Name: 편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 편광 TIRF 현미경을 이용한 SNARE 매개 막 융합 단일 분자 관찰 기법입니다. 지지 이중층과 리포좀 간 융합 이벤트를 실시간으로 측정하여 막 융합 역학 및 화물 방출 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

편광 TIRF 현미경의 설계 및 제작에 대해 Vladimir Polejaev(Yale West Campus Imaging Core)에게, 2색 검출 기기에 도움을 준 David Baddeley(예일 대학교), 그리고 토론을 고무적으로 해준 James E. Rothman(예일 대학교)과 Ben O'Shaughnessy(컬럼비아 대학교) 및 그룹 구성원에게 감사드립니다. EK는 Kavli Foundation의 Kavli Neuroscience Scholar Award와 NIH 보조금 1R01GM108954의 지원을 받습니다.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명 된 SUV-SBL 융합 분석의 성공적인 구현은 좋은 품질의 SBLs를 획득, 단일 분자를 검출 할 수있는 권리 이미징 매개 변수를 선택, 같은 리포좀으로 단백질의 기능 재구성과 같은 몇 가지 주요 단계에 결정적으로 의존한다. 이 성공하는 데 시간과 노력이 걸릴 수 있지만 분석이 성공적으로 실행되면, 그것은 소개에서 논의 된 다른 체외 융합 분석에서 사용할 수 없습니다 융합 프로세스에 대한 풍부한 정보를 제공한다. 요금은있는 SUV 차량은 SBL, 도킹 간 융합 시대의 분포, 지질 확산, 모든 융합 리포좀의 크기에 퓨즈 도킹, 주어진 융합 이벤트에 대한 지질 자료는 diffusion- 또는 기공 제어 캔 여부 결정. 릴리스 확산에서 예상보다 훨씬 느린 경우, 기공 깜박임을지지 모델은 지질 분리 수율의 지연, P 0, 시간의 분율을 기초가되는 구멍 난융합 27 일 동안 열려이야. 염료 분자 사이의...

막 융합 지질과 단백질, 분비, 수정, 개발의 세포 내 인신 매매에 필요한 보편적 인 생물학적 과정 및 호스트 생물 1-3로 바이러스 항목을 포위. 세포 외 유출을 통해 호르몬과 신경 전달 물질의 방출을 포함한 대부분의 세포 융합 반응의 경우,이 지질 이중층을 융합 할 수있는 에너지에 정박, 동족 가용성 N-에틸 말레이 미드 민감한 요소 첨부 단백질 수용체 (SNARE) 단백질 사이의 네 나선 번들 형성에 의해 제공됩니다 소포 (V-SNARE) 각각 대상 막 (t-SNARE) 4. 시냅스 소포 세포 외 유출이 가장 엄격하게 규제 융합 반응이며 활동 전위 1,4,5의 도착 후 밀리 초 내에 발생한다. 융합 기공, 두 융합 구획 사이의 초기 연결을 열고 깜빡하고 재 밀봉 또는 비가 역적 5-7 확장하기 전에 여러 차례 폐쇄 할 수 있습니다. 전 결과순간에, 후자의 리드하면서 전체 융합, 융합 &quot;키스 및 실행&quot;. 이 두 가지 융합 모드와 기공 깜박임을 조절하는 메커니즘 사이의 균형을 지배하는 요인은 잘 5,8 이해되지 않습니다. SNARE 단백질은 세포 외 유출에 필요한; 시냅스 소포의 융합은 신경독 (9)에 의해 함정의 절단에 폐지된다. 작은 단일 층 소포 (포드 SUV)을 사용하여 대량 융합 실험도 막 융합 (10)를 구동하기에 충분한 덫은 필요하지 않은 것으로 나타났다하지만. 이 벌크 분석에서, SUV 차량은 V-스네어 (V-SUV)로 재구성 형광 인지질 (N 도핑 된 - (7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazol -4- 일) -phosphoethanolamine (NBD-PE) 및 ( N -. (리사 민 로다 민 B의 설 포닐) -phosphoethanolamine (LR-PE) 및 v-포드 SUV의 NBD-PE의 초기 형광 포스터 공명 에너지 전달에 의해 급냉 t-덫 (t-SUV)를 포함하는 레이블이없는 소포와 혼합 (FRET ) LR-PE에. 실험실로eled V-SUV와 비 표지 t-SUV 차량과 융합, 지금은 결합 막 중의 형광 물질의 표면 밀도는 감소되고, NBD-PE 형광의 결과 증가 된 지질 10의 혼합의 범위를보고한다. 대량 분석을 설정하고 분석하기 쉬운, 널리 SNARE 매개 융합 10-14의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 낮은 감도와 가난한 시간 해상도와 같은 몇 가지 제한이 있습니다. 가장 중요한 것은, 앙상블 측정으로, 어려운 hemifusion 중간체의 도킹과 융합 사이의 차별뿐만 아니라 탐지를 만드는 모든 이벤트를 통해 그 평균 결과. 우리를 포함하여 지난 십 몇 개의 그룹, 동안, 하나의 소포 레벨 15-27에서 융합 이벤트를 모니터링 할 수있는 새로운 분석법을 개발했다. 하 연구진은 표면에 닿는 V-SUV 차량을 사용하고 무료 t-포드 SUV (18, 19)과의 융합을 모니터링. 지질 혼합 지질 결합 된 형광체 한 쌍의 FRET를 사용하여 측정 하였다 그들전반사 형광 (TIRF) 현미경 (18)을 이용하여 각각 V- 및 t-SUV 차량에 침대. 나중에 Brunger의 연구소는 지질과 내용이 20,28 혼합의 동시 검출을위한 내용 마커와 함께 하나의 지질 라벨 종을 사용했다. 지질 내용물 마커 모두 높은 자기 농도 켄칭 하였다; 레이블이없는 포드 SUV와 융합 20,28을 dequenching 형광 결과. 다른 사람은 t-덫 15-17,21-27,29으로 재구성 평면 이중층에 V-포드 SUV를 융합했다. 타겟 (t-SNARE 함유) 이중층 잘 모방 평면 세포막 작은 고도로 곡선 소포 융합의 생리적 과정의 평면 형상. 스타이 기는 다공성 실리콘 질화물 기판 상에 현탁 t-덫으로 재구성 기공 걸쳐 막을 채용 및 공 초점 레이저 주사 현미경 (23)을 사용하여 각각의 V-SUV 차량과 융합 검출. 기타 Ft-덫으로 재구성 평면 이중층에 사용 된 V-포드 SUV는 유리 기판 15-17,21,22,24-27,29 지원. 지원 이중층 (SBLs)를 사용할 때의 큰 장점은 마이크로 유체를 사용하는 것이 아니라 사용하는 단일 이벤트 해상도를 제공하지만 TIRF 현미경는 우수한 신호대 잡음비와 자유 V-SUV의 간섭없이 도킹 및 융합 이벤트를 검출하는데 사용될 수 있다는 표준 원거리 표면 형광 현미경 (24). 주된 관심사는 기판 이중층 상호 작용 이중층 품질 및 융합 과정을 지원하는지 여부에 영향을주는 방법이다. 초기 작품은 직접 유리 또는 석영 기판 15-17에서 지원 된 평면 SBLs 사용했다. 이 SBLs은 확산과 기판에 T-SUV 세포막의 융합, 파열, 흡착에 의해 만들어졌다. 이는 곧 키 t-SNARE 성분을 생략 SNAP25가이 방식으로 제조 SBLs에서 V-SUV 도킹 및 융합 동력학 indistinguis 결과 있다는 것이 실현전체 t-덫 (17)를 사용하여 얻은 것과 hable. SNAP25 절대적 생체 (30, 31)의 융합이 필요하기 때문에, 이러한 초기 시도의 생리 학적 관련성이 질문에 넣었다. Tamm의 그룹은 더 나은 지원하여 제어 이중층 형성 (21)를 사용하여이 문제를 극복했다. 또한 t-SUV 차량 (21)이 단일 층의 융합이어서 SBL의 무 단백질 제 전단 대한 랭 뮤어 - 블로 젯 증착법을 사용 하였다. 이 SNAP25에 의존 융합의 결과. 직접 랭 뮤어 - 블로 젯 방법을 사용하지 않고, 유리 기판 상에지지 된 이중층과 관련된 잠재적 인 아티팩트를 방지하려면 Karatekin는 외. 이중층과 기판 (24) 사이의 부드러운 수화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 쿠션을 도입했다. 이 수정은 SNAP25에 의존 융합 (24) 결과. 연질 중합체 층에 쿠션 이중층은 더 트랜스를 유지하는 것으로 알려져 있었다단백질의 이동과 기능 (32), 그리고 바이러스 33 핵융합 연구에 사용되었다. 또한, PEG 화 이중층은 자기 치유 일부 능력을 유지하는 것 및 (34, 35)이 매우 강하다. 먼저, 시판 지질 결합 PEG 사슬의 일부가 t-SUV 막에 포함된다. 이러한 t-SUV의 버스트와 유리 기판 상에 평면 이중층을 형성 할 때, PEG 브러시 판 이중층 모두 전단을 커버한다. 평면 이중층 형성이 친수성 ​​유리 표면에 t-SUV 차량 주변의 PEG 사슬의 부착에 의해 구동되기 때문에, 리포솜 파열 평면 이중층 형성에 사용되는 지질 조성물에 비교적 둔감하다. 콜레스테롤이 다량 포함되어있는 경우에는, 상기 SUV 차량의 응집성을 증가 SUV의 자발적 버스트 수 없다. 이 경우, 삼투압 충격 또는 가의 이온 평면 이중층의 형성 (25)를 돕기 위해 사용될 수있다. 이 AP에 상술 한 바와 같이,PEG의 브러시 평면의 양측을 커버 proach 이중층 지원. 마이크로 유체 유동 채널을 향하는 브러시는 일반적으로 PEG 층으로 피복되어 들어오는 V-SUV 차량의 비특이적 부착을 방지 할 수 있습니다. V-와 t-SNARE 복합체의 형성은 막 인접 영역 (36)을 향해 단계에서 막 원심 N 말단 진행됩니다. V 자 포드 SUV는 t-SBL의 V- 및 분석의 조건 하에서 경우듯한 PEG 브러쉬, 위에 돌출하는 t-SNARE N 말단의 필요성과 상호 작용을 위해. 브러시 높이 PEG 화 지질 농도와 PEG 사슬 길이를 변화시킴으로써 37,38 스네어 이외의 단백질을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 융착 이중층의 근위 표면을 덮고있는 PEG 브러쉬의 또 다른 이점은 평방 미크론 (39) 당 30,000-40,000 통합 막 단백질로 포장 생체막의 혼잡 한 환경을 모방한다는 것입니다. 다만이 분석에서 PEG 사슬처럼, 어 Repu생물 세포막을 덮고 lsive 단백질 층은 융합이 발생 할 두 인지질 이중층 사이의 접촉을 허용하도록 밀려 될 필요가있다. 그들 고유의 이점을 제공하는 미세 유체 유로는 상기 분석에 사용된다. 먼저, 미세 유체 흐름은 t-SBL을 형성하도록보다 균일 한 확산 t-SUV의 석출 및 용해를 가능하게한다. 둘째, 작은 채널 볼륨 (&lt;1 μL)를 샘플 소비를 최소화한다. 셋째, 필요한 소량 전체 실험 일정한 흐름 하에서 실시 할 수있다. 흐름 약하게 제거 아마도 비 즉, SBL 16 접착 V-SUV 차량. 또한 운동 분석 (17)을 단순화 t-SBL 위의 V-SUV 차량의 일정한 밀도를 유지한다. 마지막으로, 도킹 소체 쉽게 유동 (25)에 의해지지없는 것과는 구별된다. 넷째, 여러 미세 유체 채널은 각각 다른 조건을 프로빙 동일한 커버 슬립에 사용될 수있다. 이 조건 두리의 비교를 허용같은 실험 실행 ng를. 유사한 접근 방식은 인플루엔자 바이러스와 쿠션 SBLs (33) 사이의 융합을 연구하기 위해 밴 Oijen 그룹에 의해 사용되었다. TIRF 현미경 유리 버퍼 인터페이스의 아주 가까이에있는 이러한 분자 경계 형광 여기 (감쇠 상수 ~ 100 nm의 제공) 산장의 붕괴 지수. 이것은 멀리있는 형광 분자의 기여를 최소화하는 신호 대 잡음비를 증가시키고, 10 내지 40 밀리 초 프레임의 노출 시간이 단일 분자 감도를 허용한다. 에바 네 센트 필드는 용융시에 신호의 증가에 이르게 다음 SBL로 SUV에서 표지 지질 전송, 그들은 찾아내는 평균적 강한 자극 필드. 형광의 증가는 더 큰 리포좀위한 강하다. 편광 소멸 필드를 생성하는 데 사용되는 경우, 부가적인 효과가 t에 따라, 형광의 변화에​​ 기여SBL에 SUV에서 레이블를 ransfer. 일부 지질 염료가 포함 된 이중층에 대하여 바람직한 평균 각도 배향 전이 쌍극자를 갖는다. 편광 빔이 다른 두 개의 막에 염료를 여기하기 때문에 이것은 그들이 SBL 대 SUV에있을 때 형광 물질에 의해 방출 된 형광의 양의 차이를 만든다. 후자 다이폴 방위는 평탄한 SBL 형상으로 한정된다 반면, 전자의 경우, 여기 빔은 구면 SUV 주위 배향 전이 쌍극자와 상호 작용할 것이다. 염료는 멤브레인 29,40에 지질 염료 전이 쌍극자 평행하게 배향 용 SUV에 비해 SBL에있을 때, 예를 들면, s 편광 (입사면에 수직으로 편광 된) 입사 광이 이용되는 경우, 여기에서는보다 효율적인 (예 : DII의 또는 DID 41-43 등). 이러한 형광 도핑 된 SUV는 어둡게 나타날 때 SBL (그림 7, Representat 위에 그것을 부두<html> ) 결과 필자. 융합 기공이 열리고 SUV와 SBL 세포막을 연결하는 바와 같이, 형광 프로브는 SBL로 확산하고 s 편광 소멸 필드 25,27,29에 의해 여기 될 가능성이됩니다. 따라서, 융합 사이트 주위에 통합 된 형광 신호는 SBL (27) (그림 3과 그림 7)에 SUV에서 염료 전송하는 동안 급격하게 증가한다. SBL로 전송하는 경우가 희석으로 융합 형광 레이블 dequenching되어 함께 변경 신호에 기여 추가적인 요인. dequenching의 기여로 인해 작은 부분 (여기 기재된 분석에서 산장 붕괴 및 편광 효과에 비해 일반적으로 경미 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) 지질의가 표시되어 있습니다. 융합시 신호의 증가는 시간과 비교하여 융합 세공 특성을 추론하도록 이용 될 수있다,1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, 지질이 실제 해제 시간에 지질 자유롭게 투과 구멍을 통해 탈출에 필요한, <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . 두 시간 스케일 비교할 경우, 세공 지질 흐름에 작은 저항을 제공한다는 결론을 내릴 수있다. 실제 박리 시간이 길어 확산 한정 릴리스 시간보다 크게된다면, 이것은 지질 방출을 지연, 예컨대 세공 플리커 등의 처리를 나타내는 것이다. 확산 제한 해제 시간, <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> 상기 정착 리포솜 및 지질 확산의 크기에 의존한다; 그 추정은이 두 가지 매개 변수를 정량화되어야​​합니다. 분석의 단일 분자 감도는 지질 확산이 모든 융합 이벤트 (26)에 대한 SBL에 자신의 출시 후 몇 번의 지질 형광을 추적하여 측정 할 수 있습니다. 모든 융합 소포의 크기(i) 단일의 지질 염색의 강도, SUV의 (ⅱ) 모든 형광체 융합시 SBL로 이송 된 후 도킹 부위 주위 총 형광의 변화, (ⅲ) 종래의 라벨 밀도를 조합하여 27을 추정 할 수있다 지질 및 (ⅳ) 지질 당 지역. 균일 SUV 크기 (44)를 가정하면 앞서 언급 한 바와 같이 많은 융합 이벤트의 실제 지질 방출 시간, 확산 조절 된 방출 (27)에 의해 기대되는 것보다 훨씬 더 느린 것으로 나타났다. 지질 출시의 지연을 가정하면 깜박임 기공 할 예정이다, 정량적 모델은 &quot;기공 개방&quot;의 추정을 할 수 있습니다, 시간의 비율 기공은 융합 27 일 동안 열려 있습니다. 마다 실용적는 지질 용해성 컨텐츠 라벨을 모두 사용하여 융합 메커니즘을 시험하는 것이 중요하다. 예를 들어, 지질 자료는 같은 SNARE 단백질 서라운드 t에 의해 지질 확산의 제한으로 기공 깜박임이 아닌 다른 프로세스에 의해 지체 될 수있다그는 기공. 이러한 경우라면, 그 후, 지질 라벨 분리에 선행 할 내용물의 방출 구멍 용해 프로브의 통과를 허용하기에 충분히 큰 제공된다. 접근 방식에서보다 근본적인 결함은 SBL에 표시된 지질의 전송이 대부분의 사전 융합 형태를 유지 한 소포에 SBL을 연결하는 좁은 융합 기공을 통해 발생하는 가정에있을 수 있습니다. 이전에 지질 자료 데이터 형 (29)을 기준으로 제안했다으로 SBL에 지질 전송도 수반와 융합 기공의 SBL 막에 SUV의 매우 빠른 붕괴의 급속한 팽창에서 발생할 수 있습니다. 모두 지질 모니터링과 내용을 동시에 출시, 많은 구멍이 모든 지질 레이블을 해제 한 후 재 밀봉 것을 발견, 그러나 그들의 가용성화물 (27)의 일부를 유지했다. 이것은 적어도 일부 리포좀은 SBL에 지질 염료 전송이 융합 기공을 통해 발생하는 융합 후 SBL로 축소하고,하지 않는 것을 나타냅니다. 또한, LIPID과 내용 릴리스는 지질 출시 지연은 기공 (45)을 둘러싼 SNARE 단백질에 의해 지질 확산의 방해하기 때문이라고이 가능성이있어 동시에 27 발생했습니다. 수용성 내용 자료를 모니터링하지 않은 SUV-SBL 융합 프로토콜은 이전에 Karatekin와 로스 (25)에 의해 출판되었다. 여기에, 최근 개발이 포함 지질, 즉 동시 모니터링 및 내용을 해제하고 SUV, 지질 및 융합 기공 특성 (27)의 추정됩니다. 프로토콜은 유리 커버 슬립 (25) 폴리 (디메틸 실록산)을 접합하여 이루어지는 미세 유체 세포 (PDMS) 엘라스토머 블록을 포함하는 홈을 제조하기위한 명령으로 시작한다. 다음에, 지질 및 콘텐츠 마커 모두 V-SUV 차량의 제조를 설명한다. 섹션 4 및도 5는, 주 대 도입은 미세 셀 조립 현장에서 SBLs을 형성하고, 결함 및 유동성을 검사하기위한 명령을 제공 할유동 세포 융합 이벤트의 검출에 UV를. 제 6 절은 데이터 분석에 대한 지침을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><강>시약</strong</td></tr><tr><td>>Milli-Q(MQ) 물</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 190 프루프</td><td>데콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>피셔 화학 A416P4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>콜라이드 나트륨(KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-하이드록시에틸] 피페라진-N'-[2-에탄술폰산] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>HEPES-KOH 완충액 (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &뮤; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td>유리병에 <td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>, 주의, PPE</td></tr><tr><td>메탄올</td> 착용 <td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>유리병에 주의, PPE</td></tr><tr><td colspan="4">Liposome preparation</td></tr><tr><td>Gastight Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>var. 크기는</td><td>용매가 있는 유리 sringe만 사용 (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>유리관 Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm 나사 캡 배양 튜브</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td> 철저히 <td>세척하고 클로로포름</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Lipids는 CHCl3에 용해되거나 밀봉된 바이알에 용해된 분말 형태로 제공됩니다. 개봉 시 부분 표본. -20 °C에서 불활성 분위기 하에서 건조 된 지질 필름으로 추가로 보관하십시오. -20 °C에서 CHCl3/MeOH (2:1, v/v)에 재고를 보관하십시오.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>위와 동일합니다.</td></tr><tr><td>1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850804</td><td>위와 동일.</td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (암모늄 염), Brain PI(4,5)P2</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046</td><td>위와 동일.</td></tr><tr><td>1,2-디올레올sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)(암모늄염), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>810145</td><td>위와 동일.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (암모늄 염), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>위와 동일.</td></tr><tr><td>콜레스테롤 (양모, >98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>위와 동일합니다.</td></tr><tr><td>DiD '오일; DiIC18 (5) 오일 (1,1'- 디옥타 데실 -3,3,3', 3'- 테트라 메틸 인도 디카르 보시아닌 과염소산염)</td> <td>분자 프로브</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>가열 수조 사용 지질의 Tm 이상</td></tr><tr><td>OG n-Octyl-&beta; -D-Glucopyranoside</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>-20 &deg에서 저장; C, RT로 오시기 전에</td></tr><tr><td>쉐이커 - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze 투석 카세트, 20k MWCO, 3&nbsp; ML</td><td>Life Technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 흡착제</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; 밀도 그라디언트 중간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리 튜브, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2&nbsp; ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti 로터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>분자 프로브</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&nbsp; 크로마토 그래피 컬럼, 2.5 &times; 10cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO 오렌지 단백질 젤 염색</td><td>분자 프로브</td><td>S-6650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 유리 페트리 접시, 150 x 20 mm, 커버 포함</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>구멍 펀처 - 재사용 가능한 생검 펀치, 0.75&nbsp; mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>수동 홀 펀칭 기계&nbsp;</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>드릴 .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN 코팅 라운드 펀치</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>드릴 직경 : 0.9 mm, 펀치 보어 크기 : 0.74 mm</td></tr><tr><td>Tygon Microbore 튜빙, 0.25 mm ID, 0.76 mm</td><td>OD Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0.010 "ID, 0.030"OD</td></tr><tr><td>실리콘 튜빙 (0.51 mm ID, 2.1 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0.020 "ID, 0.083"OD</td></tr><tr><td colspan="4">커버 유리 - 클린룸 청소</td></tr><tr><td>Schott Nexterion 커버 슬립 유리 D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF 설정 및 액세서리</td></tr><tr><td>IX81 현미경 본체</td><td>올림푸스</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD 카메라</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, 가열 현미경 스테이지</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1ml 해밀턴 유리 주사기 (4x)</td> <td>해밀턴</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

편광 tirf 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 snare 매개 퓨전

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

막 융합의 유비쿼터스 과정에서 융합 기공의 개방이 이전에 별도의 구획 사이의 첫 번째 연결을 설정합니다. 세포 외 유출을 통해 신경 전달 물질이나 호르몬 방출 동안, 융합 기공은 일시적으로 개폐 반복, 조절화물 방출 동역학 수 있습니다. 기공 역학은 소포 재생 모드를 결정하고; 과도, &#39;키스 앤 실행 &quot;을 융합 돌이킬 재 밀봉 결과, 반면 팽창 전체 융합에 연결됩니다. 더 나은 기공 역학을 지배하는 어떤 요인을 이해하기 위해, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 생화학 생체 시스템에서 잘 정의 된 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 막 융합을 모니터링 할 수있는 분석법을 개발했다. 퓨전의 형광 평면 이중층 베어링 t-올무와 V-SNARE 단백질 (V-포드 SUV)를 포함하는 작은 단일 층 소포를 표시, 부드러운 폴리머 쿠션에서 지원 (t-SBL, t 지원 이중층), 감시된다. 상기 분석은 SUV 차량의 일정한 밀도를 제공하면서 최소의 샘플 소비되도록 마이크로 유체 유동 채널을 사용한다. 융합 동안 SBL에 SUV에서 지질 라벨의 전송시 빠른 신호 향상을 악용, 지질 염료 전송의 반응 속도가 모니터됩니다. TIRF 현미경의 감도는 지질 확산 및 SUV 크기마다 융합 이벤트 추론 될 수있는 하나의 지질 형광 라벨을 추적 할 수 있습니다. 지질 염료 해제 시간은 영구적으로 열린 모공을 통해 방해받지 않고 통과를 위해 예상보다 훨씬 더 오래 할 수 있습니다. 지질 방출 위상차 플리커 기공에 기인 세공 &quot;개방&quot;세공 융합 동안 열려있는 시간의 일부를지지하는 모델을 사용하여 추정 될 수있다. 가용성 마커는 지질 및 가용성화물 릴리스의 동시 모니터링을위한 SUV 차량에 캡슐화 할 수 있습니다. 이러한 측정은 약간의 구멍이 용해화물의 일부를 잃은 후 다시 봉인 할 수 있습니다 나타냅니다.

SBL 품질 이 융합 실험 전에 SBL의 품질과 유동성을 확인하는 것이 중요하다. 미세 유체 채널의 바닥 유리 측의 형광 명백한 결함없이 균일해야한다. 기포가 채널에 통전하면, 일반적 SBL에 보이는 상처를 남긴다. 이러한 대규모 흉터 / 결함이있는 경우, 해당 채널을 사용하지 않는다. 때때로 포드 SUV는 기판에 부착하지만 연속 SBL 버스트 및 형성 실패 할 수 있습니다. 그 경우에는, 형광은 여전히​​ 매우 균일하게 보일 수 있지만, 소 영역 표백 후 복원하지 않을 것이다. 10 밀리미터의 Mg 2+ 소개 자주이 문제를 해결하는 데 도움이됩니다. 다른 제제는 기타 가의 양이온 (51), 고분자 용액 (52), 또는 삼투압 충격 (25)와 포드 SU...

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

본 분석의 전반적인 목표는 신경 및 엑소시토시스 SNARE 단백질에 의해 유도되는 개별 막 융합 사건을 관찰하여 신경전달물질 및 호르몬 방출의 기본 메커니즘을 이해하는 것입니다. 이 방법은 동적인 융합 공극(fusion pore)을 통해 화물 방출이 어떻게 일어나는지, 그리고 융합 후 공극의 운명은 어떻게 되는지와 같은 막 융합 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생화학적으로 정의된 환경 내에서 개별 사건에 대한 소포 결합(docking), 개방을 위한 융합, 그리고 화물 방출 역학의 뚜렷한 단계들을 관찰할 수 있다는 점입니다.이 방법은 엑소사이토시스(exocytosis)에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 감염 과정 중 외피 바이러스와 표적 세포막의 융합과 같은 다른 막 융합 반응에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 미세 가공부터 단백질 정제 및 이미징에 이르기까지 익혀야 할 단계가 많기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, 표준 포토리소그래피 기술과 여기에 제시된 템플릿을 사용하여 실리콘 마스터 몰드를 준비하십시오.다음으로, 일회용 플라스틱 컵에 PDMS base 100 milliliters와 경화제 10 milliliters를 넣고 혼합물을 잘 저어줍니다. 그다음 컵을 진공 데시케이터에 넣습니다. 진공을 가하되, 혼합물이 넘치지 않도록 주의 깊게 관찰하십시오.탈기 후, 탈기된 PDMS 혼합물을 유리 페트리 접시에 크게 한 방울 떨어뜨리고, 웨이퍼 아래에 기포가 갇히는 것을 방지하기 위해 템플릿 면이 위를 향하도록 몰드를 PDMS 위에 누릅니다. 이제 템플릿 위에 PDMS를 부어 폴리머 층의 두께가 5~8 mm가 될 때까지 덮어줍니다. 기포가 발생하면 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 제거합니다.PDMS로 덮인 템플릿을 오븐의 평평한 표면에 놓고 60 °C에서 3시간 동안 굽습니다. 그런 다음, 새 메스 날을 사용하여 성형된 채널 구조가 포함된 PDMS 블록을 잘라냅니다. 이때 잘라낸 블록이 커버슬립에 맞게 들어가야 함에 유의하십시오.다음으로, 채널 홈의 측면이 위로 향하게 놓은 후, 펀치를 사용하여 블록을 한 번의 연속적인 동작으로 뚫습니다. 8개의 구멍 위치에서 펀치로 뚫린 조각을 모두 제거했는지 확인하십시오. 작업이 완료되면 블록의 홈 부분이 깨끗한 알루미늄 호일 위에 닿도록 붙입니다.이제 튜브의 한쪽 끝이 약간 사선이 되도록 자른 후, 핀셋을 사용하여 펀칭된 구멍의 약 3분의 1 지점까지 튜브를 밀어 넣습니다. 튜브가 완충액 저장조와 시린지 펌프에 닿을 수 있도록 길이를 조절하여 자릅니다. 시린지 펌프의 시린지에 튜브를 연결하려면, 더 큰 실리콘 튜브를 짧게 잘라 한쪽 끝에 더 가는 튜브를 삽입합니다.이 즉시 사용 가능한 PDMS 블록은 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 먼저, 용해된 가스를 제거하고 융합 실험 중 미세유체 채널 내에 기포가 발생할 위험을 줄이기 위해 PDMS 블록을 최소 20분 동안 고진공 상태에 둡니다. 그다음, 현미경 스테이지 영역이 원하는 온도로 설정되었는지 확인하십시오.온도가 평형에 도달하는 동안, 소포 30 µL를 버퍼 60 µL로 희석하여 t-SNARE 단백질을 포함하는 NBD-PE 형광 표지 소단일층 소포 또는 단백질이 없는 대조군을 준비합니다. 그런 다음, 해당 용액을 3 mL 주사기에 흡입합니다. 주사기를 수직으로 세운 상태에서 시료 상단의 공기를 대부분 밀어냅니다.그 다음, 파라핀 필름을 사용하여 팁을 밀봉하고, 플런저를 아래로 당겨 진공 상태를 만듭니다. 진공 상태를 유지하면서 시린지 배럴을 톡톡 쳐서 용액의 탈기를 가속화합니다. 진공을 가했을 때 더 이상 기포가 발생하지 않을 때까지 이 과정을 몇 번 반복합니다.다음으로, 미세유체 튜브보다 직경이 약간 더 큰 피하 주사 바늘을 사용하여 마이크로원심분리 튜브 캡에 구멍을 뚫습니다. 탈기된 소단층 소포(small unilamellar vesicles)를 마이크로원심분리 튜브에 채우고, 이를 현미경 스테이지의 홀더에 장착한 후 용액이 설정된 온도에서 평형을 이룰 때까지 기다립니다. 깨끗한 커버 슬립을 플라스마 세척기에 넣고, 약 5분 동안 공기 플라스마 처리를 수행합니다.그 후, 커버 슬립을 제거하고 처리된 면이 위로 향하게 하여 쿠션 역할을 하는 보푸라기 없는 티슈 몇 장 위에 놓습니다. 다음으로, 패턴이 형성된 면이 아래로 향하도록 PDMS 블록을 커버 슬립 위에 올립니다. 핀셋을 사용하여 블록을 부드럽게 누르되, 유리가 깨지지 않도록 너무 세게 누르지 마십시오.조립된 플로우 셀을 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 그런 다음, 튜브를 소단층 소포(small unilamellar vesicle) 저장소와 시린지 펌프에 연결합니다. 용액이 채널을 완전히 채울 때까지 3 µL/min의 속도로 소단층 소포를 흡입하기 시작합니다.모든 채널의 용액이 출구 쪽 튜브를 따라 위로 이동하기 시작하면, 유량을 0.5 µL/min으로 줄이고 30~45분 동안 배양합니다. 플라스마 처리의 효과는 일시적이므로, 유리 커버슬립을 플라스마 처리한 후 채널로 SUV를 흘려보내기까지의 시간은 10분을 초과해서는 안 됩니다. 저배율 대물렌즈로 형광 이미징을 수행하여 채널에 누출이 있는지 확인한 다음, 탈기된 버퍼로 모든 채널을 헹구어 결합되지 않은 소포를 씻어냅니다.그 다음, TIRF 현미경 관찰을 위해 고배율 오일 침수 대물렌즈로 교체하고, 플로우 셀을 현미경 스테이지에 테이프로 고정합니다. 시야 조리개를 직경 약 40 µm로 좁히고, 노출 영역의 형광을 완전히는 아니지만 상당 부분 표백시키기 위해 소프트웨어를 사용하여 488 nm 여기광의 강도를 조절합니다. 표백되지 않은 NBD-PE 분자들이 유입되어 표백 전까지 일정 거리만큼 확산되므로, 노출 영역 중앙의 형광 강도는 가장자리보다 낮아야 합니다.하지만 표면 부착 SUV가 파열되지 않는 경우, 노출된 영역의 모든 형광체는 광퇴색되어야 합니다. 상태 측정 연구 결과를 검증하려면, 조명을 끄고 몇 분 후 다시 켜서 형광이 회복되었는지 확인하십시오. 재구성 완충액의 가스를 제거한 후, 이를 사용하여 v-SNARE 재구성 소단층 소포(small unilamellar vesicle) 스톡 용액을 희석하여, 결과적으로 60초 동안 시야 내에서 10~100회의 융합 이벤트가 발생하도록 하십시오.융합 사건이 너무 많으면 배경 형광이 증가하여 사건의 검출과 분석이 어려워집니다. 반대로 융합률이 너무 낮으면 통계적 유의성이 떨어질 수 있습니다. v-SNARE가 재구성된 소단일층 소포를 분당 2 µL의 유속으로 채널에 흘려보내고, 지질 혼합을 모니터링하기 위해 적절한 들뜸 및 방출 설정으로 전환하십시오.그 다음, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 TIRF 각도와 편광을 조정합니다. 561-nanometer 레이저를 사용하여 소포의 형광을 지속적으로 여기시키고 모니터링합니다. 소포가 유로 채널에 도달하여 지지 지질 이중층에 부착 및 융합됨에 따라, 배경 형광 신호가 축적되기 시작합니다.소프트웨어를 통해 들뜸 레이저 강도를 조절하여 배경 형광을 지속적으로 표백함으로써, 새로운 도킹 및 융합 사건을 쉽게 관찰할 수 있도록 합니다. 주어진 채널의 서로 다른 위치에서 여러 개의 동영상을 획득합니다. NBD-PE 형광을 확인하여 해당 위치의 지지 이중층에 결함이 없는지 검증합니다.상대적으로 결함이 없고 유동적인 t-SNARE 재구성 지지 지질 이중층에 대한 광퇴색 후 형광 회복 결과가 여기에 나타나 있습니다. NBD 표지 지질의 확산에 의한 형광 회복을 관찰하기 위해 낮은 광노출로 해당 영역을 이미징하였습니다. 지질 표지로부터의 형광만을 모니터링하는 것이 도킹 및 융합 사건을 관찰하기에 더 용이합니다.여기에 제시된 이미지 시퀀스에서는 18밀리초마다 프레임을 기록하였습니다. 융합이 일어나면 지질 표지물질이 지지 이중층으로 전이되어 융합 지점으로부터 확산됩니다. 어떤 경우에는 지질 혼합과 수용성 화물 방출을 동시에 모니터링하는 것이 바람직합니다.지질 혼합과 가용성 화물 방출이 동시에 일어나는 대표적인 사례가 여기에 제시되어 있습니다. 캡슐화에 사용된 고농도에서는 빨간색으로 표시된 가용성 성분의 형광이 초기에는 자체 소광(self-quenched) 상태입니다. 파란색으로 표시된 지질 형광의 급격한 증가는 앞서 보여준 지질 표지의 단색 모니터링과 마찬가지로 융합 사건으로 인한 지질 혼합을 나타냅니다.기공이 열리면서 수용성 함유 염료가 방출되고, 소포 내강에 있던 염료의 초기 자기소광 현상이 해제됩니다. 이는 빨간색으로 표시된 수용성 화물 신호의 증가로 이어집니다. 흥미롭게도, 화물의 형광은 안정적인 고원에 도달했습니다.이는 모든 지질 표지와 일부 수용성 화물을 방출한 후 기공이 다시 밀폐되었음을 나타냅니다. 마지막 단계에서 빨간색으로 표시된 수용성 함량 신호가 매우 빠르게 감소합니다. 이는 급격한 완전 융합 또는 리포좀 파열로 인한 것으로 보입니다.이 영상을 시청하신 후, t-SNARE 단백질로 재구성된 지지 지질 이중층으로 마이크로유체 유동 셀을 준비하는 방법과 TIRF 현미경을 사용하여 단일 소포 융합 사건을 관찰하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

snare-mediated-fusion-single-proteoliposomes-with-tethered-supported

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

우리는 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 막 퓨전 이벤트를 단정 지을 세포 융합 분석을 개발했습니다.

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

배우세요 편광 TIRF 현미경을 이용한 SNARE 매개 막 융합 단일 분자 관찰 기법입니다. 지지 이중층과 리포좀 간 융합 이벤트를 실시간으로 측정하여 막 융합 역학 및 화물 방출 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

더 많은 동영상 탐색