윌리스의 마우스 원을 분리하는 프로토콜

이 해부 절차의 전반적인 목표는 쥐의 뇌혈관 구조의 큰 혈관에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 Willis의 쥐 서클을 분리하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병 및 뇌 아멜로이드 혈관병증과 같은 대뇌 혈관에 영향을 미치는 다양한 질병에서 뇌혈관 유전자 발현 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 용기 구조를 변경하지 않고 대형 용기를 빠르고 쉽게 격리할 수 있다는 것입니다.

먼저 홍채 가위를 사용하여 치명적으로 마취된 쥐의 흉곽 바로 아래에 있는 복벽과 복막을 4cm 길이로 절개합니다. 다음으로, 횡격막을 몇 밀리미터 길이로 절개하여 흉곽 전체를 따라 절개를 계속하여 흉강을 노출시킵니다. 흉골을 들어 올리고 지혈기로 끝을 고정하고 지혈을 목에 놓습니다.

그런 다음 흉골과 심장을 연결하는 지방 조직을 조심스럽게 다듬습니다. 이제 15게이지의 풍량 주삿바늘을 좌심실을 통해 심장의 정점으로 통과시키고 가위를 사용하여 간엽 중 하나를 잘라 관류액을 배출할 배출구를 만듭니다. 약 10분 동안 분당 2.5밀리리터의 펌프 속도로 25-50밀리리터의 PBS를 동물에게 관류시킵니다.

혈액이 PBS로 대체됨에 따라 간이 희어져야 합니다. 간에서 나오는 액체가 완전히 맑아지면 관류를 중단하십시오. 뇌를 분리하려면 홍채 가위를 사용하여 목에서 코까지 피부를 따라 정중선을 절개합니다.

홍채 가위로 피부를 잘라내어 두개골을 드러내고 남아 있는 근육과 지방 조직을 제거합니다. 다음으로, 홍채 가위의 끝을 대공의 한쪽에 놓고 두개골 내부 표면을 따라 끝을 외부 청각 고기로 조심스럽게 밀어 넣습니다. foramen magnum의 반대쪽도 유사한 절개를 한 다음 두정골의 내부 표면을 따라 시상 봉합사의 시작 부분까지 정중선을 절단합니다.

닫힌 홍채 가위를 시상 봉합사의 눈 사이의 전두골에 심고 칼날을 열어 두개골을 둘로 나눕니다. 집게를 사용하여 후각구를 잡고 홍채 가위를 사용하여 뇌의 복부 표면에 있는 신경 연결을 차단합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS의 60mm 페트리 접시에 뇌를 담그십시오.

윌리스의 원을 분리하려면 해부 현미경으로 접시를 얼음 팩에 옮기고 뇌를 등쪽 표면으로 돌려 윌리스의 원을 시각화합니다. 작은 겸자를 사용하여 후각엽 기저부의 전방 대뇌 동맥을 잡고 압력을 가하여 혈관 연속체에서 동맥을 분리하십시오. 같은 방법으로 중추 동맥을 절단한다.

그런 다음 겸자의 날카로운 끝을 사용하여 중간 대뇌 동맥을 잡고 후방 통신 동맥의 시작 부분을 들어 올려 뇌에서 두 세트의 동맥을 분리하십시오. 다음으로, 전방 동맥을 들어 올려 전방 등 방향으로 시신경 위로 부드럽게 당깁니다. 같은 방법으로 상소뇌동맥과 후소뇌동맥을 제거한 다음 기저동맥을 변위시킵니다.

마지막으로, 집게를 사용하여 윌리스의 원 전체를 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 부드럽게 옮기고, 두 개의 집게를 사용하여 남아 있는 뇌 조직을 조심스럽게 제거한 후 작은 핀으로 혈관을 제자리에 고정합니다. 윌리스의 원은 한 조각으로 나와야 하며, 혈관 조직에 잔류 혈액이 없기 때문에 약간 투명해야 합니다. Willis의 클린 서클은 Smooth Muscle Actin, Smooth Muscle-Myosin Heavy Chain 및 Smoothelin과 같은 혈관 평활근 세포 마커를 구체적으로 발현해야 합니다.

대조적으로, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 또는 미세소관 관련 단백질 2(microtubule-associated protein 2)와 같은 뉴런 마커는 윌리스(Willis)의 서클에서만 거의 검출할 수 없어야 합니다. 또한, Willis 신경 조직의 비원에서 내피 마커 E-Selectin의 발현은 Willis 샘플의 원에서 얻은 것과 매우 유사하며, 이는 뇌-모세혈관 네트워크의 존재를 반영하는 것일 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 쥐의 대뇌 혈관은 매우 미세하고 쉽게 부러진다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 해부는 서두르지 않고 매우 조심스럽게 수행하여 전체 구조물이 한 조각으로 수확되도록 해야 합니다. 개발 후 이 기술은 염증성 신경 질환 분야의 연구자들이 알츠하이머병 및 뇌 아밀로이드 혈관병증과 같은 관련 질병의 마우스 모델에서 뇌혈관 장애를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 Willis 원을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.