Name: 신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 신장 면역 세포의 신뢰성 높은 분리법을 통해 다색 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 효율적으로 추출하는 방법을. 이 기법은 콜라게나제 소화법보다 경제적이며 다양한 장기에 적용 가능합니다.

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이 연구는 Dialysis Clinics Inc.와 University of Missouri Research Board Grant의 연구 보조금으로 지원됩니다.

수행 모든 프로토콜 단계 검토와 미주리 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (ACUC)에 의해 승인되었다. 모든 연령에서 이론적으로 모든 설치류 실험에 사용할 수 있지만,이 프로토콜의 경우, 15주 세 남성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 이 비 생존 수술 때문에 안락사 방혈 및 양자 기흉에 의해 달성된다. 신장의 1 관류 참고 : 심장, 간, 신장 등 장기의 관류 데이​​터의 해석을 방해 할 수 혈액을 제거합니다. 가능하면 따라서, 우리는 항상 장기를 관류. <ol><li> 그것은 움직이지 될 때까지 (3 ml / 분) 유도 챔버 이소 플루 란에 마우스를 놓습니다. 다음으로, 챔버에서 마우스를 제거 해부 테이블에 등쪽를 놓고 마우스 코의 이소 플루 란 콘을 배치하고 조절을 통해 1.5 ml / 분의 속도로 이소 플루 란을 누릅니다. </li><li> 발가락 핀치 응 답을 확인동물 마취의 수술 비행기를 달성 한 경우 핀셋 전자는 평가합니다. 식염수 복부 복부를 청소하고 가위로 복부를 열고 잘라 마우스의 왼쪽에 (수술 분야 중) 복부 장기를 밀어 넣습니다. </li><li> 과 하대 정맥에서 혈액을 수집 25 게이지 1 cc의 주사기에 바늘 고정 0.5M EDTA의 10 μl를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 추가합니다. 참고 : 혈액의 컬렉션은 선택 사항입니다. 플라즈마 생화학 적 측정을 위해 사용될 수있다. 백혈구는 유세포 분석을 위해 사용될 수있다. </li><li> 가위를 사용하여, 오른쪽 심방에 작은 상처가 다음 단계에서 혈액과 PBS의 혼합물을 수 있도록 할 수 있습니다. </li><li> 50 CC 주사기를 타고 얼음처럼 차가운 PBS (20 ~ 30 CC)를 입력합니다. 다음, 주사기에 21 ~ 25 G 바늘을 부착 (집게 사이에 부드럽게 마음을 잡고)의 정점에서 좌심실에 구멍을 천천히 과정을 통해 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)과 좌심실을 관류1 ~ 2 분. 참고 : 마음이 바로 관류의 처음 몇 밀리리터에 blanches. 이 재관류이 대정맥을 통해 정맥 반환을 통해 간에서 혈액을 배출되어 있음을 나타냅니다 같이 희게의 간을 준수하십시오. 또한,이 우심실의 구멍을 나타냅니다으로 폐 주입시 확대되지 않도록해야합니다. 폐 확장한다면, 약간 뒤로 좌심실에 바늘을 철회하고 재관류를 계속합니다. 달성 안락사까지 제 절개 찍은 시간 미만이 최소 인 </li></ol> 신장 2. 해부 <ol><li> 관류가 완료되면, 첨부 파일 (혈관, 지방과 부신) 및 소비세의 권리 신장을 해부 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 절단 및 포셉으로 해부하여 신장을 덮고있는 캡슐을 제거합니다. 신장의 무게를. 참고 : 신장 무게 것은 선택 사항입니다. 그러나, 일부 실험신장 사이즈 / 조직의 그램 당 셀 수율을 정규화하기 위해 사용될 수있다 중량의 변화가 발생할 수있다. </li><li> 신장 무게 후, 0.5 % FBS를 포함하는 RPMI-1640 1 ㎖에 배치 또는 염색 완충 용액 세포 계측법 (50 ML 원뿔 스크류 캡 튜브를) 흐름 및 추가 사용까지 얼음에 튜브를 배치합니다. 참고 설명의 편의상, 우리는 염색 완충액 유세포 면역 세포의 분리의 나머지를 들어 설명한다. 모두 신장 또는 신장의 1 + 1 / 3의 RD (옵션) 하류의 실험에 따라 사용될 수 있지만, 또한, 단일 신장에서의 면역 세포의 분리를 설명한다. 신장의 1/3 RD 단백질 / RNA 실험에 고정 될 수 있고, 1/3 RD는 면역 또는 투과 전자 현미경을위한 버퍼에 배치 될 수있다. </li></ol> 신장의 3 균질화 <ol><li> 샘플의 식별 정보와 함께 5 내지 80 ml의 용량 균질화 백 레이블링내부 스트레이너 (STR)를 제거하고 폐기합니다. 차가운 얼음 유동 세포 계측법 염색 완충 용액의 5 ml의 가방을 채우고 버퍼에 신장을 전송합니다. 두 번째 샘플 또는 처리가 필요 이상의 샘플에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 절반은 유동 세포 계측법 염색 완충액에 침지 신장을 가지며, 나머지 절반은 단순히 위로 절첩되도록 반으로 균질화 백 접어. </li><li> 조직 균질의 전원을 켜고 빠른 (설정) rpm으로 설정합니다. 하단 가장자리에 패 직면 신장과 접힌 균질화 가방을 배치하지만 가방의 하단이 패의 아래쪽 테두리 아래로 슬라이딩되지 않습니다 있는지 확인하십시오. <ol><li> 2 패이 있기 때문에 동시에 두 번째 샘플을 처리합니다. 120 초로 시간을 선택합니다. 패는 신장을 균질화 앞뒤로 이동 관찰한다. 주 : 한편, 중단이 처음 두가 처리되는 동안 샘플이 더 신장 (또는 다른 조직)을 제조하는데 사용될 수있다. </li></올&gt; </li><li> 균질화의 첫 번째 세트를 완료 한 후, 얼음에 가방을 전송하는 등 다음의 샘플 세트와 함께 조직 균질를 다시로드합니다. 시각적으로 신장이 충분히 균질화하고 더 큰 덩어리를 볼 수 없는지 확인합니다. 참고 : 일반적으로, 빠른 rpm에서 조직 균질의 2 분의 신장에 적합합니다. </li><li> 얼음에 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 셀 스트레이너로 완전하게 균질 피펫. 4 ° C에서 1 분 50 XG에서 바닥 원심 분리기를 설정하고 원심 분리기에 샘플을로드합니다. 참고 : 원심 분리는 모든 균질 (포함하는 셀)을 셀 스트레이너를 통과 한 것을 보장합니다. </li><li> 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 얼음에 다시 배치합니다. 셀 스트레이너를 무시하고 균질을 유지합니다. 동일 부피 추가 (~ 6 mL)에 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 세포 펠렛 / 상등액 피펫 위아래로 수회에 1X RBC 용해 완충액. Visua에서야 베드로, 즉시 정지 감소에 붉은 색의 일부를 관찰합니다. 최대 RBC 용해를 달성하기 위해 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 참고 : 연구자는 신장 관류 적은 세포 조작이 필요한 자신감을 경우 RBC 용해 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 우리는 RBC 용해에 세포 현탁액을 실시하지 않음으로써 신장 세포 수율의 현저한 증가를 관찰 하였다. </li><li> 5 분 세포 펠렛을 형성하도록 500 XG, 39 ° C로 설정되어있는 원심 분리기에서 튜브를 스핀. 단계 3.6 및 3.7 동안 콜로 이달 실리카 (퍼콜)를 기반으로 밀도 구배 원심 분리 준비 :합니다. <ol><li> 바닥 폴리 프로필렌 튜브 라운드 10 mL를 취하여 해당 샘플 번호로 레이블과 튜브 랙에 배치합니다. 참고 : 다음은 4 신장 샘플에 대한 충분한 밀도 구배 시약을 만드는 방법을 설명합니다. </li><li> 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 7 mL를 취하여 15 ML 원뿔 튜브로 피펫. 2 M 자당의에 1 ML을 추가0.25 M 자당을 준비합니다. </li><li> 다음으로, 또 다른 15 ML 원뿔 관에 밀도 구배 시약과 피펫을 7.2 mL를 취하여. 72 %를 밀도 구배 시약 및 0.25 M 자당을 준비하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 1.55 mL 및 2 M 자당의 1.25 ML을 추가합니다. </li><li> 피펫 각 샘플에 대해 하나의 둥근 바닥의 폴리 프로필렌 튜브에 72 % 농도 구배 시약 1 ㎖. </li></ol></li></ol> 4. 그라데이션 원심 분리 <ol><li> 단계 3.7 후, 튜브를 꺼내 부드럽게 한 부드러운 움직임에 뜨는을 가만히 따르다 또한 튜브가 거꾸로 유지되는 동안 형성 액체의 다음 드롭을 가만히 따르다. 참고 :이 단계는 수익률의 변화를 만들 수있을만큼 밀도 구배를 변경할 수를 초과하는 액체 뒤에 남겨두고 이후 중요하다. 튜브가 수직으로 다시 설정하면 ~ 액의 200 ~ 300 μL은 세포 펠렛으로 남아있다. </li><li> 피펫 조심스럽게 그러나 적극적으로 세포 펠렛 상에 0.25 M 자당 1 ml의 최대 피펫 및 브린 아래로g 균일 한 서스펜션에 세포. 다음에, 36 % 농도 구배 시약을 형성하기 위해 세포를 혼합하여 강하게 피펫 다시 1 ㎖의 72 % 밀도 구배 시약 (3.7.4)에 세포 현탁액을 추가. </li><li> 폴리 프로필렌 파스퇴르 (전송) 피펫으로 72 %의 밀도 구배 시약 1 mL를 취하여. 전구의 압력도 부드럽게 세포 현탁액의 하단에 파스퇴르 피펫 (36 % 농도 구배 시약)을 삽입하고을 형성하는 72 % 농도 구배 시약을 언로드 (선단에서 액체 열을 유지하고 기포 형성을 방지) 별개의 무거운 층. </li><li> 부드럽게 샘플 튜브를 선택하고이 단계 동안 실내 온도에서 원심 분리로 놓는다. 500 X g에서 20 ~ 30 분 스핀. </li><li> 한편, 해당 샘플 식별자 바닥 원심 분리기 튜브의 둘레에 폴리 프로필렌의 다른 두 세트를 준비합니다. </li><li> 단계 4.4이 완료된 후, 최소한의 진탕 부드럽게 폴리 프로필렌 튜브를 함유하는 샘플을 제거하고 아래로 설정할튜브 랙. </li><li> 첫 번째 샘플 튜브 및 해당 빈 튜브를 선택합니다. 폴리 프로필렌 파스퇴르 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 측정 흡입으로, 상단 &quot;정크 층&quot;또는 &quot;끈적 끈적한 물질&quot;을 제거하고 빈 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 넣어. <ol><li> (붉은 색조 [적혈구]와 오프 화이트 나타날 수 있습니다) 도달 &quot;버피 코트 &#39;까지 그라데이션의 상단 부분을 제거 진행합니다. ~ 3mm의 높이가 &quot;버피 코트&quot;로부터 도달하면 흡인 정지. 참고 :이 물건이 완전히 흡입을 계속하기 전에 그라데이션의 상부에서 사라 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 신선한 파스퇴르 피펫과 신선한 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 타고 부드럽게 버피 코트를 제거합니다. 세포의 대부분을 수집하고 적절한 샘플 식별자와 2 차 새로운 둥근 바닥 튜브에 추가되도록, 버피 코트 아래 5mm - 3 흡인 계속합니다. </li><li> 1-2 ml의 O를 추가F 유동 세포 계측법 염색 버퍼 2 차 튜브에 용액로 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액와 2 차 세척 단계는 선택 사항입니다. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 500 μL와에 재현 탁은 혈구를 사용하여 세포를 계산 진행합니다. </li></ol> 5. 옵션 (셀 라벨) <ol><li> 동일한 수의 셀에 대한 각 샘플 Aliqout. 10 6 셀 당 0.5 μg의 (안티 CD16 / CD32 FcRγ 쇄)의 희석에 차단 항체를 추가하고 15 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 전에 실제 실험에, 연구자에 의해 서로 잘 작동하도록 결정된다 (적절한 형광 접합) 일차 항체의 원하는 칵테일을 추가합니다. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. PBS로 세포를 씻으십시오. 참고 :이 원고에 대한 신장 면역 세포 라벨의 데모를 들어, 우리는 T-LY 사용mphocyte 및 대 식세포 / 수지상 세포 패널. BV421, 안티 Foxp3의 (클론 : FJK-16) APC, 안티 CD127 (클론 : A7R34) 다음 T 림프구 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 클론)로 구성 PE / Cy7, 안티 CD44 (클론 : IM7)를 PerCP / Cy5.5, 안티 - CD4 (클론 : RM4-5) APC-Cy7, 안티 - CD8 (클론 : 53-6.7) BV785. BV421, 안티 Ly6G (클론 : 1A8) FITC, 안티 CD11b를 (클론 : M1 /​​ 70)를 PerCP-Cy5.5, 안티 : 대 식세포 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 복제) 구성 F4 / 80 (클론 : BM8) APC, 안티의 CD11c (클론 : N418) BV785. </li><li> 고 정부 생존 얼룩을 추가하고 5 분 동안 벤치 위에 둡니다. 고 정부 생존 얼룩 초과를 제거하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액으로 세포를 씻으십시오. </li><li> 고정 / Permeabilization 시약을 추가하고 4 ºC에서 밤새 품어. permeabilization 용액에 세척 할 것. </li><li> 세포 내 얼룩의 경우, 10 분 동안 항 CD16 / 32 FcRγ 쇄 다시 차단합니다. 세포 내 얼룩을 추가하고 20 ~ 30 분 동안 품어. 체육의 워시 2 배rmeabilization 솔루션입니다. </li><li> FACS 시스템 3.9을 통해 유동 세포 계측법 염색 버퍼 솔루션 및 실행 샘플을 Resuspend. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 여기에서 안정적이고 효율적으로 신장에서의 면역 세포를 얻을 수있는 방법을 제시 하였다. 널리 사용되는 콜라겐 분해 공정 (조직의 기계적인 파괴)에 대한 주요 변경은 약 30 분 동안 저장하고, 가능한 면역 세포의 다수의 분리 4 신장 샘플 하에서 2 시간 걸린다. 또한, 연구의 질문에 따라, 우리는 이제 하나의 신장을 사용하는 우리의 면역 세포 분리를위한 (다른 신장은 웨스턴 블랏, PCR에 의한 면역 조직 화학 및 mRNA의 분석에 의한 단백질의 분석을 위해 사용될 수 있음) 일상적 ~ 2 × 106 세포를 얻을 격리 당. 우리는 간, 심장에서 면역 세포의 대량 분리하는이 방법을 사용했다 (기계 파괴와 함께 심장에 멀티 효소 소화, 데이터는 도시하지 않음)하지만 기계적인 파괴가 같은 다른 비 섬유 조직에 적용 할 수 있다고 확신 뇌 16. 모든 프로토콜과 마찬가지로입니다하기세부 사항을 준수하는 것은 성공을 위해 중요하다, 조직에...

면역 시스템의 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리 학적 과정 6,10,11,13에서 발생합니다. 활발한 연구 발생할 수있는 영역은 면역계의 활성화를위한 다양한 트리거들을 포함, 다양한 세포 유형과 관련된 특정 질환 속에서 사이토킨 / 케 모킨 패턴 등 특정 약물에 의한 상기 프로세스의 모두의 조절은 국소 빈혈 - 재관류에 예증 상해 (급성 신부전에 대한 모델), (6 주 이상) 5 수리 또는 섬유증의 기간을 통해 유지된다 몇 시간 내에 조혈 세포 또는 CD45 + 세포 유래 면역 세포 또는 골수의 증가가,가, 12. 이들 면역 세포가 복구 5,12- 과정을 조율하는 염증성 및 항 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비 모두. 현재, 단일 세포 현탁액으로 세포 집단 라벨을 동시에 다수의 형광체를 사용할 수있는 능력은 광고와 증가4 ~ 5 레이저와 기계 계측법 현대적인 흐름을 배출. 이것은 실질적으로 자신의 기능 상태 3,7에 따라 세포 집단을 구별하는 기능을 추가했습니다. F4 / 80 로우는 CD11b 고 Ly6b 높은 CD206 낮은 적어도 3 개의 형광체는 생균, CD45 + (백혈구) 및 Ly6G- (호중구) 및 위해 게이트에 동일한 샘플 볼륨에 필요한 것 예를 들어, 정확하게 식세포 레이블을 이것은 매우 가능한 새로운 흐름 세포 계측기 3입니다. 그러나, 사이토 카인의 분비, 세포 증식, 세포 독성, 대 식세포 활성화 및 림프구 및 단구의 다양한 서브 세트의 수의 정량 하류 분석법뿐만 아니라 좋은 품질 (생균, 단봉)하지만 세포의 적당한 숫자를 필요로한다. 신장에서의 면역 체계는 적응 및 선천적 부품 및 여러 세포 유형 1,7,13 모두 이루어진다. 예를 들어, 마우스에서 두 아이(1.4 × 106 세포) 및 이들의 약 5~15% (1,400-4,200) 절연 신장 총 면역 세포 neys 함께 2~17%를 포함하는보고 (28,000-266,000)는 CD45 + 세포는 CD4 + 세포이다 한 , 5,12-. 이 CD4 + 세포의 작은 비율 (5-15%, 70-630)는 Foxp3의 + 세포 (그림 1) 일 수 있습니다. 때문에 (이 경우 CD45 + CD4 + Foxp3의 + 세포) 세포의 비율에서 이러한 단계 현명한 감소 관심 때로는 세포 인구 100 ~ 단순한 세포에 의해 표현된다. CD4 + CD45 + 세포 + Foxp3의 소수는 필수적 총 다수의 셀이 분리되어 상기 세포는 시토 킨 분비 분석 등 하류 연구 양질의 것으로한다. 또한, 상기 개체군은 정량 분석​​을 수행하기 위해 충분히 높은 숫자로 표현되지 않기 때문에 2-3 마우스로부터 신장을 결합 할 필요가있다. 따라서, 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리 스터드 위해 바람직Y 신장 질환과 관련된 면역 스펙트럼. 전통적으로, 신장 단핵 세포의 분리를 위해, 연구자들은 1 1,5,12 DNase를 포함 콜라게나 1A 또는 II와 같은 효소 digestions 다양한 사용했다. 잘 콜라게나 최적 농도 및 배양 4,14,15의 기간 동안 적정을 필요로, 로트 번호와 제조 회사에 따라 다릅니다 효소 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 또한, 콜라게나 제와 소화가 작은 조각으로 신장을 닦지 시간을 추가하여 반응을 정지 EDTA의 배양을위한 가열 (37 ℃로) 목욕 및 추가 시간에 신장 조각의 배양을 필요로한다. 또한, 이하 불임은 세포 배양을 필요로하는 일부의 하류 절차에 대해 달성 될 수있다. 더 중요한 것은, 관련 연구자 모든 변수에 따라, 그것을 실험실에 걸쳐 데이터를 해석 가변성 리드. 최근과티슈 기계 교란 / 균질 기 (16)의 개발은 콜라게나 제 소화 공정을 완전히 피할 신장이 간단한 기계적 파괴로 대체된다. 여기서, 우리는 매일 면역 세포 추출에 대한 신장 면역 세포의 분리를위한 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌와 간 (16) 등의 다른 연질 및 비 섬유 성 조직으로 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster 실험실 시스템</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 클래식 가방</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>헤모사이토미터</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>분석 플로우 사이토미터</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 인산염 완충 식염수 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 튜브, 캡 없음</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>고정 가능한 생존력 스테인</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (클론: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (클론: 30-F11)&nbsp; BV421&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (클론: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (클론: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (클론: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (클론: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (클론: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (클론: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (클론: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (클론: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (클론: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (클론: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (클론 : H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M 필터&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 튜브 50ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>또는 이와 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 튜브 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>설탕</td><td>피셔 화학물질</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>전송 피펫 세밀한 팁</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>플로우 사이토메터리 염색 버퍼 용액</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC 용해 버퍼</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr></tbody></table>

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

면역 체계 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리학적 과정에서 발생합니다. 면역 체계는 적응 및 선천성 구성 요소와 여러 세포 유형으로 구성됩니다. 때때로, 관심 세포 유형은 신장에서 분리된 많은 수의 전체 세포 중에서 매우 적은 수로 존재합니다. 따라서 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리는 신장 질환과 관련된 면역학적 문제를 연구하는 데 중요합니다. 전통적으로 신장 단핵 세포의 조직 분리는 다양한 수와 강도의 콜라겐 분해 효소/DNA를 사용하여 다양한 수의 생존 가능한 면역 세포를 생성하는 효소 분해를 통해 수행되었습니다. 최근에는 단일 세포 분리를 위한 기계적 조직 교란 물질이 개발됨에 따라 콜라겐분해 효소 분해 단계는 피하고 마우스에서 추출한 후 신장의 단순한 기계적 파괴로 대체되었습니다. 여기에서는 매일 면역 세포를 추출하기 위해 신장 단핵 세포를 분리하는 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 또한 신장 내 면역 세포의 하위 집합 분석의 예를 보여줍니다. 중요한 것은 이 기술이 간 및 뇌와 같은 다른 연조직 및 비섬유성 조직에 적용할 수 있다는 것입니다.

실행될 수있는 패널들의 수를 확실하게 신장에서 추출 될 수 면역 세포의 수에 의존한다. 여기서, 우리는이 패널, T 림프구 용 및 대 식세포 / 수지상 세포를 실행할 수있는 능력을 입증한다. T 림프구 패널에서, 우리는 먼저 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 패턴을보고 그림 1 (왼쪽 상단 도트 플롯)과 같이 관심의 인구를 묘사. 다음에, 생존 마커,이 경우에는 정착 생존 얼룩 (FVS510)의 분석 (도 1, 탑 중간 도트 플롯)에서 죽은 세포를 배제하기 위해 사용된다. CD45 골수 유래 조혈 세포 마커는 일반적으로 신장의 면역 세포를 묘사하기 위해 사용되며, 이들은 일반적으로 나이, 성별, 변형에 따라 전체 신장 면역 세포 2-18 %에서 다양 마우스 염증성 상태 (도 1, 오른쪽 상단 도트 플롯). CD45의 +에서 </<html>...

신장 면역 세포를 분리하기 위해 신뢰할 수 있고 효율적인 기술이 다운스트림 응용 프로그램에 필요합니다. 이를 위해서는 소수의 신장 면역 세포에 대한 표면 항체 라벨링이 필요합니다. 여기에서는 이 목표를 달성하는 것처럼 보이는 신장 면역 세포를 분리하는 간결한 방법을 설명합니다.

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

이 신장 면역 세포 분리 프로토콜의 전반적인 목표는 다색 유세포 분석을 이용한 하위 분석에 충분한 수의 생존 가능한 단일 세포 신장 면역 세포 현탁액을 추출하는 것입니다. 콜라겐분해효소(collagenase) 소화법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 하위 실험 분석을 위해 다량의 신장 면역 세포를 신뢰할 수 있고 경제적으로 분리할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 신장 면역생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다.예를 들어, 특정 신장 질환에서 어떤 신장 면역 세포 하위 집합이 사이토카인 또는 케모카인 분비를 조절하는지 확인하는 것입니다. 본 방법에서는 신장에서 면역 세포를 분리하는 과정을 시연합니다. 하지만 이 방법은 간이나 뇌와 같은 다른 기관에서 세포를 분리하는 작업에도 쉽게 적용할 수 있습니다.오늘은 신장 면역 세포를 수집하는 절차를 시연하겠습니다. 시연은 제 실험실의 연구 전문가인 Alex Meuth가 진행하겠습니다. 발가락 꼬집기에 반응이 없는 것을 확인한 후, 70% ethanol을 사용하여 마취된 마우스의 복부 하단을 소독하십시오.그 후, 가위를 사용하여 복강을 절개하고 복부 장기를 동물의 왼쪽으로 밀어 놓습니다. 구부러진 25 gauge 바늘이 장착된 1 cc 주사기를 사용하여 하대정맥에서 혈액을 채취하여 10 µL의 potassium EDTA가 포함된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 담습니다. 다음으로, 우심방에 작은 절개를 가하고 핀셋을 사용하여 심장을 조심스럽게 잡습니다.그런 다음, 20에서 30 mL의 차가운 PBS가 채워진 50 cc 주사기에 21-25 gauge 바늘을 장착하여 좌심실 첨단부에 삽입하고, 1~2분 동안 천천히 심실을 관류합니다. PBS가 처음 몇 mL 주입되면 심장이 하얗게 변색됩니다. 간의 변색은 대정맥을 통한 정맥 환류를 통해 간 내의 혈액이 씻겨 나가고 있음을 나타냅니다.관류가 완료되면 가위와 포셉을 사용하여 오른쪽 신장을 연결된 혈관, 지방 및 부신으로부터 분리합니다. 그런 다음 포셉으로 신장 캡슐을 조심스럽게 제거하고, 실험 목적에 맞게 신장의 무게를 잽니다. 다음으로, 얼음 위에 놓인 1 mL의 유세포 분석 버퍼가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브에 신장을 옮깁니다.5~80 mL 용량의 균질화 백에 적절한 시료 식별 정보를 표시하고 내부 거름망을 제거합니다. 백에 얼음처럼 차가운 유세포 분석 염색 버퍼 5 mL를 채운 후

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 마우스의 후복막 공간에서 신장을 추출하는 절차를 설명합니다. 추출된 신장을 더 미세절개하여 신낭과 주변 지방층이 없는 온전한 신장을 얻을 수 있습니다.

쥐에서 온전한 신장 추출: 쥐 모델에서 신장 캡슐 없이 신장을 얻는 기술

DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

이 프로토콜은 혈관 구조를 통한 세제의 사전 관류에 의한 Sprague Dawley 쥐 신장의 탈세포화를 설명하며, 인간 신장 상피 세포로 재증식하기 위한 템플릿 역할을 하는 무세포 신세포 외 기질을 생성합니다. 성장을 모니터링하기 위한 재세포화 및 레사주린 관류 분석법의 사용은 특별히 설계된 관류 생물반응기 내에서 수행됩니다.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

여기 우리는 신장 혈관 주위 Stromal 세포 (kPSCs) 소화 효소와 NG2 셀 농축 전체가 장기 관류에 따라 새로운 임상 등급 고립과 문화 방법 제시. 이 방법으로 세포 치료에 대 한 충분 한 셀 번호 취득 가능 하다.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

이 프로토콜의 주요 초점은 가능한 기본 glomeruli 문화 다양 한 다운스트림 응용 프로그램에에서 사용 하기 위해 최소한의 오염 물질을 효율적으로 분리 하는 것입니다. 격리 된 glomeruli 구성 요소 셀 형식 간의 구조적 관계를 유지 하 고 교양 비보 전 짧은 시간 동안 수 있습니다.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

여기에서 우리는 수질 신장 세포 유형의 표현을 개선하고 효소 조직 해리로 인한 유전자 발현 아티팩트를 방지하는 냉동 마우스 신장에서 고품질 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

human CD59/intermedilysin cell ablation 도구를 사용하여 신장 대식세포의 재생을 연구하기 위한 신장 대식세포의 선택적 절제에 대한 프로토콜이 여기에 보고되어 있습니다. 이 방법은 신장, 간 및 지방 조직에 있는 다른 세포 집단의 기능 및 재생을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool을 사용한 신장 대식세포의 급격한 고갈

이 연구는 쥐 중간막 세포(MC)와 생체 외 세포 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 세포는 세포 성장이나 단백질 발현을 손상시키지 않고 여러 번 배양, 동결, 재생 및 배양할 수 있습니다.

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

배우세요 신장 면역 세포의 신뢰성 높은 분리법을 통해 다색 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 효율적으로 추출하는 방법을. 이 기법은 콜라게나제 소화법보다 경제적이며 다양한 장기에 적용 가능합니다.

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

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