Name: 전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 전기 및 자기장을 이용한 1차원 및 2차원 신경 세포 배양 자극 기법을 통해 신경 흥분 매개변수를 측정하고 뇌 자극 메커니즘을 연구하는 방법을 익히세요.

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저자는 매우 도움이 토론 오퍼 펜어맨, 프레드 울프, 메나헴 시걸, 안드레아스 니프과 에이 탄 Reuveny 감사합니다. 저자는 기술의 초기 버전을 개발 일란 브레스킨와 조르디 소리아노 감사합니다. 저자는 이론적 인 개념에 도움을 트비 틀러스티와 장 피에르 에크 만 감사합니다. 이 연구는 미네르바 재단, 과학 기술, 이스라엘의 교육부와 이스라엘 과학 재단 보조금 1320년에서 1309년까지과 양성 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 교부금 2,008,331에 의해 지원되었다.

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

1D 패턴은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있는 중요한 도구입니다. 예를 들어, 우리는 신경 세포의 배양 물 (29)로부터 논리 게이트를 생성하고 최근 래트 해마 뉴런 5 Chronaxie 및 Rheobase를 측정하고, 상기 비교 다운 증후군 해마 뉴런 소성 활동 신호 전파 속도의 감속을위한 1 차원 패턴을 사용한 야생형 (WT) 해마의 뉴런 (27). 1 차원 패터닝 제안 된 프로토콜은 강력한이며 원하는 패턴을 형성하기 쉽다. 우리는 측정의 기능에 영향을 미칠 수있는 네트워크의 가능한 모든 단선, 알고 있어야하기 전에 1D 문화를 관찰하는 것이 좋습니다. 신경 구성 화학 패터닝은 유서 30, 31, <sup class="x...

신경 세포와 외부 전기장 사이의 상호 작용은 근본적인 의미뿐만 아니라 실제 사람이있다. 이 외부인가 전계 조직을 자극 할 수있는 볼타 시대부터 알려져 있지만, 뉴런에서 얻어진 활동 전위의 제조를 담당하는 기전은 최근 4 3 2 1 풀어되기 시작한다. 이 전기장 2, 5에 응답하는 신경 세포의 막전위의 탈분극, 막 특성 및 이온 채널의 역할, 심지어 지역을 유발하는 메커니즘에 관한 질문에 대한 답을 찾는 포함되어 있습니다. 신경 자극 6, 7, 8, 9, 치료 <sup10 가지 방법론은이 정보에 특히 의존하며, 이는 고통받는 지역을 대상으로하고 치료 결과를 이해하는 데 중요 할 수 있습니다. 이러한 이해는 또한 치료 프로토콜과 뇌의 다른 영역을 자극하기위한 새로운 접근법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생체 내 뇌 에서 의 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 이해에 중요한 요소를 추가하지만, 두개골 내 측정의 부정확성과 낮은 제어 가능성으로 인해 방해 받는다. 대조적으로, 배양 물에서의 측정은 고정밀, 우수한 신호 대 잡음 성능 및 고도의 재현성 및 제어로 대량으로 용이하게 수행 될 수있다. 문화를 사용하여 집단 네트워크 행동의 다양한 연결 특성을 밝혀 낼 수 있습니다 11 , 12 , 13 , 14 , </sup&gt; 15, 16. 마찬가지로,이 또한 제어 시스템 optogenetically 활성 뉴런 17, 18의 광 자극 동안의 채널 개구부 (19)가 활동 전위를 생성 할 책임이 방법, 예를 들면 다른 자극 방법이 작동하는 메커니즘을 해명에 매우 효율적일 것으로 예상된다. 여기에 초점을 효율적으로 외부 전기장을 통해 신경 세포를 자극 수있는 도구의 개발과 이해를 설명에 있습니다. 본 연구에서 우리는 하나 차원 배양 상이한 구성 및 목욕 전극에 의해 직접인가 전계의 방향 및 2 차원의 마지막 자극을 이용하여 자극, 2 차원 일차원 패터닝 해마 배양의 제조를 설명하고 패터닝 시변 전기장을 유도하는 자기장을5, 20, 21.

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8054</td><td>네트워크 연결을 끊습니다. 섹션 2.4.2</td></tr><tr><td>B27 supp</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td> 도금 매체에 언급되어 <td>있습니다. 섹션 1.1.1</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14343</td>에서 언급 : <td>네트워크 연결을 끊습니다. 섹션 2.4.2</td></tr><tr><td>붕사(사붕산나트륨 12수화물)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>붕산염 완충액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.2</td></tr><tr><td>붕산</td><td>Frutarom LTD</td><td>5550710</td><td>붕산염 완충액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.2</td></tr><tr><td>CaCl2 , 1 M</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>21098</td><td>세포외 기록 솔루션. 섹션 1.5.2</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td>에서 언급: <td>네트워크 연결을 끊습니다. 섹션 2.4.2</td></tr><tr><td>COMSOL</td><td>COMSOL Inc</td><td>Multiphysics 3.5</td> 수치 시뮬레이션에서 언급되었습니다<td>. 섹션 3.5.2</td></tr><tr><td>D-(+)-포도당, 1M</td><td>시그마-알드리치</td><td>65146</td><td>도금 매체, 세포외 기록 용액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.1 및 1.5.2</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>세포 배양에 언급되어 있습니다. 섹션 1.2.4 및 1.2.6</td></tr><tr><td>FCS(FBS)</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td> 도금 매체에 언급되어 <td>있습니다. 섹션 1.1.1</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td> Bio Coating에 언급되어 <td>있습니다. 섹션 1.2.6</td></tr><tr><td>Fluo4AM</td><td>Life technologies</td><td>F14201</td><td>Imaging of spontaneous or evoked activity(자발적 또는 유발 활동의 이미징)에서 언급됨. 섹션 1.5.1, 1.5.3 및 1.5.5</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>매체 변경에 언급되어 있습니다. 섹션 1.4.1</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에 언급되어 있습니다. 섹션 1.1.1</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에서 언급됨. 섹션 1.1.1</td></tr><tr><td>Hepes, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>세포외 기록 솔루션에 언급되어 있습니다. 섹션 1.5.2</td></tr><tr><td>HI HS</td><td>BI</td><td>04-124-1A</td><td>도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에 언급됨. 섹션 1.1.1, 1.4.1 및 1.4.2</td></tr><tr><td>KCl,&nbsp; 3 M</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td>세포외 기록 솔루션에서 언급되었습니다. 섹션 1.5.2</td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2020</td><td>바이오 코팅. 섹션 1.2.6</td></tr><tr><td>MEM x 1</td><td>Gibco</td><td>21090-022</td><td>도금 매체, 매체 변경, 최종 매체에 언급됨. 섹션 1.4.1에서 언급됨&nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.4.2</td></tr><tr><td>MgCl2, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>세포외 기록 솔루션. 섹션 1.5.2</td></tr><tr><td>NaCl, 4 M</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td>세포외 기록 용액에서 언급되었습니다. 섹션 1.5.2</td></tr><tr><td>Octadecanethiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01858</td><td>Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures)에 언급되어 있습니다. 섹션 1.2.3</td></tr><tr><td>Pluracare F108 NF Prill</td><td>BASF Corparation&nbsp에서</td> 언급됨;<td>50475278</td><td>생물 거부 코팅, 생물 코팅. 섹션 1.2.4 및 1.2.6</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.01% 용액에서 언급됨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; P47075</td><td>세포 분열을 촉진합니다. 섹션 1.1.4</td></tr><tr><td>자당, 1M</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1888</td><td>세포외 기록 용액에 언급되어 있습니다. 섹션 1.5.2</td></tr><tr><td>Thiol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1858</td><td>바이오 거부 코팅. 섹션 1.2.3</td></tr><tr><td>URIDINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>매체 변경에 언급되어 있습니다. 섹션 1.4.1</td></tr><tr><td>스퍼터링 머신</td><td>AJA International, Inc</td><td>ATC Orion-5Series&nbsp;</td><td>얇은 금속 층으로 유리를 코팅합니다. 섹션 1.2.2</td></tr><tr><td>펜 플로터&nbsp;</td><td>휴렛 팩커드&nbsp;</td><td>HP 7475A</td><td>코팅된 커버슬립에 패턴을 에칭합니다. 섹션 1.2.5 전극 전선에 언급</td></tr>됨<tr><td>&nbsp;</td><td>AM Systems, Carlsborg WA</td><td>767000</td><td>신경 세포 배양의 전기 자극. 섹션 2.1, 2.2, 2.3 및 2.4.5</td></tr><tr><td>신호 발생기</td><td>BKPrecision</td><td>4079</td><td>전기 신호의 형성에 언급되어 있습니다. 섹션 2.3</td></tr><tr><td>Ampliifier</td><td>Homemade</td><td></td><td>Voltage 신호 발생기에서 전극으로의 신호 증폭. 섹션 2.3</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td> 매트릭스에서 언급됨<td>&nbsp;</td><td>MPS-3005 LK-3&nbsp;</td><td>스퍼터링 기계에 전원 공급 장치. 섹션 1.2.2.3</td></tr><tr><td>Transcranial magnetic stimulation</td><td>Magstim, Spring Gardens, UK</td><td>Rapid 2</td><td>Magnetic stimulation of neuronal culture에서 언급됨. 섹션 3.1, 3.3 및 3.4</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Cognis</td><td>Versamid 140</td><td>수제 코일의 주조에 언급되어 있습니다. 섹션 3.4</td></tr><tr><td>에폭시</td><td>쉘</td><td>EPON 815&nbsp;</td><td>수제 코일의 주조. 섹션 3.4</td></tr><tr><td>백금 와이어 0.005 ''두께에 언급됨; A-M 시스템,&nbsp;</td><td>&nbsp; 워싱턴주 칼즈버그</td><td>&nbsp; 767000</td><td>신경 세포 배양의 전기 자극. 섹션 2.1</td></tr><tr><td>원형 자기 코일</td>에서 언급 : 신경 배양의 <td>수제</td><td></td><td>자기 자극. 섹션 3.3</td></tr><tr><td>WaveXpress SW</td> B&에서 언급됨<td>; K 정밀&nbsp;</td><td></td><td>파형 편집 소프트웨어. 섹션 2.1.32</td></tr><tr><td>Xion Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>Sensitive EMCCD 카메라에서 언급되었습니다. 섹션 2.4.4에 언급되어 있습니다.</td></tr></tbody></table>

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

뉴런은 멤브레인 전위가 특정 임계 값을 초과 할 때 활동 전위를 발화시킵니다. 뇌의 전형적인 활동에서, 이것은 시냅스에 대한 화학 물질 투입의 결과로서 발생합니다. 그러나 뉴런은 부과 된 전기장에 의해 흥분 될 수도 있습니다. 특히 최근의 임상 응용은 외부에서 전기장을 만들어 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서 신경 세포가 외부 장에 어떻게 반응하는지 그리고 활동 잠재력을 유발하는 원인을 조사하는 것이 중요합니다. 다행히도, 외부 전기장의 정밀하고 제어 된 적용은 배양에서 절제되고, 해리되고 성장되는 배아 신경 세포에 대해 가능하다. 이를 통해 매우 재현 가능한 시스템에서 이러한 질문을 조사 할 수 있습니다. 이 논문에서는 신경 세포 배양에 외부 전계의 제어 된 적용을 위해 사용되는 기술의 일부가 재검토된다. 네트워크는 1 차원 일 수 있으며, 즉 선형으로 패턴 화 될 수 있습니다R 양식 또는 상기 기판의 전체면 상에 성장시키고, 따라서 이차원. 또한, 음원은 유체 (욕 전극) 또는 자기 펄스 원격 생성을 이용하여 전계를 유도하여 침지 전극을 통하여 전계를 직접 애플리케이션에 의해 생성 될 수있다.

제시된 프로토콜은의 연결 문화의 쉬운 patterning 수 있습니다. 우리가 자극을 위해 개발 한 여러 가지 방법과 결합되면 Chronaxie 및 Rheobase 5 와 같은 일부 고유 신경 세포 특성을 측정하고 건강한 사람과 질병이있는 뉴런의 특성을 비교하고 문화를 자극하는 최적의 방법을 찾기 위해 사용할 수 있습니다. 그들의 구조와 더 많은 새로운 접근 방식을 제공합니다. 몇 가지 예가 다음 그림에 나와 있습니다. 그림 3 은 1D 패턴 구성은 바이오 거부 레이어로 에칭된다. 약 170 μm 너비의 얇은 선은 전형적으로 다양한 반경 ( 그림 3A ) 또는 평행선, 일반적으로 길이가 ~ 11 mm 인 동심원 고리가 될 수...

신경 세포의 문화는 하나의 신경 세포에 대한 효과 나 신경 세포의 인구를 통해 새로운 뇌 자극 기술을 연구하는데 좋은 모델입니다. 목욕 전극에 의해 직접 생산 또는 시변 자기장에 의해 유도되는 전계에 의해 패터닝 신경 배양 자극하는 다른 방법들이 여기에 제시 하였다.

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

1차원 및 2차원 배양의 전기 및 자기 자극을 위한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 뉴런 배양을 뇌 자극을 위한 축소된 모델로 효율적으로 사용하여 통찰력과 중요한 매개변수를 추출할 수 있도록 하는 것입니다. 1차원 배양과 함께 전기 자극 프로토콜을 사용하면 신경 흥분과 관련된 특정 매개변수(예: 뉴런의 다른 구획에 있는 chronaxie 및 rheobase)를 측정할 수 있습니다. 자기 자극 기술을 사용하면 자기장과 전기장이 신경 세포 배양에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.이 모델을 통해 뇌 질환을 더 잘 진단하고 치료할 수 있습니다. 우리는 1차원 네트워크를 포함한 모든 디자인 패턴에서 패턴 뉴런 네트워크를 배양하기 위한 효과적이고 쉬운 방법을 제안합니다. 그런 다음 이러한 네트워크에 대해 전기장 및 시간에 따라 변하는 자기장의 방향을 지정하여 뉴런의 다른 구획에서 기여를 분리하고 관찰할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 인간 피험자나 동물 모델이 필요하지 않아 신경 자극을 위한 올바른 매개변수를 광범위하고 철저하게 검색할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 기술자인 Yuri Burnishev와 연구실의 박사 과정 학생인 Ami Eisen이 절차를 시연할 것입니다. 시작하려면 생물거부 반응 층으로 부분적으로 사전 코팅된 유리 커버슬립에 신경 세포를 파종하여 패턴화된 신경 세포 배양을 준비합니다.이렇게하려면 25mm 커버 슬립을 청소하십시오. 그리고 스퍼터링 머신을 사용하여 커버슬립을 생물 거부 층으로 코팅합니다. 코팅 안정성을 보장하는 6-10 옹스트롬의 얇은 크롬 필름과 티올 반응성을 코팅에 제공하는 30 옹스트롬 두께의 금 층으로 구성된 층을 만들기 위해 증착 공정에 대한 매개 변수를 조정하십시오.프로세스가 완료되면 스퍼터링 머신에서 커버슬립을 제거하고 얻은 코팅을 검사합니다. 다음으로, 플로터 펜의 잉크 팁을 날카로운 금속 에칭 바늘로 교체하여 수정된 펜 플로터 시스템을 조립합니다. 뻣뻣한 판에 접착된 고무 시트를 플로터에 배치하여 에칭하는 동안 견고하고 마찰이 높은 표면이 보장되도록 합니다.그런 다음 플로터에 제공된 버튼을 눌러 시트의 위치를 조정합니다. 고무 시트가 제자리에 놓이면 표면에 작은 물방울을 피펫으로 넣고 미리 코팅된 커버슬립을 방울 위에 놓습니다. 다음으로, 플로터를 사용하여 200마이크로미터 두께의 선을 생성하여 반복적으로 긁어 금속층을 에칭하여 원하는 패턴을 만듭니다.전기 자극을 가

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 세포를 추적할 수 있습니다 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 2D 및 3D 환경을 설정하는 데 사용 방법을...

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

이 비디오는 균일한 단방향 전기장으로 선 패턴의 신경 세포 배양을 자극하는 기술을 보여줍니다.

1차원 패턴화된 신경 세포 배양의 외부 흥분(External Excitation of one-dimensional patterned neuronal cultures)

이 비디오는 시간에 따라 변하는 자기장을 사용하여 커버슬립의 패턴이 있는 원형 고리에서 성장한 신경 배양을 자극하는 방법을 보여줍니다.

자기장에 의한 패턴화된 신경 배양의 자극(Stimulation of patterned neuronal cultures by a magnetic field)

이 비디오는 iPSC 유래 뉴런과 쥐 피질 뉴런 사이의 신경 연결을 평가하기 위한 전기생리학적 기록을 보여주고, 빛에 민감한 이온 채널을 활성화하고 시냅스후 전류를 감지하여 공동 배양에서 시냅스 접촉을 확인합니다.

전기생리학적 기록을 사용한 공동 배양에서의 신경 연결 형성 평가

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이 되는 것을 목표로 합니다.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

이 연구에서는, 우리는 신경 줄기와 전구 세포 (NPC)의 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다(NPC) 전적으로 미세 유체 시스템에서 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도.

미세 유체 장치에서 전기장 유발 신경 전구체 세포 분화

이 프로토콜은 생물학적 조직을 자극하는 데 사용되는 전기 및 자기 자극기를 모두 구축하는 단계별 프로세스를 설명합니다. 이 프로토콜에는 전산 전기 및 자기장을 시뮬레이션하고 자극기 장치의 제조를 위한 지침이 포함되어 있습니다.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

배우세요 전기 및 자기장을 이용한 1차원 및 2차원 신경 세포 배양 자극 기법을 통해 신경 흥분 매개변수를 측정하고 뇌 자극 메커니즘을 연구하는 방법을 익히세요.

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

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