Name: 윌리스의 마우스 원을 분리하는 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 학습하세요 마우스 윌리스 원 분리 프로토콜을 통해 뇌혈관 구조를 보존하며 대혈관을 신속하게 분리하는 방법을. 이 기술은 알츠하이머병 및 뇌혈관 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 파리 VI 대학과 피에르 파브르 혁신 기금에 의해 지원되었다.

모든 절차가 동물 실험에 대한 로컬 윤리위원회 (일드 프랑스 - 파리 -위원회 승인 4270)의 승인, 관리 및 실험 동물의 사용을위한 유럽 공동체 표준에 따라 수행 하였다. 1. 마취 <ol><li> 펜토 바르 비탈을 치사량을 주입 성인 마우스에 복강 내 (27 게이지 바늘 및 주사기를 1ml) (1 밀리그램 / 10g 체중까지) 수술 전. </li></ol> 2. 선박 관류 참고 : 혈관 재관류 동안 눈에 수의사 연고를 적용 할 필요가 없습니다. 이 절차는 (5-10 분) 신속하고 동물의 죽음에 끝납니다. 발가락 핀치와 응답의 부족을 확인합니다. <ol><li> 홍채 가위를 사용하여, 바로 흉곽 아래, 복벽과 복막에 약 4cm 길이 절개를합니다. </li><li> 연속 주 후 진동판에 작은 절개 (밀리미터 길이)를 확인하고전자 흉곽의 전체 길이를 따라 진동판의 절개은 흉강을 노출. </li><li> 멀리 흉골을 들어 올리고 지혈과 흉골의 끝 부분을 고정; 목에 지혈을 배치합니다. 조심스럽게 심장으로 흉골을 연결하는 지방 조직을 잘라. </li><li> 마음의 꼭대기에 좌심실을 통해 15 게이지 관류 바늘을 전달합니다. </li><li> 마지막으로, 출구를 만들기 위해 간 로브 중 하나를 잘라 가위를 사용합니다. 참고 : 또 다른 출구는 우심방에 절개를 만들 홍채 가위를 사용하여 만들 수 있습니다. </li><li> 2.5 ㎖ / 분의 속도로 작동하는 펌프를 인산 완충 용액 (PBS) 25 내지 50 ㎖로 동물을 관류. 간은 혈액으로 희게은 PBS로 교체해야합니다. </li><li> 간에서 유체가 완전히 명확하면 약 5 분 후, 재관류를 중지합니다. </li><li> 면역 염색 또는 일반 계획되는 경우, 파라 포름 알데히드의 50 mL로 동물 관류(PFA 4 PBS의 %) 15 분. 참고 :주의, PFA 연기는 독성. PFA와 동물의 재관류는 통풍이 흄 후드에서 수행되어야한다. </li></ol> 3. 뇌의 분리 및 윌리스의 원 <ol><li> 뇌의 분리 <ol><li> 수술 가위로 머리를 제거합니다. </li><li> 코에 목으로부터 피부를 따라, 홍채 가위와 정중선 절개를합니다. </li><li> 두개골을 노출하고 홍채 가위로 남아있는 근육과 지방 조직을 제거하는 피부를 낸다. </li><li> 한쪽 난원 매그넘에 홍채 가위의 날카로운 끝을 놓고 신중하게 (또한 외이도로 알려진) 외부 청각 (外耳道)에 두개골의 내부 표면을 따라 그들을 밀어 넣습니다. </li><li> 반대편 측면에 3.1.4에 설명 된 절개를 재현하고 시상 봉합의 시작에 간 정수리 뼈의 내부 표면을 따라 잘라 중간 선을합니다. </li><li> 조리개를 심고정면 뼈의 위, 오른쪽 눈 사이, 시상 봉합에서 다음 두 두개골을 분할을 엽니 다. </li><li> 후각 전구를 잡아와 복부 표면의 신경 연결을 차단하기 위해 홍채 가위를 사용하여 뇌를 들어 올립니다. </li><li> 뇌를 제거하고 소 분리를 위해 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 60 mm 페트리 접시에 넣습니다. 완전히 PBS의 뇌를 체험. 뇌가 4 % PFA로 고정 된 경우 (이후 절편 및 면역 염색 또는 일반 염색 용), 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 목욕에 보관합니다. </li></ol></li><li> 윌리스의 원의 분리 참고 : 해부 현미경이 암소 격리 필요합니다. 뇌는 전체 과정에 걸쳐 4 ° C에서 보관해야합니다. <ol><li> 소를 시각화하기 위해 거꾸로 (즉, 그것의 등쪽 표면에) 뇌를 넣습니다. </li><li> (후각 엽의 기지에서 전방 대뇌 동맥 (ACA)을 잡기 위해 작은 집게를 사용하여 <str옹&gt;을, 그림 1)과 발휘 압력 용기의 연속체에서 그들을 해리합니다. B의 중간 대뇌 동맥 (MCA) (그림 1) 잘라 동일한 절차를 사용합니다. </li><li> 피질에서 소를 형성하는 주요 동맥을 들어 올려 제거 포셉의 날카로운 끝을 사용합니다. </li><li> 포셉과 중간 대뇌 동맥 (MCA)을 파지하여, 뇌에서 분리하는 사후 통신 동맥 (PCA)의 시작을 올립니다. 전방 동맥 (ACA 및 MCA)를 선택하고 전방-등의 방향으로 광학 chiasm에 걸쳐 부드럽게 잡아 당깁니다. 암소의 중단을 방지하기 위해, 다른 혈관을 처리하는 절차를 중단. </li><li> 반복은 dorsal-에서 그들을 당기는 / (PCA) (C, 그림 1)과 기저 동맥 (BA) (D, 그림 1)에 대한 3.2.2와 우수한 후방 소뇌 동맥 (SCA) 3.2.3 단계 전방 방향. 기재된 절차 I의 끝에서 중지n은 3.2.4. </li><li> 포셉 부드럽게 당겨 전체 소를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 찬 60 mm 페트리 접시에 소를 넣고 작은 핀 곳에서 소를 잡고, 두 집게로 남아있는 부착 된 뇌 조직을 제거합니다. </li><li> 또는 단백질 추출 - 다음 RNA 정화 처리 (약 500 ng의 RNA 추출 수율 RNA 많은 양의)에 대한 -80 ° C에서 수확 암소 보관하십시오. 참고 : 소는 격리 된 마우스 후각 동맥 위해 개발 된 장기 목욕 시스템을 적용하여, 24 시간 동안 생체 유지 될 수있다 (7). </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> 그림 1 : 마우스 뇌 젖소를 강조 암소가 두 개의 전방 대뇌 동맥 (ACA)에서 파생 된 두 개의 내부 경동맥 동맥 (MCA)로부터 형성된다의 복부보기의 회로도;. 뇌 바닥동맥 (BA) 후부 (PCA)과 우수 (SCA)에 분기 대뇌 동맥, 두 개의 척추 동맥 (VA).

<ol><li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li>
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우리는 윌리스의 원의 분리 여기를 재현 프로토콜을 설명합니다. 소를 포함하는 가장 일반적인 뇌 혈관 질환은 동맥 혈관의 벽에 영향을 모두 CAA 관련 vasculopathies, 두개 내 동맥 경화 및 두개 내 동맥류이다. 위험 인자로 잘 알려져 있지만, 이들 뇌 질환의 분자 기전은 잘 알려져 있지 남아 그 발생을 예측하기위한 특정한 생물학적 마커는 부족하다. 분자 변화를 거시적 인 관찰을 연결하는 형질 전환 마우스에서 소를 분리하는 방법에 상당한 관심이있다. 예를 들어, (호사카 등. (8)에 의해 설명 됨)는 특정 유전자가 녹아웃 된 마우스 모델에서 일관된 동맥류 유도 및 젖소를 분석함으로써, 치료 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 대상 여부를 판단 할 수 있어야한다있을 두개 내 동맥류 및 / 또는 지주막 하 출혈을 방지한다. Obviou교활한,이 방법은 AD의 다양한 형질 전환 마우스 모델에서 CAA 관련 vasculopathies의 진행에서 특정 약물의 효과를 분석하기 위해 사용될 수있...

또한 윌리스 (소), Willisor 윌리스 다각형의 루프의 원형으로 알려진 대뇌 동맥 원 (circulus 동맥 뇌종양은)) 먼저 그것은 시신경 chiasma 수 있습니다 시상 하부의 주위에있는 순환 문합 인 1664 년 토마스 윌리스에 의해 설명되었다 뇌와 주변 구조에 혈액을 공급하는 중앙 허브로 간주 될 수있다. 혈액 경동맥 및 척추 동맥을 통해 이러한 구성에 진입하며 내부 중간 및 후방 뇌동맥 통해 원 밖으로 흐른다. 이러한 동맥의 각각은 원호의 양측에 지점을 좌우되었다. 완전한 원을 동맥을 통신하는 기저, 포스트 소통하고, 전방 (그림 1과 그림 2). 유출 동맥 중 어느 하나에 장애가 혈류 위험함으로써 충분한 혈액이 (B)에 공급되도록 보장 경동맥 및 뇌동맥으로부터 원 입력 피 병합하여 최소화비. 이 구조는 내부 경동맥 폐색 심각한 질병에 부수적 혈류의 주요 경로로서 기능한다. 뇌 혈관 질환의 여러 유형의 소에서 자신의 기원을 가지고있다. 가장 일반적으로는 1, 2, 3이 질환으로 인한 혈관 확장에 관류 저하로 이어질 수있다. 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA) -associated vasculopathies, 두개 내 죽상 경화증 및 두개 내 동맥류하고, 뇌내 및 / 또는 지주막 하 출혈 궁극적 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중 또는로 변환 기껏해야 일시적 허혈성 발작. 아마도 조영술 결합 뇌 영상을 포함한 진단 절차에서의 최근 발전은 뇌 생검 없이도 가능 임상 이러한 주요 뇌 혈관 질환을 진단 만들었다. 그럼에도 불구하고, 효과적이고 특이 치료 (약물 또는 혈관)이 현재 부족과 새로운 정의 필요하다분자 표적. 인간에서 이들 질환의 예방을위한 신규 약물 표적의 식별은 동물 모델 및 소를 포함하는 뇌 - 혈관을 분리하는 방법이 필요하다. 이러한 모델은 두개 내 동맥 동맥류, CAA 또는 두개 내 동맥 경화증의 동물 모델에서 큰 혈관의 벽에 발생하는 염증을 포함하는 특정 변경에의 증거와 단서를 제공해야한다. 4, 5, 6 우리는 CAA와 같은 알츠하이머 질환에서 혈관 염증의 연구 (AD) 및 관련 질병을 촉진하기 위해 마우스 암소 분리하는 방법을 설립했다. 마우스 암소를 분리하는이 방법은 질병 진행 동안 뇌 염증 유전자 발현의 평가를 위해 개발되었다. 함께 leptomeningeal 및 pial 동맥의 벽 내에서 아밀로이드 베타 침착의 검출과,이 방법은 쉽게 저지 할 만들 수내 염증성 뇌 - 혈관 벽에 유전자 발현 및 Aβ 펩타이드의 축적 사이의 가능한 관계. 지주막 하 공간에 leptomeningeal 및 pial을 포함하는 뇌의 혈관 네트워크는 윌리스의 원을 형성하는 큰 동맥의 확장입니다. 여기서 설명한 방법은 임의의 마우스 계통의 암소를 분리하는 데 사용될 수 있고, 마우스 뇌 - 혈관의 대형 선박의 스크리닝 (예를 들어, 유전자 발현, 단백질 생산 및 번역 후 단백질 변형)의 모든 유형에 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염</td><td>수 시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>경화 파인 아이리스 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>가위 - 스트레이트 / 샤프 / 샤프&nbsp; &nbsp; 16.5 cm</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b 펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>입체 줌 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND 표면 60mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프 - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 1992</td><td></td>년 3월</tr></tbody></table>

윌리스의 마우스 원을 분리하는 프로토콜

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

윌리스 (COW)의 대뇌 동맥 원 (circulus 동맥 뇌종양) 또는 원은 뇌와 주변 구조에 혈액을 공급하는 광학 chiasma 및 시상 하부를 둘러싸는 순환 문합이다. 이는 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA) -associated vasculopathies, 두개 내 죽상 경화증 및 두개 뇌 동맥류 등 여러 질병에 관여하고있다. 자신의 예방을위한 새로운 약물 표적의 식별을 위해 이러한 질병의 기초가되는 분자 메커니즘의 연구는 동물 모델을 필요로한다. 다른 사람들이 여기에 설명 된 CoW.The 방법 임의의 마우스 계통의 소 분리에 적합하며 (유전자, 단백질 생산의 발현을 선별하기위한 상당한 잠재력을 가지고 포함하는 뇌 - 혈관의 분리를 포함하는 반면 이러한 모델 중 일부는, 형질 전환 될 수있다 번역 후 단백질 수정 등 secretome 분석) 마우스 cerebro-의 대형 선박에 대한 연구혈관. 또한 절연 마우스 후각 동맥 위해 개발 기관 욕 시스템을 적용하여, 생체 외 연구에 사용될 수있다.

<html> PBS를 관류 마우스를 살해하고 프로토콜의 3.2 절에 설명 된대로 소는 격리됩니다. 해부가 제대로 수행 될 때, 소는 한 조각에서 와야 인해 혈관에 잔류 혈액의 부재로 약간 투명해야한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> 그림 2 : 분리 후 마우스 소. 10 cm 페트리 접시에서 암소의 (A) 개요. (B) 암소의 여러 가지의 세부 사항. MCA는 중간 대뇌 동맥를 들어, ACA 기저 동맥에 대한 전방 대뇌 동맥, BA를 들어, PCA 후부 대뇌 동맥과 우수한 뇌 동맥에 대한 SCA에 대해. <a href="http://ecsource.jo...

여기서는 Willis의 마우스 서클을 분리하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다.

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

본 해부 절차의 전반적인 목표는 마우스의 뇌혈관계를 구성하는 대혈관 연구를 용이하게 하기 위해 마우스의 윌리스 서클(circle of Willis)을 분리하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병 및 뇌 아밀로이드 혈관병증과 같이 뇌혈관에 영향을 미치는 다양한 질환에서 뇌혈관 유전자 발현 연구의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 혈관 구조를 변경하지 않고도 대혈관을 빠르고 쉽게 분리할 수 있다는 점입니다.치명적인 용량의 마취제를 투여한 마우스의 흉곽 바로 아래 복벽과 복막에 Iris 가위를 사용하여 4 cm 길이의 절개를 하며 시작합니다. 다음으로, 횡격막에 수 mm 길이의 절개를 가한 뒤, 흉곽 전체 길이를 따라 절개를 계속하여 흉강을 노출시킵니다. 흉골을 들어 올리고 끝부분을 지혈鉗(hemostat)로 고정한 후, 지혈鉗를 목 부분에 걸쳐둡니다.그 다음 흉골과 심장을 연결하는 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 이제 15-gauge 관류 바늘을 좌심실을 통해 심장 첨부로 통과시키고, 가위로 간엽 중 하나를 절개하여 관류액이 배출될 통로를 만듭니다. 2.5 mL/min의 펌프 속도로 약 10분 동안 25 내지 50 mL의 PBS로 동물을 관류합니다.혈액이 PBS로 대체됨에 따라 간이 하얗게 변해야 합니다. 간에서 나오는 액체가 완전히 투명해지면 관류를 중단하십시오. 뇌를 분리하려면 아이리스 가위(Iris scissors)를 사용하여 목부터 코까지 피부를 따라 정중선 절개를 실시하십시오.Iris 가위로 피부를 잘라내어 두개골을 노출시키고 잔여 근육과 지방 조직을 제거합니다. 다음으로, Iris 가위의 끝을 대후두공의 한쪽 면에 넣고 두개골의 내면을 따라 외이도까지 조심스럽게 미끄러지듯 절개합니다. 대후두공의 반대편에도 비슷하게 절개한 후, 두정간골의 내면을 따라 정중선 절개를 하여 시상봉합 시작점까지 진행합니다.닫힌 Iris 가위를 양 눈 사이 전두골의 시상 봉합에 삽입하고, 가위날을 벌려 두개골을 두 갈래로 분리합니다. 포셉을 사용하여 후각 구를 잡고, Iris 가위로 뇌의 복측 표면에 있는 신경 연결 부위를 절단합니다. 그런 다음 뇌를 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 60 millimeter 페트리 접시에 담급니다.Willis 환을 분리하려면, 해부 현미경 아래의 아이스 팩 위로 배양 접시를 옮기고 뇌를 등쪽 표면이 위로 오도록 돌려 Willis 환을 시각화합니다. 소형

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스 맥락막신경총에서 면역 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 절차는 맥락막신경총의 면역 세포가 뇌 건강과 다양한 신경 질환에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 위한 신경 면역학 연구에 사용됩니다.

Isolating Immune Cells from Mouse Choroid Plexuses

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

여기에 제시된 것은 미생물 기반 방법 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 후속 식별을 통해 독특한 눈 면봉 및 배양 기반 농축 단계를 사용하여 호기성 및 학부성 혐기성 마우스 결막 성 세균의 격리 및 증폭을 위한 프로토콜이다.

마우스의 결막 장금 격리 및 식별

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

학습하세요 마우스 윌리스 원 분리 프로토콜을 통해 뇌혈관 구조를 보존하며 대혈관을 신속하게 분리하는 방법을. 이 기술은 알츠하이머병 및 뇌혈관 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

윌리스의 마우스 원을 분리하는 프로토콜

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