Name: 추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 토양 미생물 군집 구조를 인지질 지방산 분석으로 연구하는 방법을. Bligh-Dyer 추출법과 기상 크로마토그래피를 활용하여 다양한 토양 유형에 적용 가능한 견고한 프로토콜을 익히세요.

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이 연구는 캐나다 자연과학 및 공학 위원회(Natural Sciences and Engineering Council of Canada)의 재정 지원을 받았습니다. 저자는 Jela Burkus, Donna Macey 및 Jennifer Lloyd의 기술적 전문성과 이 방법의 최적화에 대한 기여를 인정합니다.

참고 : 항상 그 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 보장하는 프로토콜에 걸쳐 착용한다. 유리는 맨손으로 접촉 할 수 없습니다. 손가락, 머리카락, 그리스, 오일 및 탄화수소의 지질은 모든 잠재적 인 오염 물질이다. 깨끗한 유리를 취급 할 때는 항상 70 % 알코올로 니트릴 장갑, 린스 장갑을 착용하십시오. 분석을위한 유리 1. 준비 <ol><li> 일회용 유리 (예를 들어, 원심 분리기 튜브) <ol><li> 450 ºC에서 4.5 시간 동안 머플로 알루미늄 포일에 감싸 열. </li></ol></li><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)은 캡; 라이닝 <ol><li> 인산염 세제에서 한 시간 동안 뚜껑을 만끽 한 다음 뜨거운 물과 인산염 세제 스크럽 브러시로 세척한다. 수돗물과 비누를 씻어. </li><li> 만 (이상 라이너들이 너무 오래 담가하는 경우 캡에서 떨어질 수로 남겨 않는다. 세 번 씻어 산 욕조에 넣어 한 시간 (5 % HCl)수돗물한다. 증류수에 세 번 씻어. 40 ºC에서 오븐에서 건조. </li></ol></li><li> 재사용 유리 (예를 들어, 10 ㎖, 15 ml에 45 ml의 유리 병 / 항아리) <ol><li> 뜨거운 물과 인산염 세제 스크럽 브러시로 세척. 산 목욕 (5 % HCl) 하룻밤에 수돗물과 장소 비누를 씻어. 다음 40 ºC에서 오븐에서 세 증류수 시간 후 건조 린스, 수돗물에 세 번 씻어. </li><li> 깨끗한 알루미늄 호일에 싸서 (50 ㎖ 항아리 개별 포장하고 다른 유리 샘플 일괄 적으로 싸여있다, 예를 들어, 20) 450 ºC에서 4.5 시간 동안 머플로에서 열. </li></ol></li><li> 체적 유리 (예를 들어, 부피 플라스크) <ol><li> 뜨거운 물과 인산염 세제 스크럽 브러시로 세척. 산 목욕 (5 % HCl) 하룻밤에 수돗물과 장소 비누를 씻어. 수돗물에 세 번 씻어 증류수에 세 번 헹구고, 40 ℃에서 오븐에서 다음 건조# 186; C. </li><li> 머플의 체적 유리 넣지 않도록 - 용매를 소량 (예 : 메탄올)로 3 회 씻어 사용하기 전에. </li></ol></li></ol> 이전 PLFA 분석 2. 수집 및 토양 샘플의 처리 <ol><li> 멸균 봉지에 토양 시료를 수집하고, 이러한 즉시 분석 할 수없는 한, 가능한 한 빨리 동결. 준비가 될 때까지 냉동 (-80 ° C)에 보관 샘플은 샘플의 동결 건조를 진행합니다. 동결 건조기의 지침에 따라 샘플의 건조 배치를 고정. </li><li> 새로운 표지 멸균 가방에 각각의 동결 건조 샘플을 전송합니다. PLFA 추출을위한 사전 표지 숨막히는 원심 분리기 튜브로 가방에 동결 건조 재료 샘플을 달다. 주 : 일반적인 지침은 유기물 (탄소 함량&gt; 17 % 중량) 및 광물질 토양 시료 3.0 g을 0.5 g을 사용하는 것이다. 각 샘플 녹음 샘플 무게. </li><li> 매 10 샘플의 경우,도를 무게분석을 위해, 모든 샘플을 20 추가 중복에는 빈 (즉, 그것의 임의의 샘플이없는 원심 관 - PLFA 추출 과정 중에 오염 가능성을 식별하기위한 대조군으로 사용). 동시에 샘플링 튜브의 배치 방법. 참고 : 20 샘플의 세트는 23 샘플 관의 배치에 대응하는 것 (샘플 1 내지 10, 시료 (10)의 하나의 중복, 샘플 12 (22), 시료 (22)의 하나의 중복, 23 샘플 관의 한 빈 = 배치). 참고 : GC 분석을 준비하고 함께 그들 모두를 실행하기 전에 샘플의 일괄 다음 다음 추출, 분리, 메틸화를 실시한다. 이것은 아무것도 잘못되면 실수가 일어난 위치를 파악하고, 필요한 반복 추출의 수를 줄이는데 도움이 될 수 있습니다. </li></ol> 3. PLFA 기법 (단계를 한 번에 각각의 샘플하지만 완전한 하나의 전체 배치 용입니다) 주의 : 단계들에서 설명 된 PLFA 기술의 모든 단계1-3 아래에 적절한 PPE를 사용하여 실험실 안전 지침을 다음과 흄 후드에서 수행되어야한다. <ol><li> 추출 (단계 1) <ol><li> 증류수 50 ㎖의 KOH의 14g, 탈 이온수 (DH 2 O)을 용해하여 5.0 M KOH를 준비합니다. </li><li> DH 2 O. 400 ㎖에 31.52 g 시트르산 일 수화물을 용해하여 0.15 M 시트 레이트 완충액을 준비 5.0 M KOH를 첨가하여 pH를 4.00 ± 0.02로 조정한다; 약 5.0 M KOH의 45 ~ 50 ml를 4.00로 pH를 조정하기 위해 요구 될 것이다. pH를 조정할 때, 메스 플라스크를 이용하여 1,000 ml의 시트르산 완충액 희석. 사용하지 않을 (최대 1 개월) 냉장고에 시트 레이트 버퍼를 저장합니다. </li><li> (이 23 샘플들의 배치 충분한 대리 표준을 제공) 25 ㎖의 클로로포름에 원액 (10 ㎎ / ㎖) 250 ㎕의 희석 nonadecanoate 대리 표준 매일 PC (0 : 0/19 19)을 준비한다. PC의 0.5 ml의 추가 (19 : 0/19 : 0) 샘플 원심 관에 대리 표준 용액. </li><li> 에이다음 순서에 따라 토양 샘플에 대한 후 Bligh 다이어 및 추출 제를 dd는 : ⅰ) 2.0 mL의 시트 레이트 완충액, ⅱ) 2.5 ml의 클로로포름, 및 ⅲ) 5.0 mL의 메탄올. 30 초에 대한 PTFE 늘어선 모자와 소용돌이와 모자 샘플; 2 시간 동안 엔드 오버 엔드 통에 넣습니다. </li><li> 에 모자와 15 분 동안 226 XG에 원심 분리기. 레이블이 45 mL 유리 병에 파스퇴르 피펫 및 전송과 상층 액을 그립니다. </li><li> 각 샘플에 후 Bligh와 다이어 추출 제의 두 번째 라운드를 추가하고 위의 4 단계와 5 단계를 반복합니다. 같은 레이블 45 ㎖의 유리 병에 파스퇴르 피펫 및 전송과 상층 액을 그립니다. </li><li> 레이블이 45 mL 유리 병 포함하는 상층 액에 추가 ⅰ) 5.0 ml의 클로로포름하고, ⅱ) 5.0 ml의 시트 레이트 버퍼를. 흰색 PTFE가 늘어선 모자와 소용돌이 유리 뚜껑 30 초 동안 유리 병. 이 (산화를 피하기 위하여) 어둠 속에서 실온에서 밤새 앉아 보자. </li><li> 조심스럽게 45 ml의 유리 병의 상부 수성 상 (더 진공을 사용할 수없는 경우, 피펫을 통해 aque 저하한다을 진공유기 상을 피펫 팅 할 때 매우 신중 같은 OU에 단계) 피펫의 모든를 수집하지합니다. 레이블이 15 ml의 유리 병에 피펫 낮은 유기상. </li><li> 상온에서 압축 된 N 2 (산화를 방지하기 위해)에서 15 ㎖의 유리 병의 장소에 배치. 바이알 내의 액체 표면 프릴하지만 바이알의 측면을 상승하지 않도록 N 2 흐름 설정 해제 천천히 클로로포름을 증발시켰다. </li><li> -20 냉동실에 PTFE가 늘어선 모자 및 저장 샘플에 나사 ºC 2 단계를 진행하기 위해 준비가 될 때까지 알루미늄 호일 (개별적으로 배치하는 대신에 랩)에 싸여. </li></ol></li><li> 지질 분류 (단계 2) <ol><li> 유리 탱크에 스피와 SPE 컬럼 홀더를 배치합니다. 스피에 새 SPE 컬럼 (실리카, 500 ㎎, 6 ml)에 삽입합니다. 필요에 따라 라벨 열 (샘플을 혼합하지 않도록 권장). </li><li> (아세톤 5 mL를 첨가하고,이를 통해 배출 시켜서 각 열을 컨디셔닝하고 5 ㎖의 클로로포름을 첨가 개의 추가총 용적 = 10 mL)을 첨가 하였다. 두 번째 클로로포름 세척은 1 ~까지 mm 프릿 이상 유출 후 마개를 닫으 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 유리 병 및 소용돌이 0.5 ml의 클로로포름을 첨가하여 (1 단계의 마지막에 15 ml의 유리 병에 저장) 샘플을 다시 녹인다. 전송 파스퇴르 피펫을 사용하여 SPE 칼럼에 샘플을 재 용해; (2) 전송의 총 (샘플 당 1 ml의 클로로포름의 총 전송 용량)에 대해 반복합니다. </li><li> 열 센터에 직접 지질 샘플을 놓고 탱크에 완전히 배출 용매 수 있습니다. </li><li> 각 컬럼에 클로로포름 5 ㎖을 첨가하여 중성 지질 용출. 탱크에 완전히 배출 용매 허용합니다. </li><li> 각 컬럼에 아세톤 5 mL를 추가하여 당지질을 용출. 수집 탱크에 완전히 배출 용매 허용합니다. </li><li> 열이 탱크에서 서서 진공 장치와 탱크 드레인 제거합니다. 탱크에 깨끗하고 표시된 원심 분리기 튜브 랙을 삽입합니다. 열이 탱크에 서 교체; 표시된 열은 상기 표시 CENTR으로 정렬한다아래 ifuge 튜브. </li><li> 각 컬럼에 메탄올 5 ㎖를 첨가하여 원심 분리 튜브에 인지질을 용출. 이를 폐기하기 전에 흄 후드에서 건조 SPE 열 때까지 기다립니다. 압축 N 2하에 실온에서 건조 아래 인지질 분수. </li><li> -20 ºC에서 냉장고에 PTFE가 늘어선 모자와 매장 샘플에 N 2. 나사와 퍼지 튜브는 3 단계로 진행하기 위해 준비가 될 때까지 알루미늄 호일 (개별적으로 배치하는 대신에 랩)에 싸여. </li></ol></li><li> 지질 메틸화 (단계 3). <ol><li> 37 ºC로 설정 온수 욕조를 켭니다. 1,000 mL의 메스 플라스크를 사용하여 1,000 ml의 DH 2 O의 57.1 ml의 빙초산을 용해하여 (이미 만들어진되지 않은 경우) 1M 초산을 준비합니다. 이 용액을 최대 석 달 동안 실온에서 저장 될 수있다. . </li><li> 메탄올 KOH의 배치를 준비합니다. 40 ml의 메탄올에 0.45 g의 KOH를 용해하여 0.2 M KOH 용액을 준비합니다. A에 따라 KOH의 볼륨과 메탄올을 조정3 단계 매일이 솔루션을 준비에 nticipated 배치 크기; 오랜 기간 동안 저장하지 않습니다. </li><li> 냉동고에서 (2 단계 후 저장 원심 분리기 튜브에서) 샘플을 제거하고 시료를 실온에 올 수 있습니다. 1.0 ml의 메탄올 KOH 다음에 0.5 ml의 클로로포름, 각 시료 0.5 ml의 메탄올을 추가합니다. 캡 튜브 단단히 PTFE 일렬로 세워진 모자. 혼합 소용돌이 친다. </li><li> 30 분 동안 37 ºC 욕조에 밀봉 된 샘플을 놓습니다. 수위가 샘플 액체의 수준보다 1-2mm 최소인지 확인. 제거하고 시료를 냉각 할 수 있습니다. 샘플을 물을 욕조에있는 동안, 샘플 ID를 (PTFE 일렬로 세워진 모자 10 ml의 유리 병)와 작은 유리 병 레이블을 붙입니다. </li><li> 각각의 샘플과 소용돌이에 2.0 ml의 헥산을 추가합니다. 그런 다음 각각의 샘플에 다시 섞어 소용돌이 1.0 M 아세트산 0.2ml를 추가; 상 분리가 볼 수있게한다. </li><li> 상을 깰 각 샘플에 DH 2 O의 2.0 ML을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 샘플. 2 분 동안 226 XG에 다음 원심 분리기 샘플. </li><li> 사용짧은 파스퇴르 피펫은 상위 단계 10 ml의 튜브를 표시 청소하려면 전송합니다. 하부 (수성) 단계 중 하나를 전송하지 않도록주의하십시오. </li><li> 각 샘플의 원심 분리기 튜브와 소용돌이에 2.0 ml의 헥산을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 샘플. 2 분 동안 226 XG에 다음 원심 분리기 샘플. </li><li> 짧은 파스퇴르 피펫을 사용하여 다시 라벨링 10 mL 유리 바이알에 가기 위상을 추가한다. </li><li> N 2하에 실온에서 표지 된 10 ㎖의 유리 바이알에 용매를 증발시켰다. -20 냉동실에 PTFE가 늘어선 모자 및 저장 샘플에 나사 ºC GC 분석을 진행 할 준비가 될 때까지 알루미늄 호일 (개별적으로 배치하는 대신에 랩)에 싸여. 모든 샘플 라벨을해야합니다. </li></ol></li><li> 가스 크로마토 그래피 (GC) 분석 참고 : 개별 PLFAs의 식별 및 정량은 FID 또는 MS 검출기 중 하나에 연결된 GC를 사용하여 수행됩니다. 지시 아래 GC-FID에 대한 있지만, 샘플 준비 GC-MS 유효 것이다 w로엘. 초기 온도 285 ºC 190 ºC, 램프 10 ºC / 분하십시오 GC-FID 시스템의 예 설정은 0.33 μm의 (5 % 페닐) × -methylpolysiloxane 다음의 온도 프로토콜에 열을 0.2 mm × 25 미터 포함 할 것 , 램프 (60) 310 ºC로 ºC가 / 분, 0.42 분 (31)를 유지, 9.5 분을 개최합니다. <ol><li> MeC10 한 방울 추가하여 GC 내부 표준 물질 (ISTD)를 준비 : 100 ㎖ 헥산 0 (메틸 카노 에이트를) (기록은 0.1 mg의 무게를 추가). GC에 가스를 켠 다음 GC의 전원을 켭니다. H 2, N 2, 공기 실린더가 열려 및 분석을 실행할 수있는 충분한 가스가 있다는 것을 확인하십시오 (H 2는 500 psi의 아래 결코한다). </li><li> 좋은 교정의 조건 헥산 빈 다음에 지방산의 혼합을 포함하는 교정 표준을 실행하여 충족되는지 확인합니다. 개인 지방산의 신원 수동 표준 수득 유지 시간과의 비교에 기초하여 할당 될 수 있거나,이 될 수 AUTOMATICA에서야 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 (31)를 사용하여 할당. 모든 경우에, 명확한 식별이 MS 검출기 (2)를 사용하여 달성 될 수있다. 참고 : 좋은 교정의 추가 징후는 평면 기준 및 헥산 린스에 어떤 오염을들 수있다. </li><li> 샘플 응답이 같은 매우에서와 같이, 약한 것으로 예상되는 경우 대안으로 50 ~ 75 μl를 사용합니다 (ISTD 용액 150 μL에 (지질 메틸화 3 단계에서 10 mL 유리 바이알에 포함 된) 각 PLFA 샘플 잔류 물을 용해 GC 유리 병에 넣고 모래 토양). </li><li> 2 μL로 시료 주입 볼륨을 설정합니다. 300 ºC로 FID 온도를 설정합니다. 캐리어 가스 (유량 1.3 ml / 분) 및 (30)의 분할 비로서 H 2 250 ºC의 입구 온도를 이용하여 샘플을 실행 한. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

토양 미생물 커뮤니티에서 발견되는 일부 PLFAs는 또한 식물 뿌리, 조류, 토양 동물과 같은 단일 및 다세포 진핵 생물에 존재하기 때문에 최소화하고 PLFA 데이터의 잘못된 해석을 방지하기 위해주의 데이터 검사가 수행해야합니다. 또한, 고세균은 PLFAs를 포함하지 않는; 대신, 고세균 막을 인지질 알콕시 글리세롤 (PLELs)로 구성된다. 따라서, PLFA 프로토콜 토양 고세균 커뮤니티의 특징을 사용할 수 없다. 특정 미생물 그룹에 개별 PLFAs를 연결하는 것은 신중하게 행사해야합니다 (PLFA 방법의 한계 중 일부의 훌륭한 토론 Frostegård 및 동료 (34)에 의해 2011 년 출판물을 참조하십시오). 중간 차이와, 그 화학 구조에 기초한 그룹 PLFAs에,도 2에 예를 들면, ⅰ) 직쇄 포화 PLFAs, ⅱ) 포화 PLFAs을 수행되었을 대신 더 적절할 수있다N (10 메틸) 분지, ⅲ) 말단 분지 포화 지방산, ⅳ) 불포화 PLFAs, V) 불포화 PLFAs 및 VI)의 히드 록시 지방산. 샘플 중량은 주어진 토양 시료에 함유 추출 PLFAs의 양에 기초하여 조절 될 필요가있다. 이하 미생물 활성 토양에서 추출 된 토양의 양을 조정하지 않음으로써, 사용자가 정확하게 전체 미생물 군집을 나타내는 PLFA 반응 (피크)의 충분한 수를 얻기없는 위험이있다. PLFAs의 높은 농도가 높은 미생물 활성 토양에서 사용자는 이에 PLFAs의 정확한 정량을 방지 GC 열 과부하의 위험이 있습니다. 두 경우 모두에서 토양 시료 PLFAs 재 해석되어야한다. 좋은 출발점 (예 : 숲 바닥 등) 유기 토양 시료 0.5 g, 미네랄 토양 시료 3 g을 추가하는 것입니다. 추출 PLFAs의 금액은 일반적으로 토양 샘플 우리 함유 유기 탄소의 양에 상관되기 때문에ight 토양 탄소 함량을 기준으로 조절 될 수 있으며, 탄소 함량이 0.5 ≤ 경우&gt; 5g 필요할 수 있지만 예를 들면, 미네랄 토양 시료 1g을 취하여, 탄소 함량이 10-15 % 일 때 양호한 PLFA 정량을 얻기에 충분할 수있다 %. 항상 전체 세트가 실행되기 전에 샘플 무게를 최적화하기 위해 몇 가지 샘플로 시험 실행을 수행하는 것이 좋습니다. 다음과 같이 PLFA 프로토콜 및 GC 분석을위한 일반적인 문제 해결 전략이다. GC의 크로마토 그램의 기준선이 너무 높으면, H 2 가스 실린더가 변경되어야한다. 용매 또는 ISTD 피크 크로마토 그램에서 누락 된 경우, 시료 주입에 문제가있을 수 있습니다 (예를 들어, 주사기, 자동 시료 주입기에 문제가 비어 있거나 누락 된 유리 병, 유리 병 위치와 오류를 연결). 세 개 이상의 피크 방법 / 빈 샘플에서 검출하는 경우, 블랭크가 오염과 같은 오염 물질 (들)이 샘플 GC C가 존재할 수 있다는 가능성이 높다hromatograms. 오염원 (일반적으로 수성 매질)을 찾거나 적어도, 오염물에 대응하는 피크는 샘플 크로마토 그램에서 이러한 피크는 PLFA 데이터의 통계적 분석에 포함되지 않도록 제거되도록. 또한, 이월이 의심되는 경우 헥산 샘플 사이에 린스를 실행하는 것이 좋습니다. 헥산 린스의 추가 피크는 이월 (이전 실행에서 용출 즉, 무거운 부품)을 나타냅니다. 지질의 산화에 특히 민감하며, 특히 치료는 암에 저장하고 질소하에 그들을 유지하는 등 공기와 노광로부터 시료를 보호하기 위해 프로토콜에 걸쳐 발휘되어야한다. 0 대리 표준 : 모든 샘플 및 공백은 충분한 C19이 있어야합니다. 누락 된 C19 : 0 피크, 하나의 샘플 또는 공백에는 가난한 복구 또는 분석의 전체 손실을 나타냅니다. 제 m보다 상당히 낮은 샘플에서 0 : C19의 응답ethod / 샘플 공백은 PLFA 방법에 어떤 점에서 분석의 손실을 나타냅니다. 불량한 C19에 직면했을 때 0 복구 절차의 모든 측면에는 격리하기 위해 초기 추출 시료 전송의 모든 단계, SPE 추출 지방산 메틸화, 건조, 저장 및 샘플 조작 포함 신중하게 고려되어야 할 및 검사 단계 또는 분석이 손실 단계. 대리 표준의 경우 복구를 과대 평가 될 수있는 0 : 한편, 일부 토양 시료의 추출은 C19을 수득 수 일 수있다. 0/19 : ((PC (19이 표준을 사용하는 동안 0)과 MeC10 : 0) 절대 요구, 우리는 문제를 해결하기 위해 필요로 할 때 매우 유용하다는 것을이 발견되지 않은만큼 MeC10과 같습니다. 0 응답이 적절하다 문제 해결은 GC 분석 이전 단계에 초점을 맞출 수 있습니다. 이전에 언급 한 바와 같이,주의는 전적으로 바이오 마커가 유도에 따라 생태 학적 중요성과 생태계의 관계를 해석 할 때 사용합니다PLFA 데이터로부터 D, 순수 문화 연구 고립 된 박테리아 균주는 PLFAs의 다른 종류를 포함하는 것을 공개하기 때문이다. 광범위한 생태 학적 추론을 할 때 대신, 바이오 마커 PLFAs 증거의 스위트 룸에 유용한 추가로 볼 수 있습니다. 문헌 개별 PLFAs 제안 된 다른 미생물 그룹에 대한 바이오 마커로 이용했다. 포화 PLFAs는 일반적 그람 양성균을 나타내는 데 사용되는 그람 음성균에 사용 PLFA을 불포화된다. 1ω7, C18 : 1ω7 및 C18 : 그람 음성균에 대한 인식 바이오 마커는 C16과 ω5 또는 ω7 위치에서 불포화과 지방산을 불포화 포함 1ω5합니다. 또한, 시클로 지방산은 그람 음성균 (35)을 대표 할 수있다. 1ω5 + A : 1ω7 + A : 0cyclo 따라서, 그람 음성균으로는 PLFAs의 합으로 계산 될 수있다. 그람 양성 세균에 대한 인식 바이오 마커는 말기 사 분지된다turated 지방산, 이소 지형 C15 등 : 0I, C16 : 0I, C17 : 0I; 0A 및 C17 : 0A 또는 C15로, 안테 이소는 분지. 포화 중간 체인 (10 메틸) 분기와 PLFAs 같은 10Me16 : 0 10Me18 : 0 방선균 (36)에서 특징적으로 존재한다. 따라서, 그램 양성 세균으로부터 PLFAs는의 합과 동일한 것으로 계산 될 수있다 : 0 (ISO, 안테 이소 10 - 메틸). 곰팡이 PLFA과 관련된 많은 바이오 마커들은 고도 불포화되어 있지만, 일부 곰팡이 바이오 마커는 단일 불포화된다. 예를 들어, 곰팡이 단일 불포화 바이오 마커의 관점에서, C16 : 1ω5가 arbuscular 균근 곰팡이의 지표 (AMF) (37), C18로 확인되었습니다 1ω9는 잡균 곰팡이에서 일반적이고, ectomycorrhizae는 일반적으로 C16를 포함 : 1ω9합니다. 디 - 불포화 C18의 존재 : ectomycorr 2ω6,9 적절하게 나타낼 수 2ω6,9 자주 C18와 함께 발생합니다 1ω9 또한 C18이 있음을 나타냅니다 곰팡이 스테롤 에르고 스테롤, 잘 상관 관계hizae 및 잡균 곰팡이 38. 트라이 - 불포화 C18 : 3ω 6,9,12은 곰팡이 (10)에 대한 바이오 마커로 사용되었다; 그러나, C18 : 그것은 일반적으로 박테리아에서 발견되지 않는다 3ω6c는 식물 및 조류를 포함하는 다른 진핵 생물에서 찾을 수있다. 토양 원생 생물의 용어에서, C20 : 다른 작업이 C20를 검출하는 데 실패,하지만 4ω6c는 원생 생물의 바이오 마커 (39)로 인식되었습니다 가능한 원생 생물 집단이 광학 현미경 (40)를 사용하여 시각적으로 확인되었다에도 4ω6c. 많은 연구는 PLFA 데이터 분석 도구로 다변량 조정 기술을 이용하여 전체 토양 미생물 커뮤니티 관련 생태 질문 다룬다. 이 방법을 사용할 때, 몇몇 저자가 시료 (4)의 5 % 미만으로 존재 PLFAs를 제거하여 데이터 세트에서 희귀 PLFAs 제외하도록 선택했습니다. 일반 포화 C16 : 0, C18 : 0 원핵 생물과 EUK을 포함한 모든 토양 미생물에 풍부aryotes. 따라서, 일부 연구자들은 이전에 그들이 토양 미생물 커뮤니티의 구성의 민감한 지표하지 않을 수 기준으로 통계 분석이 PLFAs을 제거 할 수 - 비록 C16 : 0, C18 : 0의 모든 PLFAs를 합산 할 때 포함되어야 여전히 미생물 바이오 매스의 인덱스입니다. 이 기술은 일반적으로 33을 배포 할 수 없습니다 데이터에 적합으로 통계 분석의 용어, 많은 연구자들은 비 통계 다차원 스케일링 (NMDS) 조정을 수행하기 위해 선택합니다. 범주 형 변수와 관련된 자세한 분석은 범주 그룹에 할당 된 미생물 지역 사회 사이의 유사성이나 차이점을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다 범주 그룹 및 다중 응답 순열 절차 (MRPP)에 특정 PLFAs의 발생을 관련시킬 수 지표 종 분석을 포함 할 수있다. 또한, 다 변수 회귀 나무 (MRT)이 특히 유용 할 수있을 때 여러 실험 변수의 영향 또는치료 가능한 설명 변수 (5)로 평가 될 필요 (예를 들면, 토양 질감, 습도, 교정 나이). 확립되면 PLFA 프로토콜 환경 변화 인위적 교란 토양 미생물 반응을 정량 할 때 매우 유용 할 수있는 비교적 간단한 분석 방법이다. 이러한 유전자 지문 분자 기법 미생물 군집의 상세한 특성에 더 적합하지만, PLFA 방법은 총 미생물 바이오 매스 (34)에 정량의 정보를 제공하는 장점을 제공한다. 우리의 연구 실험실에서 한 사람이 편안하게 사일에 걸쳐 20 샘플 세트를 처리 할 수​​ 있습니다, 우리는 토양의 생물학적 품질을 평가하는 강력하고 재현 기술이 될 여기에 제시된 프로토콜을 발견했다. PLFA 방법의 힘은 매우 안정 동위 원소 분석 41 (42)에 연결함으로써 확장 될 수있다. 특히, 부가 O를F 토양에 13 C 표지 기판 토양 미생물에 기판 통합의 정량화를 허용 개별 PLFAs (41)의 동위 원소 분석하지만. 또한,이 방법은 토양 먹이 사슬 42 영양 링크를 규명하는 도구 매우 유망한 것으로 보인다.

인지질 지방산 (PLFAs)는 도메인 박테리아와 Eukarya에서 미생물 세포막의 일부입니다. 미생물 즉각적인 환경 조건에 따라 세포막 무결성 및 세포 기능을 유지하기위한 수단으로서 다양한 사슬 길이 및 조성물 PLFAs 생산; 따라서이 비슷한 토양 조건에 지리적으로 분리되어 있지만, 대상이되는 미생물 지역 사회가 비슷한 PLFAs을 표현하는 것이라고 주장 할 수있다. 14 20 C 원자 사이의 사슬 길이와 토양 PLFAs는 일반적으로 주로 세균 및 진균 기원 (1)로 간주된다. 혼합 배양에서 PLFA 분석은 개별 미생물 종을 식별하는 데 사용될 수 있지만, 토양에있는 미생물 군집의 전체 지문을 제공 할 수있다. PLFAs 빠르게 세포 사멸에 분해되기 때문에, 또한, 이들은 살아있는 토양 미생물 집단이 나타내는 것으로 간주 될 수있다. 이 절반hnique 광범위 5-6 대초원 숲 3-4 이르기까지 다양한 환경에서 발견되는 미생물 군집, 및 농업 분야 (7)의 구성 성분을 특성화하는데 사용되어왔다. 그것은 성공적으로 숲은 금속 (14)와 탄화수소 (15)에 의해 화재 13, 오염 등의 장애뿐만 아니라, 매립 10-12, 8 명확한 절단 9 석회를 포함하여, 관리 변경 토지 토양 반응의 특성을 적용하고, 곤충 발생 16 한 . 현대 PLFA 분석 방법은 연구 그룹의 숫자에 의해 몇 가지 주요 발전을 통해 마지막 여섯 년 동안 진화. 이상성 시스템 (17)에 단상에서 혼합물 시프트 추출 용액에 물 비율 : 메탄올 : 1958 년 상당한 개선 클로로포름 조정에서 일어났다. 이 최적화 된 지질 추출 및 개정 된 분리 프로로토콜은 후 Bligh와 다이어 방법으로 알려지게되었다. 이 프로토콜은이 시간 동안, 화이트와 동료 방법에 상당한 발전에 기여, 향후 몇 년 동안 많은 실험실에 의해 채택되었다; 예를 들어, 이들은 물 인산 완충액 교환에 의한 추출 공정을 개선하고 향상된 피크 식별 및 정량화를 통하여 가스 크로마토 그래피 (GC)에 의한 분석을 최적화. 아마도 토양 과학에 더 관련성, 그들은 해양 퇴적물 (18)의 미생물 생물량을 조사 할 때 상기 추출 된 지질을 미생물 구조의 지표로 사용될 수 있음을 1979 결정. 이 방법이 더 널리 특히 근권 (19)과 관련하여, 토양 과학에 사용되었다으로 추가 개발은 1980 년대에 발생했습니다. 이 때,이 방법은 메틸 nonadecanoate 포함 (MeC19 : 0) 내부 표준 (19) 및 지질 분획 21 &lt;대한 규산 컬럼의 사용과 같은/ SUP&gt;. 화이트 19, 21와 그의 작품에 따라, Tunlid 스웨덴으로 돌아와 바트와 Frostegård와 공동 연구를 시작했다. 유기물 함량의 변화 토양 제품군의 다른 추출 버퍼의 효율을 조사함으로써, 그룹은 구연산 완충액은 포스페이트 버퍼 (22)에 비해 추출 된 지방 인산의 양이 증가 된 것으로 나타났다. 또한, 토양 미생물 커뮤니티에 석회의 영향에 대한 자신의 1993 간행물 (23)는 토양 생물학 및 생화학 (24)에서 인용 고전이 될했다. 연구자들은 데이터 처리에 대한 주성분 분석을 이용했다. PLFA 분석, 방법은 현재 호출되면, 대용량 데이터 세트를 생성하고, 이러한 데이터를 처리하기위한 다 변수 통계 방법의 사용에 매우 많은 시간을 혁신적 영감이었다. 작품에 동시 스웨덴에서 수행되며, 상기 PLFA 절차에 대한 수정이 조사되고 있었다독일에 의해 Zelles와 동료 25 ~ 26. 절차 이들 버전은 전체적으로 더 실험실 집약적이고, 고상 추출 (SPE) 컬럼 대신에 규산 칼럼의 사용을 위해 주목할했지만. 화이트 &amp; Ringelberg (27)에 의해 상세한 방법론과 함께 Frostegård의 종이 (23)는, 토양 과학에 대한 근본적인 질문을 조사 할 PLFA 기술의 사용에 폭발에 대한 기초를 제공했다. 및 C19 : 이후 파이어 동료에 의한 방법의 더욱 세분화 내부 GC 표준 (0 C10) : 추가 포함했다 부량 (28)을 개선하기 위해 대리 기준으로 0과 분액의 사용을 대체가 단순화 둥근 바닥 튜브 퍼널 추출 29. 최근 Chowdhury 딕 30 메틸화 단계를 조사 토양 과학 문헌 코 / 메탄올 방식 식별자에 사용 된 두 개의 메틸화 절차의보고지방산의 더 큰 범위를 지정한 본. 제시된 방법은 크게 후 Bligh 및 다이어 의해 개발 된 기존 방법에 따라, 이러한 메틸화 단계 KOH 메탄올의 사용과 같은 상기 언급 된 변형을 포함한다. 두 기준은 각각의 샘플에 사용되어, 제 1 추출 전에 토양 시료에 첨가 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (: 0/19 0) PC (19) ()의 대리 표준 효율성과 전체 프로토콜의 복구, 메틸 데 카노 에이트의 구 규격 평가할 (MeC10 : 0), GC에 의해 식별 및 정량화하기에 앞서 추가된다. 우리는 PLFA 방법은 일반적으로 전 세계적으로 많은 미생물 생태 연구소에 의해 사용되며, 표준화 2 국제기구를 포함, 여러 번 기록되어 있음을 인정합니다. 본 논문의 목적은 토양에 유용 할 수있는 프로토콜 따라하기 쉽고 강력한을 제시하는 것입니다PLFA 기술을 배우려고 노력하는 과학자.

<table><tbody><tr><td>27-1단계에서 사용되는</td> <td>27개의 포트가 있는 Pierce Reacti-Vap III-증발기 가스 주입 매니폴드</td> 압축 질소 Praxair Ni-T 위험: 교육 후에만 사용하고 접촉 및 사용을 최소화하십시오.<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1-3단계에서 사용</td></tr><tr><td>일회용 원심분리기 튜브 및 테프론 라이닝 캡</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-569-3</td><td>1단계(샘플당 1개) 및 2단계(샘플당 1개)에 사용일회용</td></tr> <tr><td>유리 목이 긴 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>1단계에 사용(샘플당 2개)</td></tr><tr><td>일회용 유리 목이 짧은 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-4</td><td>2단계(샘플당 1개), 3단계(샘플당 1개), GC 분석(샘플당 1개) 및 PLFA 방법 중 분주된 각 유형의 용액에 대해 1개(샘플 배치당 ~10개)에 사용</td></tr><tr><td>Elastic band</td><td>Grand & 장난감</td><td>42199</td><td>동결 건조용 샘플당 1</td></tr>개 <tr><td>동결 건조기-Labconco 7806002 및 7753000</td><td></td><td></td><td>PLFA 분석을 위한 샘플 준비에 사용 - 실험실에 있는 어떤 모델이든 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>냉동고 (-20 &deg; C, -80 &deg; C)</td> <td>Revco</td><td>ULT2586-5-A36</td><td>마이너스 80 &deg; C는 갓 채취한 토양 샘플, -20 &deg를 동결하는 데 사용됩니다. C는 PLFA 분석의 3단계 각각이 끝날 때 시료를 저장하는 데 사용됩니다</td></tr>.<tr><td>가스 크로마토그래프 - Agilent 6890 시리즈 모세관 가스 크로마토그래프(GC; Wilmington, DE)에는 50m Ultra 2(5%-phenyl)-methylpolysiloxane 컬럼이 장착된</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC 분석에 사용되며 다른 GC 모델도 사용할 수 있습니다(1개 필요)</td></tr><tr><td>분석 컬럼</td><td>Agilent Technologies</td><td>19091B-105</td><td></td></tr><tr><td>가스 크로마토그래프 인서트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-4692</td><td>GC 분석에 사용(샘플당 1개)</td></tr><tr><td>가스 크로마토그래프 바이알 및 뚜껑</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6592</td><td>GC 분석에 사용(샘플당 1개)</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H292-4</td><td>위험: 흄 후드에서만 사용, MSDS 읽기, 사용 최소화 및 적절한 PPE 착용; 시료당 총 부피 = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)</td></tr><tr><td>)온수 수조 -Isotemp 220</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>3단계에 사용(시료 배치당 1개)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-2</td><td>동결 건조 시료에 사용</td></tr><tr><td>KOH, ACS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>위험한: 흄 후드에서만 사용하고, MSDS를 읽고, 사용을 최소화하고, 적절한 PPE를 착용하십시오. 구연산염 완충액 (1 단계에서 사용) 및 메탄올 KOH (3 단계)</td></tr> <tr><td>원심분리 튜브 용 실험실 지진 종단 간 쉐이커</td><td>Barnstead / Thermolyne</td><td>3,625,485</td><td>1 단계에 사용 (적절한 보유 용량의 샘플 배치 당 1 개)</td></tr> <tr><td>MeC10 : 0 메틸 카 노 에이트 내부 표준</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299030-2.5G</td><td>GC 분석에 사용</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>위험한: 흄 후드에서만 사용하고, MSDS를 읽고, 사용을 최소화하고, 적절한 PPE를 착용하십시오. 샘플당 총 부피 = 15.5ml(5ml + 5ml(1단계) + 5ml(2단계) + 0.5ml(3단계))</td></tr><tr><td>MIDI 피크 식별 소프트웨어</td><td>MIDI, Inc., Newark, DE</td><td></td><td>GC 분석 출력 해석에 사용</td></tr><tr><td>미생물 식별 시스템을 위한 MIDI 보정 표준 믹스</td><td>Lab Sphere Inc</td><td>1200-A</td><td>TSBA 40 니트릴 장갑의 보정 혼합물로 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>27-058-52</td><td>PLFA 실험실 작업을 수행할 때 항상 사용</td></tr><tr><td>pH 측정기 - Accumet XL200</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>구연산염 완충액 제조에 사용</td></tr><tr><td>피펫(0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette</td><td>Socorex</td><td>832.02</td><td>단계 전반에 걸쳐 사용(샘플당 1개)</td></tr><tr><td>250 &micro; l 기밀 주사기</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td>1725</td><td>GC 분석에 사용 (샘플당 1개)</td></tr> <tr><td>실버 쉴드 장갑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z529575</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>고체상 추출(SPE) 컬럼</td> 취급 시 사용 <td>Agilent Technologies</td><td>5982-2265</td><td>2단계에 사용 (샘플당 1개)</td></tr> <tr><td>SPE 유리 컬럼 홀더 및 진공 장치가 부착</td>됨 <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2단계에 사용 (샘플 배치 당 1개)</td></tr><tr><td>Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615</td><td>Barnstead International&nbsp;</td><td>M37615</td><td>1-3단계에서 사용</td></tr><tr><td>물 - 초순수 및 Chromosolv HPLC 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>분석 전반에 걸쳐 사용</td></tr><tr><td>Whirl-Pak&reg; 가방</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-120</td><td>샘플 수집에 사용 - 수집된 샘플당 2개의 가방 필요</td></tr></tbody></table>

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

인지질의 지방산 (PLFAs)는 미생물의 세포막의 주요 성분이다. 토양에서 추출 PLFAs의 분석은 지상파 미생물 지역 사회의 전체 구조에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. PLFA 프로파일 광범위 전체 토질의 생체 지표로 생태계의 범위에서 사용되고, 토양 반응의 정량적 지표로 관리 및 기타 환경 스트레스 착륙. 단상 클로로포름 혼합물로 토양 시료로부터 (1) 지질 추출, 2. 분획 다른 추출 된 지질로부터 인지질을 분리 고상 추출 컬럼을 사용하여 지방산을 생산하는 인지질 3. 메탄 : 여기에 제시된 표준 방법은 네 가지 주요 단계를 설명 메틸 에스테르 (FAMES) 및 불꽃 이온화 검출기 (GC-FID)를 사용하는 캐 필러 리 가스 크로마토 그래피 분석 4. FAME. 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (PC (19을 포함하여 사용되는 두 개의 기준 :이 0/19 : 0))를 추출 방법의 전반적 회복을 평가하고, 메틸 데 카노 에이트 (MeC10 : 0) GC 분석에 대한 내부 표준 물질 (ISTD)로서.

X는 탄소 원자의 수를 나타낸다 YωZ는, Y는 이중 결합의 수를 나타내고, Z는 분자의 지방족 (ω) 단부로부터 제의 이중 결합의 위치를​​ 나타낸다 : 지방산 X로 지정된다. 접미사 &#39;C&#39;와 &#39;t&#39;는 시스 및 트랜스 기하 이성체를 나타냅니다. &#39;i&#39;를 접두사와 접미사 &#39;이&#39;와 안테 이소 이소 나를 분기와와 OH 각각 메틸 그룹 및 하이드 록실 그룹을 지정을 참조하십시오. 후 GC 실행, 샘플 10을보고 적절한 ISTD을 받았는지 확인합니다 : 0 피크. 또한 GC 표준의 응답을 확인, 즉 추가 ISTD 헥산 용액을 함유하는 바이알; 이들은 다른 피크가 없어야한다. 내부 표준 응답은 모든 실행에 걸쳐 유사해야합니다. 그림 1은 representa을 제시적인 샘플 실행됩니다. 큰 헥산 용매 피크가 특징적으로 1.8 분 주위에 머무름 시간 (RT)에 나타납니다. 0 16.2 분의 RT가 다음 ISTD 표준 피크 : C19는 동안 (C10 0), 3.4 분의 RT에 나타납니다. GC 분석의 긴 체인이 더 느리게 용출과의 쇄 길이에 기초하여 PLFAs 분리; 예를 들면, C18 : 0 C16 동안 14.4 분에서 용출 : 0 10.8 분에서 용출된다. 또한,이 분석 프로토콜 및 불포화 이중 결합의 위치를​​ 그 정도에 기초 PLFAs을 분리 할 수​​있다; 예를 들면, C18 : 0, 14.4 분에서 용출하면서 C18 : 1 9C 및 C18 : 1 14.0 14.1 7C 용출 분을 각각 (도 1). 마지막으로, 유사한 사슬 길이 및 분지 포화하지만 다른 구성 (안테 이소 대 ISO)의 PLFAs을 분리 할 수있다; 예를 들어, C15 : 0I 및 C15 : 각각 8.6 및 8.7 분에서 0A의 용출 (그림 1). 다른 GC 피크의 영역은 메신저가 될 수상기 가스 크로마토 정보를 처리하기 위해 스프레드 시트로 이식. 각 식별 PLFA은 (nmol의 건조 토양의 g -1)은 다음의 방정식을 사용하여 정량화 하였다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54360/54360eq1.jpg" /> F는 계정 FID 선택성 및 지방산 (32) 사이의 몰 농도의 차이를 취하는 조정 인자이고, areaPLFA 각 식별 PLFA, areaC10 피크 면적이 0이 ISTD의 피크 면적이다 (MeC10 : 1), C10 : 0 추가 STD는 ISTD (nmol의)의 양은 앞서 GC 실행으로 각각의 샘플에 첨가하고, 비율 (C19은 0 성병 / C19 첨가 : 0 샘플)는 PC의 복구에 대응한다 (C19 : 0 / C19 : O) 대리 표준 및 시료 중량을 오븐 건조 토양 (g)의 양이 원래 샘플 원심 분리 튜브에 첨가하고 PLFAs를 추출하는데 사용된다. 참고 : differe 아래 지역NT 피크는 GC 시스템에 따라 피크 영역 반응 또는 반응 %로서 표현된다. 토양 PLFA 특성과 관련된 범위 내에서, 지역은 지방산의 중량에 선형 비례하는 것으로 가정 될 수있다; 대안 적으로, 작은 보정 계수는 32 FID 선택성을 고려하여 적용 할 수있다. 결과는 초기 중량 % 기준으로 표시하기 때문에 또한, 그들은 몰량을 수득 정규화 될 필요가있다. 고려 개인 지방산의 분자량을 취함으로써 달성된다 몰 농도의 차이를 조절하는 단계; 게시 된 테이블 (32)와 상용 소프트웨어 (31)는 몰 농도에 대한 정상화 할 때 도움을 사용할 수 있습니다. ISTD (nmol의)의 양은 추가로 계산 될 수있다 각각의 샘플에 첨가 : C10 : V × = [ISTD] 추가 0std (STD 추가) [ISTD]을 농도 MeC10의 (nmol의 리터 -1) 여기서 : 0 (메틸 데 카노 에이트) 헥산에 용해하고 (단계 3.4.1 참조), V는 (STD 첨가)이 볼륨 준비 ISTD 용액 (L)는 GC 실행하기 전에 각 샘플에 추가 (즉, 3.4.4 단계에있어서, 150 μL). C19의 양 : 0 (nmol의) GC 분석시 각 샘플에 존재에 대응 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54360/54360eq2.jpg" /> 여기서 areaC19 : 0 C19의 피크 면적은 : C19의 대응 량 중에 O : 0 (nmol의)가 PLFA 추출법의 시작에서 각 샘플 (참조, 단계 3.1.3)를 첨가 하였다 : <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54360/54360eq3.jpg" /> 여기서, [19 : 0] 표준 (mg을 L -1 </SUP&gt;)로 C19의 농도는 : 클로로포름 0 nonadecanoate 대리 규격 (단계 3.1.3), V (19 : 0 STD 첨가)되는 PLFA 추출의 시작 부분에서 각 샘플에 첨가 준비된 대리 표준 용적 방법 (참조, 단계 3.1.3), M (19) : 0 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린의 분자량 (: 0/19 : PC (19 0)). 참고 : C19 1 몰 : 0 nonadecanoate 대리 표준 수확량이 C19의 몰 : 메틸화 단계 다음 공은 C10 동안 : 0 표준 메틸화 후 추가됩니다. 다음 PLFAs는 일반적으로 토양 미생물 커뮤니티 분석에서 제외된다 : I)의 길이 &lt;14 C 및&gt; 20 C이다 PLFAs 및 피크 면적의 합계의 0.5 % 미만으로 II) PLFAs. 이러한 PLFAs 제외 되었다면, 나머지 PLFAs 모두의 응답은 총 PLFA 양방향을 구하는 합산 될 수있다omass (건조 토양을 nmol의 g-1). PLFA 데이터 변량 분석 (예, ANOVA 테스트가 수행되는 가정에 부합하도록 적절한 데이터 변환 후) 총 PLFA 바이오 매스 및 / 또는 샘플 그룹 / 치료제 중에서 선택된 그룹 PLFA 생물량과 비교하는데 사용될 수있다. 예를 들어,도 2를 제시한다 어느 중쇄 (10- 메틸) 또는 말단 분기와 같은 직쇄 포화 PLFAs 상이한 PLFA 기, 포화 PLFAs의 상대적 분포 결과 및 불포화 PLFAs,뿐만 아니라 모노 - 또는 총 PLFAs의 합 (건조 토양을 nmol의 g-1). 이 특정 예에서, (역 1 내지 3 역으로 감소) 나무의 연령 총 PLFAs 및 다른 PLFA 기의 상대적인 분포 모두에 영향을 알 수있다. 샘플 중 PLFA 조성물의 전체 패턴을 평가하기 위해, 모든 PLFAs의 다변량 분석의 행위와 할 수있다33 cted. PLFA 데이터는 Hellinger 변환은 종종 데이터를 상대화하는 데 사용되는 예를 들면, 어드레스되는 통계적 시험 및 연구 문제의 가정을 만족하기 전에 선택된 다변량 분석에 필요한 변환 될 필요가있다. 비로부터도 3의 결과를도 그림 2에 사용 된 동일한 데이터의 -metric 다차원 스케일링 (NMDS) 조정; NMDS 샘플 사이 득점 랭킹의 유사성에 기초하여 데이터 요소의 2 또는 3 차원 위치 결정을 생성하는 비모수 다변량 기술이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54360/54360fig1.jpg" /> 도 1 주제 GC-FID 크로마토. 재배 갈색 Chernozemic 토양에서 얻은 샘플이 분석을 위해 사용 하였다. 체류 시간 및 대응 PLFAs (괄호) 및 피크 면적 (PA)을대표 피크의 그림에 표시된 다시. 이 특정 샘플 (33) 확인 PLFAs를 산출하지만 명확하게하기 위해, 모든 피크가, 그림에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54360/54360fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54360/54360fig2.jpg" /> PLFAs (총 PLFAs의 %)의 여섯 가지 종류의 그림 2. 상대 풍부, 총 PLFA의 바이오 매스 (nmol의 g -1 ) 건조 토양의. 샘플 숲 Luvisolic 토양에서이 분석에 사용 하였다. 결과는-중간 세 (이십오년) 다음에 오래된 나무 (&gt; 오십년) 아래에있는 사이트 1에서 토양에 대한 더 큰 총 PLFAs, 나무 (사이트 2)를 표시하고 마지막으로 막내 (10 년) 나무 ( 사이트 3). 상대적으로 포화 PLFAs는 막내에 존재하는사이트, 불포화 PLFAs 가장 오래된 사이트에 존재하는 동안. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54360/54360fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54360/54360fig3.jpg" /> PLFAs 그림 3. 비 메트릭 다차원 스케일링 (NMDS) 조정 축 (2) 및 3 차원 용액 3 (총 PLFAs 데이터 % 사용).이 조정은도 2에 대해 사용되는 것과 동일한 데이터를 사용하여 계산 하였다. 막내 사이트 (사이트 3) (사이트 2, 3) 매우 명확하게 이전이 사이트에서 분리, 자신의 PLFA 미생물 군집 구성에 중복을 표시한다. 괄호에 포함 된 각 축에 의해 설명 된 PLFA 커뮤니티 데이터의 변화의 양; 변동의 72.5 %는 3 DIMEN 이러한 두 축으로 설명한다적인 NMDS 솔루션입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54360/54360fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

인지질의 지방산 토양 미생물 커뮤니티의 구조에 대한 정보를 제공한다. 우리는 단상 클로로포름 혼합물을 고체상 추출 칼럼을 사용하여 추출한 지질의 분류 및 모세관 가스 크로마토 그래피로 분석 지방산 메틸 에스테르를 생성하기 위해 메탄과 토양 시료로부터 추출하기위한 방법을 제시한다.

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

본 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 인지질 지방산(phospholipid fatty acids) 식별을 통해 토양 미생물 군집의 구조에 관한 정보를 제공하는 것입니다. 이 방법은 토지 관리 변화 또는 자연적 교란에 대한 토양 미생물의 반응 특성을 규명하는 것과 같은 과학계의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 따라 하기 쉽고 견고한 프로토콜로서 광범위한 토양 유형에 적용 가능하다는 점입니다.본 프로토콜의 시연은 저희 연구소의 테크니션인 Katelyn Pretzlaff가 진행하겠습니다. 추출을 시작하기 위해, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 5.0 molar 수산화칼륨과 0.15 molar 시트르산 완충액을 준비하십시오. 19:0 nonadeconoate 대리 표준물질은 스톡 용액 250 µL를 클로로포름 25 mL에 희석하여 매일 준비합니다.이는 샘플 23개 묶음에 충분한 양의 대리 표준물질을 제공합니다. 샘플 원심분리 튜브에 19:0 대리 표준물질 용액 0.5 milliliters를 첨가하십시오. 토양 샘플에 대해 Bligh and Dyer 추출을 수행하려면, citrate buffer 2.0 milliliters를 먼저 넣고, 이어서 chloroform 2.5 milliliters, 그다음 methanol 5.0 milliliters를 순서대로 첨가하십시오.PTFE 라이닝 캡으로 샘플을 밀폐하고 30초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음, 엔드-오버-엔드 쉐이커에 넣고 2시간 동안 흔들어 줍니다. 2시간 후, 캡을 닫은 상태에서 샘플을 226 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.파스퇴르 피펫으로 상층액을 뽑아내어 라벨이 부착된 45-milliliter 유리 바이알로 옮깁니다. 각 시료에 Bligh and Dyer 추출제를 다시 한 번 추가하고 흔들기와 원심분리 단계를 반복합니다. 파스퇴르 피펫으로 상층액을 뽑아내어 동일한 라벨의 45-milliliter 유리 바이알로 옮깁니다.다음으로, 상청액이 들어 있는 라벨이 부착된 45-milliliter 유리 바이알에 chloroform 5.0 milliliters와 citrate buffer 5.0 milliliters를 추가합니다. 흰색 PTFE 라이닝 캡으로 닫고 유리 바이알을 30초 동안 볼텍싱합니다. 45-milliliter 바이알의 상층 수성층을 진공으로 조심스럽게 제거합니다.하층 유기상을 라벨이 부착된 15-milliliter 바이알에 피펫으로 옮깁니다. 산화를 방지하기 위해 15-milliliter 바이알 묶음을 실온에서 압축 질소 하에 둡니다. 질소 흐름이 바이알 내 액체 표면을 가볍게 흔들되 바이알 벽면을 타고 올라가지 않도록 설정하여 클로로포름을 천천히 증발시킵니다.PTFE 라이닝 캡을 돌려 닫고, 샘플을 알루미늄 호일로 감싸 -20 °C 냉동고에 보관합니다. 필요한 경우 새로운 고상 추출 또는 SPE 컬럼에 라벨을 붙입니다. 스피곳이 달린 SPE 컬럼 홀더를 유리 탱크 위에 놓고, 라벨이 붙은 컬럼들을 스피곳에 삽입합니다.각 컬럼에 acetone 5 milliliters를 첨가하고 모두 흘려보내 컨디셔닝합니다. 그 후, chloroform 5 milliliters를 두 번 첨가합니다. 두 번째 chloroform 세척액이 컬럼 상단에서 약 1 milliliter 높이까지 남았을 때 스톱콕(spigot)을 잠급니다.바이알에 0.5 milliliters의 클로로포름을 첨가하고 가볍게 볼텍싱하여 샘플을 다시 용해합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 재용해된 샘플을 SPE 컬럼으로 옮깁니다. 지질 샘플을 컬럼 중앙에 직접 떨어뜨리고 용매가 탱크로 완전히 빠져나갈 때까지 기다립니다.각 컬럼에 5 milliliters의 chloroform을 첨가하여 중성 지질을 용출합니다. 용매가 탱크로 완전히 배수될 때까지 기다립니다. 각 컬럼에 5 milliliters의 acetone을 첨가하여 당지질을 용출하며, 용매가 수집 탱크로 완전히 배수되도록 합니다.탱크에서 컬럼 스탠드를 제거하고 진공 장치로 탱크를 배수합니다. 깨끗하고 라벨이 부착된 원심분리 튜브가 담긴 랙을 탱크에 삽입한 후, 탱크 위에 컬럼 스탠드를 다시 설치합니다. 위쪽의 라벨이 붙은 컬럼은 아래쪽의 라벨이 붙은 원심분리 튜브와 일직선이 되어야 합니다.각 컬럼에 5 milliliters의 methanol을 첨가하여 인지질을 원심분리 튜브로 용리합니다. SPE 컬럼을 폐기하기 전, 흄 후드 내에서 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 인지질 분획을 압축 질소 기류 하에 실온에서 건조시킵니다.질소로 튜브 내부를 퍼지한 후, PTFE 라이닝 캡을 조여 닫고 샘플을 알루미늄 호일로 감싸 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 항온수조의 전원을 켜고 37 °C로 설정하십시오. 냉동고에서 샘플을 꺼내 실온에 둡니다.각 샘플에 클로로포름 0.5 milliliters와 메탄올 0.5 milliliters를 넣은 후, 메탄올성 수산화칼륨 1.0 milliliters를 추가합니다. PTFE 라이닝 캡으로 튜브를 단단히 밀봉하고 소용돌이 모양으로 흔들어 섞어줍니다. 밀봉된 샘플을 37-degrees Celsius 배스에 30분 동안 둡니다.수위가 시료 액체 표면보다 최소 1~2 mm 높게 유지되도록 하십시오. 시료가 항온수조에 있는 동안, 작은 유리 바이알에 시료 ID를 표기하십시오. 30분 후, 시료를 꺼내어 식히십시오.다음으로, 각 샘플에 2.0 milliliters의 hexane을 넣고 소용돌이치듯 섞습니다. 그런 다음, 각 샘플에 1.0 molar acetic acid 0.2 milliliters를 넣고 다시 소용돌이치듯 섞습니다. 그러면 층 분리가 눈에 보이게 됩니다.상 분리를 위해 각 샘플에 증류수 2.0 milliliters를 첨가합니다. 샘플을 30초 동안 볼텍싱한 후, 226 times G에서 2분 동안 원심분리합니다. 짧은 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 라벨이 부착된 깨끗한 10-milliliter 바이알로 옮깁니다.하층 수층이 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 각 샘플 원심분리 튜브에 hexane 2.0 milliliters를 첨가하고 가볍게 흔들어 섞어줍니다. 샘플을 30초 동안 볼텍싱한 후, 이전과 동일하게 원심분리합니다.짧은 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 라벨이 부착된 10 mL 유리 바이알에 다시 넣습니다. 질소 기류 하에 실온에서 라벨이 부착된 10 mL 유리 바이알 내의 용매를 증발시킵니다. PTFE 라이닝 캡을 돌려 닫고 샘플을 알루미늄 호일로 감쌉니다.본문 프로토콜에 설명된 대로 가스 크로마토그래피 분석을 진행할 때까지 샘플을 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 불꽃 이온화 검출기를 이용한 모세관 가스 크로마토그래피로 샘플을 분석하여 얻은 대표적인 크로마토그램이 여기에 제시되어 있습니다. 괄호 안의 숫자는 PLFA의 머무름 시간(분)을 나타냅니다.모든 PLFA의 반응 값을 합산하여 토양 g당 나노몰(nanomoles) 단위의 총 PLFA 바이오매스를 구할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 PLFA 그룹의 상대적 분포를 계산하여 토양 간에 비교할 수 있습니다. 결과에 따르면, 오래된 나무 아래에 위치한 사이트 1의 토양에서 총 PLFA가 가장 높게 나타났으며, 사이트 2의 중간 연령 나무 아래 토양이 그 뒤를 이었습니다.마지막으로, 사이트 3에 있는 가장 어린 나무 아래의 토양입니다. 가장 어린 사이트에서는 상대적으로 더 포화된 PLFA가 나타나는 반면, 가장 오래된 사이트에서는 더 불포화된 PLFA가 나타납니다. PLFA 결과는 여기에서 설명된 것과 같이 비계량적 다차원 척도법(non-metric, multidimensional scaling)과 같은 다변량 서열화 기법을 사용하여 추가로 분석할 수 있습니다.가장 최근의 부지는 나머지 두 오래된 부지와 매우 뚜렷하게 구분되며, 두 오래된 부지는 PLFA 미생물 군집 조성에서 중첩을 보입니다. 각 축에 의해 설명되는 PLFA 군집 데이터의 변동량은 괄호 안에 표시되어 있습니다. 이 기술을 숙달하면 한 사람이 4일 동안 20개의 시료를 처리하는 것이 가능합니다.본 프로토콜을 수행할 때, 지질은 산화에 특히 취약하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 샘플을 어두운 곳에 보관하거나 질소 분위기 하에 두는 등 공기 및 빛 노출로부터 보호해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면 지질 추출, 지질 분획화, 지질 메틸화라는 3단계 과정을 통해 인지질 지방산을 식별함으로써 토양 미생물 군집의 구조를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.

미세 조류의 지방산 콘텐츠 및 조성 분석

이 논문은 많은 샘플을 가진 연구에서 토양 미생물 군집 구조를 결정하기 위해 총 지질과 지표 지질의 상대적 양을 특성화하는데 사용하기 위해 미생물의 세포막으로부터 지질 추출을위한 노력과 정확성을 균형있게 유지하면서 처리량을 증가시키는 방법을 기술한다.

많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

지방산 영양 마커 접근, 즉, 전체 분자와 소비자 조직으로 전송으로 지방산의 동화 없이 또는 사소한 수정, 작은 토양 무척 추 동물의 지방 산 성 대사에 지식 격차에 의해 방해 된다. Isotopologue 프로 파일링 풀 영양 상호 작용 하는 귀중 한 도구로 제공 됩니다.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

이 방법은 복잡한 숙주 공급원에서 세균막, 특히 황색포도상구균에외인성 지방산의 통합을 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 이를 달성하기 위해, 닭 계란 노른자및 질량 분석법을 활용하는 세균성 인지질의 후속 지방산 프로파일링에서 지단백질 입자의 농축을위한 프로토콜이 설명된다.

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

프로토콜은 광범위한 진균의 세포벽의 총 지질 함량을 추출하기 위해 제시된다. 더욱이, 진동산의 상이한 모형의 추출 및 분석 프로토콜이 도시된다. 이러한 진균 화합물을 모니터링하는 얇은 층 크로마토그래피 프로토콜도 제공됩니다.

얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

본 연구는 토양 미생물 생체량과 균류-박테리아 비율을 빠르게 정량화하는 ddPCR 방법을 제시합니다. ddPCR 유래 미생물 생체량 탄소는 클로로포름 훈증 추정치와 약한 상관관계만 보이지만, 이 방법은 추가 토양 샘플링이나 강경 도구 없이 민감하고 확장 가능한 분자 접근법을 제공합니다.

디지털 액상 PCR(ddPCR)을 이용한 토양 내 미생물 바이오매스 측정

배우세요 토양 미생물 군집 구조를 인지질 지방산 분석으로 연구하는 방법을. Bligh-Dyer 추출법과 기상 크로마토그래피를 활용하여 다양한 토양 유형에 적용 가능한 견고한 프로토콜을 익히세요.

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

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