작용을 이해하는 것은 의학의 발전을 위해 중요하다; 균체 주로 시험 관내에서 포유 동물 세포를 자라다 때문에 플라스틱 접시 또는 정적 웰 플레이트에서 수행 기존의 세포 배양 모델 이상 1-2일 위해 장내 미생물 살아있는 인간의 장 세포의 안정적 공 배양을 지원하지 않는다. overgrowing 미생물 개체군 빠르게 연속적 심각 장 장벽 기능을 손상시키고 장내 상피 세포 사멸을 야기 대사성 폐기물 (예를 들면, 유기산)의 과잉 생산, 산소 및 영양분을 소비한다. 따라서, 영양소의 고갈을 일으키는 세균 과증식 미생물 노폐물의 축적을 방지하는 공동 배양에 미세 (주 일간) 장기간 가능한 호스트 마이크로 바이 공존 유지에 매우 중요하다. 하는 microphysiological을 이러한 문제를 극복하기 위해창자 온 - 칩 디바이스 5,8- 완전히 분화 ​​된 인간의 장내 융모를 형성하고 시험 관...

인간의 장내 미생물 종의 놀랄만큼 다양한 배열 (&lt;1,000 종)과 엄청난 미생물 세포의 수 (인간 숙주 세포보다 10 배 이상) 유전자 (인간 게놈보다 100 배 이상) 1 항구. 이러한 인간 microbiomes은 영양소 및 대사 생체 이물질 면역 반응을 조절하고, 2 장 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 당연히 이러한 다양한 기능 제공, 공생 장내 마이크로 바이 옴은 광범위하게 건강과 질병 (3)을 변조한다. 따라서, 장내 마이크로 바이 옴 및 호스트 - 미생물 상호 작용의 역할을 이해하는 위장관 (GI) 건강 증진 및 장 질환 4에 대한 새로운 치료제를 탐험하기 위해 매우 중요하다. 그러나, 시험 관내 장 모델 (예, 정적 인 배양)에 존재하는 시간의 짧은 기간 (&lt;1 일) 균체 자라다 장내 장벽을 손상하기 때문에 호스트 마이크로 바이에 공 배양을 제한기능 5. 대리 동물 모델 (예를 들어, 무균 6 유전자 조작 생쥐 7)도 일반적으로 식민지와 인간의 장내 마이크로 바이 옴의 안정 유지가 어렵 기 때문에 호스트 장내 마이크로 바이 옴 크로스 토크를 연구하는 데 사용되지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 살아있는 인간 대장 5,8- 발생 호스트 장내 마이크로 바이 상호 작용을 에뮬레이트하기 위해 &quot;거트 온 칩&quot;microphysiological 시스템 (좌도 1a) 생체 모방 인간을 개발 하였다. 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스는 유연성, 다공성, 세포 외 기질 (ECM) 인간의 장내 상피 카코이 세포에 의해 줄 지어 코팅 된 막, 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 (그림 1A을 흉내 낸에 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미세 유체 채널을 포함 , 오른쪽) 9. 진공 중심의 순환 리듬 변형은 일반적으로 induc 변경을 모방 생리 기계적 변형을 유도(오른쪽 그림 1A) 연동 운동에 의해 에드. 흥미롭게도, 카코 -2 세포는 100 개 이상의 시간 동안 소화관 온 칩에서 성장 될 때, 자발적 단단히 접합, 정점 브러시 테두리 기저 지하실에 한정되는 증식 성 세포를 3 차원 (3D) 장내 융모를 형성 점액 생산 증가 약물 대사 활동 (예를 들어, 시토크롬 P450 3A4, CYP3A4), 향상된 글루코스 재 흡수 8. 이 &#39;무균&#39;미세 환경에서, 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus의 GG 또는 최대 2 주 5,10에 대한 호스트 상피 세포와 바이오 틱 박테리아 혼합물의 치료 형성하는 공동 문화 수 있었다. 본 연구에서는 장기간 장내 온칩 장치 호스트 장내 마이크로 바이 공동 배양을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 중요한 문제와 잠재적 인 문제를 논의하는 것은이 호스트 마이크로 바이 옴 공동 문화 (p)의 폭 넓은 응용 프로그램에 대해 고려해야 할rotocol.

<table><tbody><tr><td>25 mM 포도당 및 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td>을 함유 한 Dulbecco의 DMEM (Modified Eagle Medium) <td>37 °C에서 예열; C 수조에서.</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS 국물</td><td>BD</td><td>288120</td><td>121 &deg에서 오토클레이브 실행; C 15분 동안</td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (w/w), PDMS : 치료제</td></tr><tr><td>Caco-2BBE 인간 대장암 라인</td><td>하버드 소화기 질환 센터</td><td></td><td>인간 대장암 선암종&nbsp;</td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td> DMEM 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 Gibco 10378-016 1/100 희석에서 <td>20%(v/v)</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>DMEM</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>Phalloidin-CF647 접합체(25 units/ml)</td><td>비오튬</td><td>00041</td><td>F-액틴 염색</td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 장력 시스템</td>, <td>Flexcell International Corporation</td>, <td>FX5K</td><td>, 연동 유사 스트레칭 모션(10% 세포 변형, 0.15Hz 주파수)</td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td>, <td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging, DIC</td></tr><tr><td>스캐닝, 컨포칼 현미경</td>, <td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging, 형광</td></tr><tr><td>UVO 클리너</td>, <td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>장 칩</td></tr><tr><td>유형 I 콜라겐의 표면 활성화&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>칩으로 세포 배양을 위한 세포 외 매트릭스 구성 요소</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>칩으로 세포 배양을 위한 세포 외 매트릭스 구성 요소</td></tr><tr><td>1 ml 일회용 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td>세포 및 배지 주입 재료</td></tr><tr><td>25 G 5/8 바늘</td><td>BD</td><td>329651</td><td>세포 및 배지 주입 재료</td></tr><tr>주<td>사기 펌프</td><td>Braintree Scientific 주식회사</td><td>BS-8000</td><td>칩에 주입 장비</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>8가지 다른 공생 미생물의 공식</td></tr>화 <tr><td>강화 Clostridial Medium</td><td>BD</td><td>218081</td><td>혐기성 세균 배양 매체</td></tr><tr><td>GasPak EZ Anaerobe 컨테이너 시스템 지시자</td><td>BD</td><td>260001</td><td>혐기성 가스 생성 주머니&nbsp;</td></tr><tr><td>4 % 파라 포름 알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>157-4-100</td><td>염색을위한 세포 고정</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>세포 투과</td></tr> 소 <tr><td>혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>세포 염색을위한 차단제</td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td>칩 제조용 플라즈마 발생기</td></tr><tr><td>스테리플립&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>완전한 배양 배지 가스 제거</td></tr><tr><td>수동 세포 계수용</td> <td>일회용 혈구계</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td></tr></tbody></table>

에 microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

여기서는 인간 소화관 온 칩 microphysiological 장치 microengineered 장내 융모와 멀티 종 장기적 공 배양 인간 소화관 마이크로 바이을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 우리는 생리 기계적 변형 및 유체 전단 흐름이 지속적으로 연동 운동을 모방 적용되는 미세 유체 장치에서 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스를 요점을 되풀이. 루멘 마이크로 채널에서, 인간의 장내 상피 카코이 세포는 &#39;무균&#39;융모 상피 세포를 형성하고 소장 융모를 재생하는 배양. 전 배양 된 미생물 세포 호스트 미생물 생태계를 확립 내강 측에 접종한다. 미생물 세포가 융모의 선 단면에 부착 한 후, 유체 유동 및 기계적 변형은 정상 상태의 신선한 배지 끊임없이 공급되는 미세 언 바운드 박테리아 (뿐만 아니라 박테리아 폐기물) 연속 제거를 생성 재개된다. 확장 공 배양 후 F주에 ROM 일 여러 microcolonies 임의로 융모 사이에 위치한 것으로 밝혀졌다, 미생물 및 상피 세포 모두 배양 최소 1 주일 동안 생존과 기능을 유지. 더불어 배양 프로토콜은 건강과 질환 조율 인간 마이크로 바이 역할의 시험 관내 연구를 용이하게 할 수있다 각종 인간 장기에서 발견 될 수있는 다른 호스트 마이크로 바이 생태계에 대한 다목적 플랫폼을 제공하도록 구성 될 수있다.

시험 관내에서 인간의 장내 호스트 마이크로 바이 생태계를 에뮬레이트하기 위해, 인 필요는 연동 운동과 같은 역학과 유체 흐름과 같은 생리 학적 조건에서 장내 세균과 인간의 장내 상피 세포의 안정적인 장기 협력 문화를 재구성하는 실험 프로토콜을 개발. 여기서, 우리는 생체 모방 창자 - 온 - 칩 마이크로 디바이스를 이용 (그림 1A)를 체외에서 일주일의 기간 이상 인간 융모 생활과 직접 접촉하는 미생물 세포 생활 문화 공동합니다. 장 상피 세포는 자연적으로도 분화 융모를 형성 할 때 중요한 생리 유체 유동 및 고리 기계적 변형 (5)의 존재하에 2 채널 미세 유동 장치의 한 채널에서 다공성 ECM 피복 막의 한쪽에 배양 하였다. microengineered 융모는 인간의 소장 융모 포함 formati의 구조와 기능을 복제혀끝의 브러시 테두리로 줄 지...

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장 온 어 칩(gut-on-a-chip) 미세유체 장치에서 연동 운동과 같은 움직임 및 흐름에 따른 인간 장 세포의 융모 성장을 입증하고 이러한 세포를 살아있는 장내 마이크로바이옴과 공동 배양하는 방법을 보여주는 것입니다. 따라서 이 방법은 위장병학, 임상 미생물학 및 제약 과학 분야의 핵심 질문을 통해 질병 메커니즘을 식별하고 신약 화합물의 효능과 독성을 검증하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구원들이 미생물 생리학 시스템을 사용하여 체외에서 인간 생체 장의 실행 가능하고 기능적인 포스트 마이크로바이옴 생태계를 구축할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 궤양성 대장염이나 크론병과 같은 질병으로 확장될 수 있는데, 숙주 세포와 마이크로바이옴의 안정적인 공동 배양이 이러한 질병의 복잡성을 모방할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 장내 마이크로바이옴과 장내 면역 체계 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 피부, 생식기 또는 구강과 같이 숙주 미생물 상호 작용이 있는 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 gut-on-a-chip 미세유체 장치를 준비합니다.이 장치는 유연한 다공성 PDMS 멤브레인으로 분리된 두 개의 병렬 마이크로 채널을 포함하는 투명한 가스 투과성 실리콘 폴리머로 구성됩니다. 채널의 각 측면에는 진공 챔버가 있으며, 이는 주기적인 기계적 변형을 적용하는 데 사용할 수 있습니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 채널을 통해 70% 에탄올이 흐르도록 장치를 살균합니다.그런 다음 섭씨 60도의 건조 오븐에서 밤새 장치를 건조시킵니다. 다음 날, gut-on-a-chip 마이크로시스템과 연결된 튜브를 40분 동안 자외선과 오존에 동시에 노출시킵니다. 생물 안전 캐비닛의 자외선 아래에서 15분 동안 장치를 식히십시오.다음으로, 100마이크로리터의 세포외 매트릭스 코딩 용액을 1밀리리터 주사기에 넣고 장치의 상단 마이크로채널에 분배합니다. 이 과정을 반복하여 하부 마이크로 채널도 코팅합니다. 전체 설정을 섭씨 37도 가습 5%CO2 인큐베이터에 1시간 동안 배치합니다.배양 중에 50ml 여과 시스템의 0.45미크론 필터를 1분 동안 통과시켜 가스를 제거함으로써 완전한 배양 배지를 예열했습니다. 여과된 매체를 1분 동안 부드럽게 두드려 매체의 기포나 용해된 가스를 제거합니다. 그런 다음 가스가 제거된 완전한 매체를 3밀리리터 일회용 주사기 2개에 넣고 주사기를 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 주사기를 gut-on-a-chip의 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결하고 부드러운 펄스로 상부 및 하부 마이크로 채널로 완전한 매체를 흐르게 하여 코딩 용액을 씻어냅니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 가스가 제거된 완전한 세포 배양 배지를 장치의 상부 마이크로채널로 흐르게 하는 동시에 섭씨 37도 및 5%CO2에서 밤새 칩을 배양합니다.먼저 10ml의 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 헹구어 Caco-2 장 상피 세포가 완전히 결합된 T75 플라스크를 수확합니다.그런 다음 PBS를 흡인하고 헹굼을 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 0.05% 트립신-EDTA 용액 1ml를 넣고 플라스크를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 분리되면 예열된 전체 세포 배양 배지 10ml를 추가하고 세포 현탁액을 3-5회 피펫팅한 후 원심분리 튜브로 옮깁니다.세포 현탁액을 스핀다운합니다. 다음, 상등액을 제거하고, 150, 전 데워진 완전한 매체에서 제곱된 센티미터 당 000의 세포에 세포를 다시 중단하십시오. 500 게이지, 25/8 인치 바늘이 장착 된 1 밀리리터 일회용 주사기에 500 마이크로 리터의 셀 현탁액을 끌어 당깁니다.그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 배출구 튜브를 통해 상부 마이크로채널로 분배합니다. 다음으로, 바인더 클립을 사용하여 상단 및 하단 마이크로 채널에 연결된 모든 입구와 출구를 고정합니다. 장 상피 세포가 다공성 막의 표면에 부착될 수 있도록 전체 설정을 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 클램프를 제거하고 상부 채널 튜브를 주사기 펌프에 놓인 배양 배지로 채워진 주사기에 연결합니다. 세포가 손상되지 않은 단층에서 나올 때까지 시간당 30마이크로리터로 배양 배지의 상부 마이크로채널로의 흐름을 재개합니다. 세포가 단층을 형성하면 하부 채널을 두 번째 주사기에 연결하고 배양 배지를 시간당 30마이크로리터의 동일한 유속으로 상부 내강과 하부 모세관 미세채널 모두에 관류합니다.칩에서 연동 운동과 같은 움직임을 생성하려면 먼저 진공 펌프를 켜십시오. 스테인리스 스틸 커넥터가 있는 튜브를 통해 장치의 진공 챔버를 진공 컨트롤러에 연결합니다. 그런 다음 0.15Hz의 빈도로 평균 세포 변형률의 10%인 순환 부호 스트레칭 동작을 제공하도록 컨트롤러를 설정한 다음 시작을 클릭합니다.융모 성장을 유도하기 위해 최소 80시간 동안 기계적 변형이 있는 상태에서 상부 및 하부 미세채널 모두에 유동 배양 배지를 유지하십시오. 오토클레이브 락토바실러스 MRS 육수와 강화 클로스트리듐 배지의 50/50 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 동결 건조된 프로바이오틱 박테리아 혼합물을 혼합물 10ml에 다시 현탁시킵니다.600나노미터에서 혼합물의 광학 밀도를 측정하고 최종 셀 밀도를 약 0.2 광학 밀도 단위로 조정합니다. 조정된 미생물 세포 현탁액 3ml를 일회용 10ml 멸균 튜브에 분취합니다. 부분 표본을 혐기성 용기에 넣고 혐기성 가스 발생 봉지 2팩을 용기에 추가합니다.용기 뚜껑을 단단히 닫고 인큐베이터에서 밤새 흔들지 않고 용기 설정을 배양합니다. 다음으로, 가스가 제거된 무항생제 세포 배양 배지를 준비하고 3mL 일회용 주사기에 넣습니다. 마이크로 엔지니어링 융모가 포함된 gut-on-a-chip 장치를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.장치의 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결된 주사기를 제거하고 탈기된 무항생제 세포 배양 배지가 들어 있는 주사기로 교체합니다. 완료되면 장치를 CO2 인큐베이터에 다시 놓습니다. 그런 다음 마이크로바이옴을 장착하기 전에 12시간 동안 무항생제 배양 배지를 장치에 흘려보냅니다.다음으로, 사전 배양된 프로바이오틱 박테리아 세포 혼합물을 스핀다운합니다. 상층액을 흡인한 다음 항생제가 없는 DMEM에 박테리아를 다시 현탁시킵니다. 이 셀 현탁액 약 100마이크로리터를 25게이지, 5/8인치 바늘에 부착된 1밀리리터 주사기에 로드합니다.이전에 세균이 없었던 장 융모를 포함하는 미세채널의 내강 쪽에 박테리아를 주입합니다. 튜브를 고정하여 미생물 세포가 장 융모의 정점 표면에 1시간 30분 동안 흐름 없이 부착되도록 합니다. 그런 다음 사전 예열된 무항생제 배양 배지를 주기적인 리듬 변형으로 시간당 40마이크로리터의 상부 및 하부 미세채널 모두에 관류합니다.이 공동 배양 프로토콜은 융모 간 공간에서 여러 종의 프로바이오틱 박테리아의 안정적인 군락을 가능하게 합니다. 생존 가능한 박테리아 마이크로 콜로니는 공동 배양에서 최대 2주 동안 유지될 수 있습니다. 여기에서 보이는 것은 GFP에 의하여 표한 대장균과 장 융모 둘 다로 이루어져 있는 다른 co-cultic입니다.고출력 배율은 72시간 시점에서 박테리아 마이크로 콜로니의 위치를 명확하게 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 배양 초기 단계에서 상피 세포 단층이 손상되지 않도록 배양 배지를 미세유체 채널에 부드럽고 천천히 주입하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법을 기반으로 인간 면역 세포와의 공동 배양 방법은 마이크로바이옴이 면역 체계와 어떻게 상호 작용할 수 있는지, 그리고 최적의 장 건강을 위한 항상성에 영향을 미치는지에 대한 단서를 제공할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 인간 장의 미시 환경을 재구성하는 방법과 미생물 군집과 인간 장 융모 간의 공동 배양을 in vitro에서 입증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 박테리아 및 인간 세포로 작업하는 것은 매우 위험하므로 생물 안전 캐비닛 내부에서 작업하는 것을 잊지 마십시오.

co-culture-living-microbiome-with-microengineered-human-intestinal

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 쥐의 장 조직 조각과 특정 장내 세균 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 장 장기 배양 시스템을 설정하는 방법론을 설명합니다. 이 장치는 두 쌍의 입력-출력 포트로 구성되며, 첫 번째는 장 조직 내강을 연결하고 특정 박테리아 현탁액을 공급하고, 두 번째는 생체 외 조직 생존력을 유지하기 위해 장치의 웰에 매체를 지속적으로 공급합니다.

숙주-미생물총(Microbiota) 상호작용을 연구하기 위한 생체 외 장기 배양 시스템

여기에서는 최대 28일 동안 미세유체 다기관 칩에서 일차 세포, 조직 모델 및 펀치 생검을 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 인간 피부 미세혈관 내피 세포, 간 응집체 및 피부 생검이 공통 매체 순환에서 성공적으로 결합되었습니다.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

여기, 선물이 위장 장 관의 생리 조건을 시뮬레이션 bioreactors의 시리즈를 사용 하 여 콜론 생체 외에서, 의 본질적인 microbiota 경작을 위한 프로토콜.

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neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

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이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

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개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

이 기사에서는 미세공기성 조건에서 살아있는 질 마이크로바이옴과 인간 숙주의 상호 작용을 연구할 수 있는 미세유체 질 온 칩(Vagina Chip) 배양 장치를 만들기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 칩은 질 질환을 조사하고 잠재적인 치료 대책을 개발 및 테스트하는 도구로 사용할 수 있습니다.

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

배우세요 인간 장내 융모와 생활 마이크로바이옴의 공동 배양 방법을 미세유체 장치를 이용하여. 이 기술은 위장병 및 신약 개발 연구에 활용될 수 있습니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

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