형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

이 절차의 전반적인 목표는 후속 형광 활성화 세포 분류(FAC)를 위해 신선하거나 냉동된 성인 쥐의 뇌 조직에서 Fos 발현 뉴런을 해리하는 것입니다. 이 방법은 행동 활성화 뉴런의 고유한 분자 신경 적응을 식별하기 위해 관심 신경 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 냉동 조직을 사용할 수 있어 서로 다른 날에 여러 뇌 영역에서 세포를 쉽게 분리할 수 있다는 것입니다.

이 새로운 뇌 조직을 처리하려면, 얼음처럼 차가운 뇌 슬라이싱 매트릭스의 슬롯에 미리 냉각된 면도날을 두 개 이상 삽입하여 관심 뇌 영역이 포함된 1-2mm 관상 절편을 절단한 다음 절단할 때 절편을 차가운 유리판에 놓습니다. 먼저 관심 있는 뇌 영역을 절개하고 다른 영역을 버리고 백질을 제거합니다. 조직을 동결하려면 샘플을 마이크로튜브로 옮기고 튜브를 섭씨 영하 40도의 이소펜탄에 20초 동안 담가 추가 처리까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

조직을 다지려면 샘플을 차가운 유리판에서 1분 이상 해동하지 않은 후 Buffer A 용액 1-2방울로 샘플을 덮습니다. 다음으로, 면도날을 플레이트에 완전히 수직으로 잡고 각 직교 방향으로 조직을 100회 다집니다. 조직을 완전히 다지려면 Buffer A로 조직을 적신 상태로 유지하고 지정된 다진 시간과 방향을 따르는 것이 중요합니다.

조직 해부 중 백질의 대부분을 제거하고 조직을 완충액 A로 덮은 상태로 유지하여 다진 효율을 개선하고 세포의 건강을 유지하는 것이 중요합니다. 조직이 철저히 처리되면 면도날을 사용하여 1ml의 차가운 버퍼 A가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 조각을 옮기고 튜브를 3-5회 뒤집어 다진 조직을 모두 용액에 담그십시오. 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 해리하려면 원심분리로 샘플을 펠렛화합니다.

상등액을 버리십시오. 그런 다음 갓 해동한 차갑고 갓 해동한 효소 용액 1ml를 마이크로튜브의 내벽에 천천히 추가합니다. 그리고 큰 팁 직경의 피펫을 사용하여 각 펠릿 전체를 즉시 흡인 및 분주하여 다진 조직 조각을 분산시킵니다.

다음으로, 펠릿이 튜브 바닥에 달라붙는 것을 방지하기 위해 마이크로튜브를 빠르게 뒤집고 섭씨 4도에서 30분 동안 종단 간 혼합으로 샘플을 배양합니다. 분해가 끝나면 튜브를 다시 원심분리하고 0.6ml의 차가운 완충액 A를 세포에 추가합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 즉시 펠릿을 5회 흡입하고 분주합니다.

그런 다음 1.3mm 유리 피펫을 선택하고 이를 사용하여 샘플을 10회 부드럽게 분쇄합니다. 샘플을 얼음 위에 2분 동안 올려 놓고 파편과 해리되지 않은 세포가 튜브의 바닥에 가라앉을 수 있도록 합니다. 그런 다음 상등액을 새 15ml 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 600마이크로리터의 Buffer A 용액을 나머지 펠릿에 첨가하고 0.8mm 직경의 피펫을 사용하여 샘플을 추가로 10회 분쇄합니다. 방금 설명한 대로 조직이 침전되도록 한 후 첫 번째 세포 현탁액으로 상층액을 풀링하고 펠릿에 600마이크로리터의 완충액을 더 추가합니다. 그런 다음 0.4mm 피펫을 사용하여 샘플을 분쇄하고 튜브를 얼음 위에 2분 동안 올려 조직이 가라앉도록 합니다.

프로토콜의 기계적 분쇄 단계를 따르는 것은 성공적인 분류를 위해 중요합니다. 그 후, 상등액을 해리된 세포와 함께 모읍니다. 그런 다음 600마이크로리터의 Buffer A를 샘플에 추가하고 0.4mm 피펫 분쇄를 3회 더 반복합니다.

세포가 가라앉을 수 있도록 튜브를 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 그런 다음 상층액을 두 번째 15ml 튜브에 모읍니다. 가장 작은 유리 피펫을 사용하여 분쇄 과정을 세 번 더 반복하면 후속 분류를 위한 세포의 수율이 크게 증가합니다.

모든 상등액을 수집한 후 얼음 위의 4개의 미로튜브에 섭씨 20도 100% 에탄올 800마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 수집된 상등액의 첫 번째 튜브에서 800마이크로리터의 세포를 처음 두 개의 에탄올 튜브 각각으로 옮기고 두 번째 상등액 튜브에서 마지막 두 개의 에탄올 튜브 각각으로 800마이크로리터의 세포를 옮깁니다. 샘플을 혼합하기 위해 튜브를 뒤집습니다.

그런 다음 샘플을 얼음 위에 15분 동안 놓고 5분마다 뒤집어서 혼합합니다. 배양이 끝나면 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로튜브의 벽만 만지고 마이크로피펫을 사용하여 각 상층액의 마지막 50마이크로리터를 제외한 모든 것을 천천히 제거합니다.

두 개의 서로 다른 쌍의 셀 스트레이너를 사용하여 두 개의 세포 현탁액을 각각 개별적으로 필터링합니다. 그런 다음 세포는 관심 세포 마커에 대한 항체로 라벨링하고 유세포 분석으로 분류할 준비가 됩니다. 신선 및 냉동 뇌 조직 샘플을 분석한 결과, 유사한 크기와 입도를 가진 작고 균질한 신경 세포 집단이 존재함을 알 수 있습니다.

작고 균질한 집단은 세포 응집체를 배제하기 위해 게이트될 수 있으며, 뉴런은 NeuN 및 DAPI 양성으로 식별될 수 있습니다. 신선 조직 샘플과 냉동 조직 샘플 모두에서 NeuN mRNA 수치는 NeuN 음성 모집단보다 NeuN 양성 모집단에서 훨씬 더 높습니다. 대조적으로, 신경교세포(glial) 및 희소돌기아교세포(olidogodendrocyte) 세포 마커 mRNA 수치는 NeuN 양성 집단보다 NeuN 음성 집단에서 더 큽니다.

NeuN-음성 집단에서 더 높은 미생물 세포 마커 mRNA 수준의 유사한 추세가 관찰되었지만, 이는 통계적으로 유의하지 않았습니다. 또한, Fos 양성 뉴런에서 Fos mRNA 수치가 Fos 음성 뉴런보다 Fos 양성 뉴런에서 더 높으며, 신선한 조직에서 Fos 양성 뉴런에서 Fos mRNA가 3배 증가하고 동결 조직에서 Fos 양성 뉴런에서 Fos mRNA가 11배 증가하여 신선 조직 및 냉동 조직 조건 모두에서 유동 분류된 세포에서 특정 관심 유전자를 식별하는 방법의 타당성을 확인했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 중요한 세포 용해 예방 단계를 따라야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 형광 활성화 세포 분류와 같은 다른 방법을 수행하여 추가 다운스트림 분자 분석을 위해 관심 세포 하위 집합을 분리할 수 있습니다. 냉동 조직을 사용하면 샘플을 별도의 날짜에 분류할 수 있으며, 이는 길고 복잡한 조직 채취 및 준비 절차와 관련된 실험에 매우 중요합니다. 이 기술은 또한 유세포 분석으로 분류하기 위해 몇 개월 또는 몇 년 동안 저장된 사후 냉동 인간 뇌 샘플을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 Fos 발현 뉴런 또는 기타 면역 표지된 야생형 관심 세포의 행동에 기저에 있는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 뉴런 또는 세포 유형의 형광 활성화 세포 분류를 위해 신선하거나 냉동된 쥐의 뇌 조직에서 세포를 해리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.