의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동

이 설정의 전반적인 목표는 제공된 자동 초파리 추적 소프트웨어 스크립트를 사용하여 4분면 후각계에서 초파리의 후각 행동을 분석하는 것입니다. 이 방법은 후각 신경계가 외부 세계를 어떻게 감지하는지, 그리고 뇌가 행동 결정을 어떻게 해독하고 지시하는지에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다용도로 활용 가능하고 견고하며, 넓은 실험 구역 내의 초파리 집단에 대해 후각 반응의 반복 테스트가 가능하다는 점입니다.

본 프로토콜을 위해 플라스틱 외부 용기, 유리 내부 용기 및 맞춤 제작된 PTFE 덮개 삽입물로 구성된 5개의 취기 챔버를 준비하십시오. 삽입물은 중앙 부분을 제거하고 두 개의 단방향 밸브를 부착한 기존 용기 덮개입니다. 취기 챔버 중 4개는 용매 대조군용으로, 1개는 테스트 취기용으로 사용하십시오.

각 챔버가 깨끗한지 확인한 다음, 1 mL의 용매 또는 희석된 취기 성분을 취기 용기에 넣습니다. 그 후, 플라스틱 챔버 내 용기의 위치를 확인하고 액체가 유출되지 않았는지 확인하십시오. 누출을 방지하기 위해 스크류 캡과 PTFE 인서트의 O-링을 사용하여 뚜껑을 고정합니다.

초파리를 표준 옥수수 가루 배지에서 사육합니다. 표준 병에 수컷 30마리와 암컷 30마리를 넣고, 실온에서 5일 동안 알을 낳게 합니다. 이러한 병에서 갓 우화한 초파리를 수집합니다.

각 실험 군에 대해, 짧은 이산화탄소 마취 하에 수컷 25마리와 암컷 25마리의 파리를 수집하고 표준 파리 배지에서 2~4일 동안 노화시킵니다. 실험 시작 40~42시간 전에, 해당 군을 먹이가 없고 습도 유지를 위해 약 10 milliliters의 1% agarose gel이 들어 있는 바이알로 옮깁니다. 굶기기는 전체적인 움직임을 증가시키는 데 도움이 되며, 파리의 90% 이상이 이 굶기기 과정에서 생존해야 합니다.

취약한 유전자형의 경우 10% 이상의 개체가 폐사할 수 있는데, 이럴 때는 실험에 사용되는 모든 초파리를 하루 동안 굶긴 후 시도하십시오. 최소 5분 전에 온도 조절기를 켜고 25 °C로 설정합니다. 그런 다음, 플라스틱 튜브를 통해 냄새 챔버를 아레나에 연결합니다.

전자 유량계를 사용하여 아레나의 각 사분면 내 공기 흐름 속도를 확인하십시오. 대조군 및 냄새 유인 공기 흐름이 모두 100 milliliters per minute로 유지되고 있는지 확인하십시오. 초파리는 공기 흐름에 매우 민감하므로, 매 실험 전 각 사분면의 공기 흐름을 확인하는 것이 매우 중요합니다.

이제 70% ethanol을 사용하여 아레나와 유리 플레이트를 세척합니다. 모든 부품을 2~3회 닦아내고, 다음 단계로 넘어가기 전에 공기 중에서 완전히 건조시킵니다. 그 다음, 유리 플레이트를 아레나에 클램프로 고정합니다.

그런 다음, 마취 없이 파리들을 아레나로 옮깁니다. 중력을 이용하여 유리판 중 하나의 구멍을 통해 파리들이 들어가게 한 뒤, 원형 망으로 구멍을 덮습니다. 이제 파리가 들어 있는 아레나를 차광 챔버에 넣습니다.

그다음, 4개의 대조 공기 흐름을 각 아레나 모서리에 연결합니다. 챔버의 문을 닫고 초파리가 새로운 환경에 10분에서 15분 동안 적응하도록 둡니다. 적응 기간이 지난 후, 초파리를 4개의 대조 공기 흐름에 노출시키는 5분에서 10분간의 대조 실험을 수행합니다.

이제 즉시 데이터를 분석하는 것이 필수적입니다. 파리가 아레나 내에 고르게 분포되어 있지 않다면, 아레나를 재설정해야 합니다. 깨끗한 공기에 노출된 대조군 파리의 행동을 테스트하는 것이 매우 중요합니다.

이를 통해 모든 배경 조건이 정상인지 빠르게 확인할 수 있습니다. 빛 누출, 온도 불균형, 기울어진 아레나 또는 냄새 오염 등은 모두 문제를 일으킬 수 있습니다. 필요한 경우, 파리를 폐기하고 아레나를 다시 세척하십시오.

취기 오염이 의심되는 경우, 모든 튜브를 교체하십시오. 동물들이 4개의 사분면 중 어느 곳에도 선호도를 보이지 않을 때까지 새로운 코호트로 대조군 테스트를 반복하십시오. 그 후, 3방향 밸브를 사용하여 테스트 취기 챔버를 장치에 연결하거나, 튜브를 다시 연결하고 5분에서 10분 동안 테스트 실험을 수행하십시오.

실험 기록 시간이 길어질 경우, 데이터 파일의 크기가 너무 커지는 것을 방지하기 위해 20분마다 추적 프로그램을 빠르게 중단했다가 다시 시작하십시오. 테스트 사이에는 파리를 폐기하고, 아레나와 유리 플레이트를 70% ethanol로 세척한 후 연결 튜브를 교체하십시오. 시스템을 지속적으로 세척할 수 있도록 건조 공기 흐름을 계속 유지하십시오.

효율성을 위해 두 개의 아레나를 준비하여 실험 진행 중에 세척을 수행하는 것이 좋습니다. 같은 날 여러 실험에서 오류가 발생한다면, 이전 실험으로 인해 시스템에 냄새가 남아 있지 않도록 각별히 주의하십시오. 이는 일반적으로 저농도의 취기질이나 CO2를 사용할 때는 문제가 되지 않으나, 고농도 자극제의 경우 실험 횟수 사이에 최대 24시간의 간격이 필요할 수 있습니다.

데이터 분석을 위해, 제공된 맞춤형 Matlab 루틴을 사용하여 데이터를 Matlab 형식으로 변환하십시오. 트래킹 소프트웨어를 통해 실시간으로 생성된 원시 데이터 파일을 불러오고, 아레나의 윤곽을 따르는 공간 마스크를 생성하십시오. 마스크를 원시 데이터에 적용하여 아레나 외부의 모든 데이터 포인트들을 제거하십시오. 이러한 데이터 포인트들은 노이즈를 나타냅니다.

그 다음, 3초 이상 0.163 centimeters per second 미만으로 이동하는 모든 데이터 포인트들을 제거합니다. 이 데이터는 노이즈이거나 움직이지 않는 파리일 가능성이 높습니다. 이제 기록 기간 동안의 모든 데이터 포인트를 플롯하여 시각화합니다.

데이터는 단일 궤적으로도 확인할 수 있습니다. 초파리의 행동 데이터를 기반으로 냄새 경계를 빠르게 추정할 수 있습니다. 그 다음, 유인 지수를 계산하고 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 통계 테스트를 수행하십시오.

수컷 초파리 25마리와 암컷 초파리 25마리를 행동 실험 장치에서 테스트하였습니다. 건조한 공기에 반응하여, 초파리들은 특정 구역에 대한 선호 없이 경기장 전체를 탐색하였습니다. 선은 초파리 한 마리의 추적 궤적을 나타냅니다.

사과식초를 왼쪽 상단 사분면의 기류에 도입했을 때, 대부분의 초파리가 해당 냄새 사분면으로 유인되었습니다. 기피성 냄새 물질인 10% ethyl propionate를 왼쪽 상단 사분면에 도입했을 때는 해당 사분면을 회피했습니다. 해당 사분면의 유인 지수(attractive index)는 0.68로 측정되었습니다.

유인 지수(attractive index)는 후각 반응 측정에서 가장 널리 사용되는 지수입니다. 0보다 크거나 작은 값은 각각 유인 또는 기피를 나타냅니다. 해당 스크립트는 실험 회차 간의 아레나 위치에서 발생하는 미세한 차이를 보정하였습니다.

노이즈이거나 움직이지 않는 초파리였을 가능성이 있는 데이터 포인트는 제거되었습니다. 테스트는 어떤 시간 동안으로도 수행할 수 있지만, 10초 단위의 빈으로 코호트의 움직임 변화를 관찰하는 것이 후각 순응 및 기타 현상을 이해하는 데 유용합니다. 이 영상을 시청한 후에는 4분면 분석법(four-field assay)에서 후각 행동을 효과적으로 수행하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

숙달되면 각 후각 실험은 약 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 일반적으로 하루에 4~6회의 실험을 수행합니다.