전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

1차원 및 2차원 배양의 전기 및 자기 자극을 위한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 뉴런 배양을 뇌 자극을 위한 축소된 모델로 효율적으로 사용하여 통찰력과 중요한 매개변수를 추출할 수 있도록 하는 것입니다. 1차원 배양과 함께 전기 자극 프로토콜을 사용하면 신경 흥분과 관련된 특정 매개변수(예: 뉴런의 다른 구획에 있는 chronaxie 및 rheobase)를 측정할 수 있습니다. 자기 자극 기술을 사용하면 자기장과 전기장이 신경 세포 배양에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

이 모델을 통해 뇌 질환을 더 잘 진단하고 치료할 수 있습니다. 우리는 1차원 네트워크를 포함한 모든 디자인 패턴에서 패턴 뉴런 네트워크를 배양하기 위한 효과적이고 쉬운 방법을 제안합니다. 그런 다음 이러한 네트워크에 대해 전기장 및 시간에 따라 변하는 자기장의 방향을 지정하여 뉴런의 다른 구획에서 기여를 분리하고 관찰할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 인간 피험자나 동물 모델이 필요하지 않아 신경 자극을 위한 올바른 매개변수를 광범위하고 철저하게 검색할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 기술자인 Yuri Burnishev와 연구실의 박사 과정 학생인 Ami Eisen이 절차를 시연할 것입니다. 시작하려면 생물거부 반응 층으로 부분적으로 사전 코팅된 유리 커버슬립에 신경 세포를 파종하여 패턴화된 신경 세포 배양을 준비합니다.

이렇게하려면 25mm 커버 슬립을 청소하십시오. 그리고 스퍼터링 머신을 사용하여 커버슬립을 생물 거부 층으로 코팅합니다. 코팅 안정성을 보장하는 6-10 옹스트롬의 얇은 크롬 필름과 티올 반응성을 코팅에 제공하는 30 옹스트롬 두께의 금 층으로 구성된 층을 만들기 위해 증착 공정에 대한 매개 변수를 조정하십시오.

프로세스가 완료되면 스퍼터링 머신에서 커버슬립을 제거하고 얻은 코팅을 검사합니다. 다음으로, 플로터 펜의 잉크 팁을 날카로운 금속 에칭 바늘로 교체하여 수정된 펜 플로터 시스템을 조립합니다. 뻣뻣한 판에 접착된 고무 시트를 플로터에 배치하여 에칭하는 동안 견고하고 마찰이 높은 표면이 보장되도록 합니다.

그런 다음 플로터에 제공된 버튼을 눌러 시트의 위치를 조정합니다. 고무 시트가 제자리에 놓이면 표면에 작은 물방울을 피펫으로 넣고 미리 코팅된 커버슬립을 방울 위에 놓습니다. 다음으로, 플로터를 사용하여 200마이크로미터 두께의 선을 생성하여 반복적으로 긁어 금속층을 에칭하여 원하는 패턴을 만듭니다.

전기 자극을 가하기 전에 시딩된 커버슬립을 이미징 챔버에 넣습니다. 일정한 방향의 전기장으로 세포를 자극하려면 11mm로 분리되고 13mm 커버슬립에 도금된 배양물의 반대쪽에 위치한 두 개의 병렬 전극을 사용합니다. 그런 다음 와이어 전극이 세포 외 매체에 담그고 배양물에서 1mm 위에 위치하도록 배양 이미징 챔버와 일치하는 전극 홀더를 조립합니다.

그런 다음 단일 전극 쌍을 발전기의 신호를 증폭하는 연산 증폭기에 연결합니다. 50% 듀티 사이클과 22볼트의 진폭을 가진 바이폴라 구형파의 단일 펄스를 적용합니다. 전극에서 발생할 수 있는 전기분해를 피하기 위해 DC 성분이 없는 바이폴라파를 사용하십시오.

10마이크로초에서 4밀리초까지 지속되는 펄스를 적용하여 효과적인 자극을 보장하지만 세포 손상을 방지합니다. 변화하는 방향의 전기장으로 세포를 자극하려면 두 개의 수직 쌍의 전극을 사용하십시오. 두 쌍의 전극과 전원 및 모니터링 단자가 서로 완전히 전기적으로 절연되어 있고 접지에서 떠 있는지 확인하십시오.

전기장 방향을 변경하려면 두 전극 쌍에 적용되는 전압의 진폭을 변경합니다. 그런 다음 vector addition에 의해 결과 field의 intensity와 direction을 결정합니다. 고정된 진폭의 회전 자기장을 생성하려면 한 전극 쌍에 사인파를 적용하고 다른 전극 쌍에는 코사인파를 공급합니다.

자기 자극을 시작하려면 원형 패턴으로 자란 신경 세포 배양을 현미경 아래에 놓습니다. 상업적으로 이용 가능한 표준 원형 자기 자극 코일과 지지 자극기를 사용하여 배양을 자극합니다. 비표준 자기장 강도로 배양을 자극하려면 맞춤형 자기 자극 코일을 맞춤형 자극기에 연결하십시오.

그런 다음 레이저 포인터를 사용하여 배양의 중심을 코일의 중심에 정렬하여 성공적인 자극을 보장합니다. 배양 중심에서 약 5mm 위로 유지되도록 코일 위치를 조정합니다. 자극 코일이 적절하게 배치되면 자극기를 최대 5k볼트의 전위로 로드합니다.

그런 다음 고전류, 고전압 스위치를 사용하여 자극 코일을 통해 높은 전압 전류를 방전하여 배양된 뉴런의 활동을 자극하는 자기 펄스를 생성합니다. 마지막으로, 뉴런 배양과 동일한 위치에 픽업 코일을 장착하고 생성된 자기장의 강도를 측정합니다. 이 회로도는 두 쌍의 전극에 전압 펄스의 서로 다른 진폭을 적용함으로써 전기장이 배양을 수동으로 돌릴 필요 없이 모든 각도로 배향될 수 있음을 보여줍니다.

다음은 서로 다른 인가 전압에서 전기 자극을 가진 칼슘 과도 현상의 기록 예입니다. 일정한 기간의 전기장을 적용할 때, 전기장에 반응하고 발화하는 뉴런의 수는 전압의 진폭에 대한 함수로 누적 가우스 분포를 보여줍니다. 그리고 이것은 이 프로토콜을 사용하는 동안 얻어진 강도-지속 시간 곡선의 예입니다.

자기장에 반응하는 고리 배양의 경우, 자극의 성공률은 배양 반경에 따라 증가합니다. 이 그래프는 링 크기와 자기장 강도 사이의 관계를 보여줍니다. 배양의 가장 성공적인 흥분은 실험적으로 접근 가능한 단계의 공간과 높은 확률 영역 사이의 중첩에 있습니다.

일단 마스터하면 1차원 배양 준비를 3-4시간 이내에 수행할 수 있습니다. 전기 및 자기 자극을 수행할 때 자극 단계에서 배양액이 완전히 회복될 수 있도록 하고 모든 장비가 전기 접지에 대해 떠 있는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르면 뇌의 다른 영역에서 뉴런을 배양하거나 예를 들어 피질 뉴런의 통계를 측정하는 것과 같은 다른 질문을 해결할 수 있습니다.

또 다른 가능성은 모든 질병 모델 뉴런의 매개변수를 측정하는 것입니다. 개발 후 이 기술은 효과적이고 안전한 뇌 자극에 필요한 강도와 지속 시간을 최적화할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원하는 패턴의 뉴런 배양을 만드는 방법과 뉴런과 전자기장의 상호 작용 연구를 위해 전기 또는 자기적으로 자극할 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.