Name: 신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 Yarrowia lipolytica Po1g에서 효율적인 유전자 삭제 및 형질전환 방법을. KU70 유전자 삭제를 통해 동원 재조합률을 높이고 Cre/LoxP 시스템으로 마커 구조를 제거하여 바이오연료 및 생물생산을 위한 균주 공학에 활용합니다.

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우리는 기꺼이 싱가포르 (ETRP 1201102) 국립 환경 기관에서 자금 지원을 인정, 싱가포르 국립 연구 재단 (NRF-CRP5-2009-03), 싱가포르의 과학, 기술 및 연구를위한 기관의 경쟁력 연구 프로그램 ( 1,324,004,108), 글로벌 R &amp; D 프로젝트 프로그램, 지식 경제부, 한국 (N0000677), 국방 위협 감소기구 (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) 및 합성 생물학 싱가포르 국립 대학의 이니셔티브 ( DPRT / 943 / 09 / (14)).

Y.의 1 세대 lipolytica KU70 삭제 스트레인 <ol><li> 붕괴 카세트의 건설 주 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 사용 된 모든 프라이머는 표 1 참조. <ol><li> 는 Leu2 발현 카세트를 증폭하기위한 PCR 프라이머 디자인 (20)는 Y.부터 (표 1 참조) 각각과, 긴 역방향 프라이머 (표 1 # 2) lipolytica 발현 벡터 및 5 &#39;및 3&#39;에에 loxP 부위를 도입 긴 정방향 프라이머 (표 1의 1)과는 Leu2 카세트 끝. 복제 프로세스의 다음 단계에 대한 추가 제한 사이트를 소개하고, 프라이머 # 1에서 빵 HI 제한 사이트를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 표 2에 설명 된대로 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하여 PCR을 수행한다. </li><li> PCR의의 purificatio를 사용에 loxP-프로모터는 Leu2 - 터미네이터에 loxP 카세트 PCR 생성물을 정제하여제조업체의 지침에 따라 n 개의 키트. 제조업체의 지침 (21)에 따라 정제 된 PCR 제품에 3&#39;-A의 돌출을 추가합니다. 사용 T4 DNA 리가 아제는 표 3에 따라 플라스미드 T-는 Leu2를 얻을 수있는 TA 클로닝 벡터에 A-꼬리 PCR 제품을 결찰합니다. </li><li> PCR은 프라이머 Y.에서의 # 3 / # 4를 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 5 &#39;상류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA 22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. <ol><li> 더블. 표 4에 따라 골목 II의 BamHI 및 효소 정제 된 PCR 생성물 및 T-는 Leu2 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 정제를 결찰하는 T4 DNA 리가 제를 사용하여 골목 II로 PCR 생성물을 분해 / T-는 Leu2의 빵 HI 부위를을 수득표 3에 따라 플라스미드 T-LEU2-5E. </li></ol></li><li> PCR은 프라이머 Y.에서의 # 5 / # 6을 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 3 &#39;하류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA 22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 두 번 정제 된 PCR 제품 및 표 4에 따라 없음 I 및 이니까 I 효소와 T-LEU2-5E 플라스미드를 모두 소화. <ol><li> 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제. 이어서, 정제를 결찰하고 없음 I / 이니까 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 플라스미드 T-KO를 수득 T-LEU2-5E의 I 사이트로 PCR 생성물을 소화. </li></ol></li><li> 붕괴 카세트를 생산하기 위해 표 4에 따라 골목 II 및 이니까 I 효소로 플라스미드 T-KO 다이제스트 (그림 1 </strong&gt;). 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 DNA 단편을 정제 하였다. </li></ol></li><li> 유능한 세포의 준비와 Y의 변환 lipolytica PO1G 변형 <ol><li> 관할 세포의 준비 <ol><li> Y.의 식민지 접종 YPD 배지 10 ㎖ (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스 트 로즈, 50 mM의 시트르산 염 완충액 pH 4.0) 100 mL의 플라스크에서 신선한 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 플레이트에서 lipolytica PO1G 균주. 포화 될 때까지 20 시간 (분광 광도계를 이용하여 측정 한 OD 약 15의 600)를 위해 225 rpm에서 30 ° C 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션. </li><li> 실온에서 5,000 × g으로 5 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛. 20 ml의 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, pH를 7.5)로 세포를 씻어 단계 1.2.1.2에 설명 된대로 세포 펠렛. (아세트산으로 pH를 6.0으로 조정) 0.1 M 리튬 아세테이트 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 실내 템페에서 10 분 동안 배양rature. </li><li> 멸균 1.5 ml의 튜브에 관할 세포 (100 μl를) 나누어지는. 바로 아래의 변형 단계로 진행, 또는 장기간 저장을 위해 -80 ℃에서 최종 농도가 25 % (v / v)의 저장에 글리세롤을 추가한다. </li></ol></li><li> 변환 <ol><li> 부드럽게 적격 세포 100 ㎕와 함께 변성 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖) 및 정제 붕괴 카세트 1-5 μg의 10 μL를 혼합하고, 15 분 동안 30 ℃에서 배양한다. </li><li> (0.1 M 리튬 아세테이트의 pH 6.0에 용해) 40 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) -4000 700 μl를 추가, 잘 혼합하고 60 분 동안 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다. 주 : 대신에 (일반적으로 종래의 효모의 형질 전환에 사용 된)의 PEG-3350, 4000의 평균 분자량 PEG를 사용하는 것이 중요하다. </li><li> 가열은 60 분 동안 39 ° C의 물을 용기에 튜브를 배치하여 전환 혼합물 충격. </li><li> 1 ml의를 YPD 매체를 추가하고30 ° C에서 2 시간, 225 rpm으로 대한 복구 할 수 있습니다. 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리기, 상등액을 제거하고 TE 완충액 1 ml 중에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리하여 세포를 Repellet하고 상층 액을 제거한다. TE 완충액 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁하고 선택적 플레이트 (예를 들어, 류신 - 결핍 플레이트) 위에 플레이트 2-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다. </li><li> 10 단일 콜로니 4를 선택하고 YPD 배지 2 ㎖에 개별적으로 접종. 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 하룻밤 품어. 각각의 프라이머 # 55 / # 56의 두 세트, 그리고 # 56 / # 57을 사용하여 표 5에 따라 형질 전환 (22)로부터 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 긍정적 인 식민지를 확인합니다. 참고 : 없음 나는 pYLEX1 벡터 (Y)로 변환된다 선형화 수를 카운트하여 변환 효율을 결정하기 위해 lipolytica PO1G는 적격 세포μg의 플라스미드 당 집락 형성 단위 (CFU)의 DNA는 23을 사용했다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 마커 구조 <ol><li> Cre 호텔 발현 플라스미드의 구축 <ol><li> pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH의 건설 <ol><li> 디자인 프라이머 (20)는 CRE와 HPH의 오픈 리딩 프레임을 증폭 PCR합니다. 포워드 프라이머 # 82, # 84에 시작 코돈의 상류 추가 아데닌 뉴클레오티드를 추가하고, PCR은 CRE의 오픈 리딩 프레임을 증폭 역방향 프라이머 # 83, # 85을에서 정지 코돈의 하류 KPN I 제한 사이트를 삽입하고 표 2에 따라 pSH69 (수탁 번호 HQ412578) (24)로부터 HPH. </li><li> CRE 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용 HPH 단편 모두 정제. 다이제스트 모두 내가 TABL에 따라 효소 KPN과 정제 된 CRE와 HPH 조각예 4.. 표 4에 따라 PML KPN I 및 I 효소로 pYLEX1 플라스미드 다이제스트 두배 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. </li><li> Y.의 PML I / KPN I 사이트에 정제 및 소화 CRE와 HPH 조각을 결찰 표 3 당으로 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 각각 pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH를 산출 lipolytica 발현 벡터. </li></ol></li><li> pSL16-CRE-HPH의 건설 <ol><li> PCR 프라이머의 # 86을 사용 pYLEX1-CRE에서 CRE의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 / # 87 표 2에 따라, 샐 I / pst 파일 I 제한 부위를 플 랭킹. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 . <ol><li> 두 살 난과 함께 정제 된 PCR 제품 및 pSL16-CEN1-1 (227) 플라스미드 (25)을 모두 소화PST 표 4에 따라 I 효소. 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 이어서, 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE을 만드는 대응하는 부위에서 pSL16-CEN1-1 (227)로 분해하고 정제 PCR 생성물을 결찰. </li></ol></li><li> PCR 프라이머를 사용 pYLEX1-HPH에서 HPH의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 # 88 / # 89. 표 2에 따라,을 XhoI /을 BglII 제한 부위를 플 랭킹 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 . <ol><li> 더블. 정제 된 PCR 생성물 및 표 4에 따라,와을 XhoI을 BglII 효소 pSL16-CRE 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 그리고, 대응에 pSL16-CRE로 정제 절단 PCR 생성물을 결찰위치는 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE-HPH를 생성한다. 참고 : 결과 Cre 호텔 발현 플라스미드, pSL16-CRE-HPH는, 선택 가능한 하이 그로 마이신 B 마커를 항구 및 센트로 미어와 에피 좀 복제 벡터 (그림 2)입니다. </li></ol></li><li> 표 4에 따라 적절한 제한 효소 (예를 들어, 샐 I / 태평양 표준시 나는, 벡터에서 삽입을 절제하는)와 소화에 의해 모든 구조를 확인합니다. </li></ol></li></ol></li><li> CRE 재조합 효소 매개 마커 구조 <ol><li> 위의 섹션 1.2에 설명 된 변환 프로토콜 다음 KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포로 pSL16-CRE-HPH 변환. YPD 플러스 하이 그로 마이신 B 상에 플레이트 형질 전환 세포 (YPDH) 플레이트 (400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B를 포함), 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 품어. </li><li> 표 5에 따라 식민지 PCR을 수행하여 프라이머 # 84 / # 85 긍정적 인 식별변환 후 pSL16-CRE-HPH 플라스미드를 함유하는 콜로니. 주 : # 84 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 # 85 HPH 유전자 (표 1)의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 양성 클론 만이 PCR 반응에서 특정 PCR 생성물을 생성한다. </li><li> 긍정적 인 복제를 선택하고 YPDH 매체 2 ㎖에 접종하고, 포화 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다. 분광 광도계로 OD 셀 (600)을 측정한다. ~ (15)의 OD 600에서 세포를 수확. 실온에서 5 분 동안 5000 × g으로 원심 분리하고, 멸균 수 2 ㎖로 한번 세척 하였다. </li><li> 초기 OD 0.1 600 YPD 배지 2 ㎖로 세포를 재 접종하고, 세포를 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 성장을 허용한다. 킬 YPD 플레이트 상에 하룻밤 세포 배양은 단일 콜로니 (23)를 분리합니다. 복제 판 YPD, YPDH 위에 식민지, 그리고 류신 결핍 판 (23) </s&gt;입니다. 참고 : (그림 3) 모두는 Leu2 마커를 잃고 pSL16-CRE-HPH 플라스미드는 YPD 플레이트에서 성장할 수 식민지를. </li></ol></li></ol> 알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자의 3. 삭제 <ol><li> Y.에서 검색을 수행 삭제 26 유전자 후보들을 식별하는 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (BLAST)를 사용 lipolytica 게놈 데이터베이스. 입력 S. 단백질 서열 BLAST 검색 도구로 cerevisiae의 알코올 탈수소 효소 I을 (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). 주 : BLAST 검색 도구가 Y. 가장 유사한 단백질 서열을 반환 lipolytica 게놈 데이터베이스. </li><li> # 56 (표 1)에 프라이머 번호 7 PCR로 결실 카세트를 구축하고, 제한 효소 절단 및 상기 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 동일한 방법을 이용하여 라이 게이션 반응을 수행한다. </li><li> 예습KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포는있다 변환을 수행하고 위의 섹션 1.2에 설명 된 프로토콜에 따라 # 81 (표 1)에 # 55 프라이머, # 58 긍정적 인 식민지를 식별하기 위해 PCR을 수행합니다. 참고 예로서, YALI0E17787g 유전자의 삭제를위한 절차는도 4 및 5에 기재되어있다. 상동 재조합 속도에 1킬로바이트 및 2킬로바이트 긴 상동 지역의 효과를보고있다. </li></ol>

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이 연구에 대한 우리의 목적은 Y.에서 대상 유전자 녹아웃의 신속하고 효율적인 생성을 활성화하는 것입니다 이를 위해 lipolytica PO1G 균주. 몇몇 고려 해결 될 필요가있다. 먼저, 높은 변환 효율이 요구된다. Y.에 대한 따라서, 효율적이고 편리한 화학 변환 프로토콜 lipolytica PO1G 균주는 본 연구에서 설명했다. PEG-4000의 사용은이 균주의 성공적인 전환을위한 중요한 인자이다. 대신 PEG-4000의 (S. cerevisiae에의 변환에) PEG-3350을 사용하는 경우 어떤 형질 전환 플라스미드 변환에 얻을 수 없습니다. 또한, 새로 제조 된 세포를 이용한 세포의 제조 능력이 균주 높은 변환 효율을 얻는 것이 필요하다. 둘째로,이 균주에서 지배적 NHEJ 통해 비 - 상 동성 재조합 랜덤 통합 이벤트를 줄이고 효율적인 변환 방법은 다음 KU7를 구성하는데 사용 하였다0 녹아웃 돌연변이....

사카로 마이 세스 세레 비지에, Yarrowia의 lipolytica, 비 전통적인 효모와는 달리, 환경 조건의 1, 2의 변화에 대응하여 효모 또는 균사의 형태로 증가 할 수 있습니다. 따라서,이 동종 이형 누룩 곰팡이 분화, 형태 형성 및 분류 3,4,5- 연구를위한 좋은 모델로서 사용될 수있다. 이것은 일반적으로 널리 유기산, 폴리 알콜, 아로마 화합물, 유화제 및 계면 활성제로 -6,7,8,9- 식품 첨가물의 종류를 생성하기 위해 사용되는 안전한 (GRAS) 효모 종으로 간주된다. 이는 최대 10 세포 건조 중량의 70 %를하기 위해, 의무적의 aerobe 자연스럽게 다량으로 지질을 축적 할 수있는 공지의 유성 효모, 즉이다. 또한 영양소 11,12,13 같은 폐 자원 잔기의 종류를 포함한 성장 탄소원의 넓은 스펙트럼을 이용할 수있다. 이러한 독특한 기능은 모두 Y.을 매우 매력적인 lipolytica다양한 생명 공학 응용 프로그램. Y.의 전체 게놈 서열 비록 lipolytica가 14, 15을 게시되었습니다,이 틀에 얽매이지 않는 효모의 유전자 조작은 다른 효모 종보다 더 복잡합니다. 첫째, 효모 종의 변화로 인해 안정하고 효율적인 유전자 변환 시스템 (16, 17)의 부재에 훨씬 덜 효율적이다. 에피 솜 본연 플라스미드 시스템이 효모 (18)에서 발견되지 않은 둘째, 선형 발현 카세트의 게놈 통합 힘든 공통 관심 유전자의 발현에 사용된다. 이 효모에 정확한 상동 재조합을 통해 효율성을 대상으로 유전자가 낮은 대부분의 통합 이벤트가 비상 동 말단 연결 (NHEJ) (19)를 통해 발생하기 때문에 유전자 노크 아웃 및 노크 인의 셋째, 세대가 제한됩니다. 본 연구에서는 Y.에 최적화 된 변환 프로토콜 신고 lipolytica </EM&gt;, 쉽고 빠르게, 효율적이고 재현 PO1G 변형,. 정확한 동성 재조합 빈도를 향상시키기 위해, 우리는 NHEJ 경로에서 중요한 효소를 코딩하는 유전자를 KU70 삭제. 최적화 된 변환 프로토콜을 사용하고, 1킬로바이트의 Y. KU70의 유전자를 상동 영역을 포함하는 선형 측면 녹아웃 카세트를 변환하여 lipolytica PO1G가 성공적으로 삭제되었습니다. 이 유전자 삭제 방법의 견고성은 다음 PO1G KU70 Δ 변형 알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자를 대상으로 입증되었다. 그것은 KU70 결실 균주는 야생형 균주 PO1G보다도 타겟팅 동성 재조합을 매개 유전자의 상당히 높은 효율을 발휘하는 것이 확인되었다. 또한, 하이 그로 마이신 B 내성의 마커를 운반하는 복제 성 Cre 호텔 발현 플라스미드는 마커 복구를 수행하도록 구성 하였다. 마커 구조는 일에 대상 유전자의 여러 라운드를 용이하게전자는 유전자 결실 돌연변이를 획득했습니다. 유전자 삭제 게다가, 여기에 설명 된 유전자 변형 및 유전자 삭제를위한 우리의 프로토콜은 특정 유전자좌에 유전자를 삽입하고, Y.로 사이트 별 돌연변이를 소개하고 적용 할 수 있습니다 lipolytica 게놈.

<table><tbody><tr><td>시약/재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmole DNA oligos</td></tr><tr><td>Y. lipolytica strain Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>야생형 균주 W29의 류신 보조영양 유도체 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vector pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica 발현 벡터</td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>플라스미드 pGEM-T 벡터의 클로닝 및 증식</td></tr><tr><td>용&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA 클로닝 벡터</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>플라스미드 분리용</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>아가로스 겔에서 DNA 단편을 추출 및 증폭 반응에서 PCR 산물 정제</td></tr><tr><td>iProof high-fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>고충실도 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소& 주의;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>항생제</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb DNA 사다리</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1kb DNA 사다리</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이</td>트 <td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬 (425-600 &micro; m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA 로딩 염료</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB without 아미노산 Sigma</td><td></td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO 보충제 - Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Broth</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB 한천</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td>, <td>Biorad</td><td>T100, Thermal Cycler,</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr>, <tr><td>고정식/진탕 인큐베이터</td>, <td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>, Thermo-shaker</td><td>, Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>젤 이미저</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia의 lipolytica는 비 병원성 동종 이형 엄격 호기성 효모 종입니다. 독특한 생리 기능과 신진 대사 특성으로 인해,이 틀에 얽매이지 않는 효모뿐만 아니라 곰팡이 차별화의 기본 성격의 연구를위한 좋은 모델뿐만 아니라 생화학 적 생산과 광범위한 유전자 조작을 필요로 다양한 생명 공학 응용을위한 유망한 미생물 플랫폼입니다. Y.의 그러나, 유전자 조작 lipolytica 인해 주로 KU70 유전자에 기인 할 수있는, 효율적이고 안정적으로 유전자 형질 전환 시스템의 부족뿐만 아니라 비 - 상 동성 재조합의 매우 높은 속도로 제한되었다. 여기, 우리는 효율적인 유전자 변환에와 Y 유전자 삭제 쉽고 빠른 프로토콜을보고 lipolytica PO1G. Y.로 외래 DNA의 효율적인 변환을위한 우선, 프로토콜 lipolytica PO1G가 설립되었다. 세코ND, 표적 유전자의 추가적인 삭제 향상된 이중 교차 상동 재조합 율을 달성하기 위해 유전자는 KU70 1킬로바이트 동성 암 반송 파쇄 카세트 바뀌는 삭제 하였다. 셋째, KU70 유전자의 삭제 후 향상된 유전자 결실 효율을 입증하기 위해, 우리는 개별적 KU70 녹아웃 플랫폼 균주에서 동일한 절차를 사용하여 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 코딩하는 11 표적 유전자를 삭제. 이것은 정확한 상동 재조합 속도가 삭제 0.5 % 미만에서 실질적으로 증가하는 것이 관찰 PO1G KU70 Δ 11에서 표적 유전자의 단일 유전자 결실에 대한 33 % -71 %의 PO1G에서 KU70 유전자. 하이 그로 마이신 B 내성 마커와 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 운반하는 복제 성 플라스미드를 구축하고, 효모 녹아웃 균주의 선별 마커 유전자는 결국 타지 여러 발사를 용이 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의해 제거테드 유전자 조작. 그 결과 단일 유전자 삭제 돌연변이 생물 연료 및 생화학 생산에 응용 가능성이 있습니다.

선형화 된 Y. lipolytica 발현 벡터 Y.의 게놈에 PBR 도킹 플랫폼에 삽입 하나의 크로스 오버 재조합 (27)를 수행하여 lipolytica PO1G 변형. 본 연구에서 확립 급속 화학 변환 절차, Y. 선형화를 사용하여 lipolytica 발현 벡터 성공적&gt; 100 CFU / μg의 DNA의 변환 효율 야생형 PO1G 균주에 형질 전환 하였다. 1킬로바이트 상동 서열에 의해 형벌 녹아웃 카세트는 PO1G 균주에 형질 전환하고, KU70 유전자가 성공적으로 (그림 1)을 삭제했습니다. 여기서, 정방향 프라이머 # 56 KU70 유전자의 5 &#39;상 동성 암에 위치한 서열에 어닐링. 역방향 프라이머 # 55이는 Leu2 마커의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 역방향 프라이머 ...

우리는 유전자 결실 효율 향상을 위한 Yarrowia lipolytica Po1g 균주의 분자 유전자 조작에 대한 방법을 보고합니다. 그 결과 엔지니어링된 Y. lipolytica 균주는 바이오 연료 및 생화학 생산에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

본 절차의 전반적인 목표는 형질전환 DNA 구축, DNA 형질전환, 형질전환체 선택 및 상동 재조합을 통한 표적 유전자 결실을 포함하여, 비전형적인 효모 종에 대한 효과적인 유전 공학 방법을 개발하는 것입니다. 연구진은 바이오 연료 및 바이오 화학 물질 생산에 응용 가능한 yarrowia lipolytica PO1G 균주에서 매우 효율적인 유전자 결실 기술을 확립하였습니다. PCR 매개 유전자 파괴와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 다량의 유전자 결실 카세트를 확보할 수 있으며, 선택 가능한 마커의 범위가 넓다는 점입니다.본 연구에서는 효율적이고 간편하며, 신뢰할 수 있고 재현 가능한 Yarrowia lipolytica PO1G 균주의 유전적 형질전환 프로토콜을 보고합니다. 본 연구에서 구축한 Yarrowia lipolytica PO1G KU70 결손 균주는 매우 효율적인 상동 재조합 빈도를 보여, 표적 유전자 결손의 더 빠르고 쉬운 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 PCR을 통해 Y.lipolytica 발현 벡터로부터 LEU2 발현 카세트를 증폭하고, LEU2 카세트의 5-prime 및 3-prime 말단에 LoxP 사이트를 도입하는 것입니다.클로닝 과정의 후속 단계를 위해 프라이머 1에 BamHI 제한 효소 인식 부위도 도입하였습니다. LoxP 프로모터 LEU2 터미네이터 LoxP 카세트를 정제한 후, 정제된 PCR 생성물에 3' 말단 A-오버행을 추가합니다. 그다음 A-tailing 처리된 PCR 생성물을 TA 클로닝 벡터에 결합시켜 플라스미드 T-LEU2를 제작합니다.두 번째 PCR 단계는 Y.lipolytica PO1G 게놈 DNA로부터 프라이머 3 및 4를 사용하여 KU70 유전자의 5' 상류 1 kb 서열을 증폭하는 것입니다. 그 후, 정제된 PCR 산물과 T-LEU2 플라스미드를 SacII 및 BamHI 효소로 이중 제한효소 절단하고, 정제 및 절단된 PCR 산물을 T-LEU2의 SacII BamHI 부위에 결합시켜 T-LEU2-5E 플라스미드를 생성합니다. 세 번째 PCR 단계는 Y.lipolytica PO1G 게놈 DNA로부터 프라이머 5 및 6을 사용하여 KU70 유전자의 3' 하류 1 kb 서열을 증폭하는 것입니다.그 후, 정제된 PCR 산물과 T-LEU2-53 플라스미드 모두를 NotI 및 NdeI 효소로 이중 절단하고, 정제 및 절단된 PCR 산물을 T-LEU2-5E의 NotI NdeI 부위에 결합시켜 T-KO 플라스미드를 생성합니다. 마지막으로, T-KO 플라스미드를 SacII 및 NdeI 효소로 절단하여 파괴 카세트를 제작합니다. 이 절차는 컴피턴트 Y.lipolytica PO1G 세포를 준비하는 것으로 시작합니다.신선한 효모 추출물 펩톤 포도당(YPD) 플레이트에서 *Y. lipolytica* PO1G 균주 콜로니를 채취하여 100mL 플라스크에 담긴 10mL의 YPD 배지에 접종합니다. 포화 상태가 될 때까지 30°C의 진탕 배양기에서 225 RPM으로 20시간 동안 배양합니다. 다음 날, 상온에서 5,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.20 mL의 TE 버퍼로 세포를 세척하고 세포를 다시 펠렛화합니다. 상층액을 제거한 후, 0.1 M 리튬 아세테이트 1 mL에 세포를 재현탁하고 상온에서 10분 동안 배양합니다.로 역능 세포를 멸균된 1.5 mL 튜브에 100 µL씩 분주합니다.변성된 salmon sperm DNA 10 µL와 정제된 disruption cassette 1~5 µg을 competent cells 100 µL와 함께 부드럽게 혼합하여 즉시 형질전환 절차를 진행합니다. 30 °C에서 15분 동안 배양합니다. 40% polyethylene glycol 1000 700 µL를 첨가합니다.잘 혼합한 후, 30 °C의 진탕 배양기에서 225 RPM으로 60분 동안 배양합니다. 다음으로, 튜브를 39 °C 항온 수조에 60분 동안 두어 형질전환 혼합물을 히트척(heat chuck) 처리합니다. 60분 후, 튜브에 YPD 배지 1 mL를 첨가하고 30 °C, 225 RPM 조건에서 2시간 동안 세포를 회복시킵니다.실온에서 9000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 1 mL의 TE 버퍼에 재현탁합니다. 세포를 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.펠렛을 100 µL의 TE 버퍼에 재현탁하고 류신 결핍 배지에 도말합니다. 플레이트를 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. CRE 재조합 효소 매개 마커 복구를 수행하기 전에, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CRE 발현 플라스미드를 제작합니다.이 에피솜 복제 플라스미드의 특징에는 CRE 재조합효소 유전자, 하이그로마이신 B 내성 마커 및 암피실린 내성 유전자가 포함됩니다. 이 절차를 시작하려면 앞서 시연한 형질전환 프로토콜에 따라 CRE 발현 플라스미드를 KU70 녹아웃 균주의 컴피턴트 세포(competent cells)에 형질전환하십시오. 형질전환된 세포를 하이그로마이신 B가 첨가된 YPD 플레이트에 도말하고 30 °C에서 2~3일 동안 배양하십시오.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 양성 콜로니를 확인하기 위해 콜로니 PCR을 수행한 후, 양성 클론을 하나 선택하여 2 mL의 YPDH 배지에 접종하고 30 °C 진탕 배양기에서 225 RPM으로 하룻밤 동안 포화 상태가 될 때까지 배양합니다. 다음 날, 분광광도계를 사용하여 배양액의 OD 600을 측정합니다. 세포의 OD 600이 약 15에 도달하면, 실온에서 5000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 수확합니다.상청액을 제거하고, 2 mL의 멸균수를 첨가한 후 다시 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포를 YPD 배지에서 재현탁합니다. 초기 OD 600이 0.1이 되도록 2 mL의 YPD 배지에 세포를 다시 접종합니다. 그리고 30 °C 인큐베이터에서 225 RPM으로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.다음 날, 단일 콜로니를 분리하기 위해 하룻밤 동안 배양한 세포 배양액을 YPD 플레이트에 스트리킹합니다. 콜로니가 나타날 때까지 30 Celsius에서 배양합니다. 콜로니를 YPD, YPDH 및 Leucine 결핍 플레이트에 복제 도말합니다.플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다. KU70 녹아웃 플라스미드의 모식도가 표시되어 있습니다. SacII 및 NdeI 효소로 플라스미드를 제한 효소 절단하면 파괴 카세트(disruption Cassette)가 생성됩니다.젤 전기영동을 통해 disruption cassette의 예상 크기인 4.3 kilobase 밴드의 존재를 확인합니다. PCR을 통해 Y.lipolytica PO1G의 KU70 유전자 결손을 확인합니다. 1번부터 10번 레인은 형질전환체의 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 생성물을 포함하며, 11번 레인은 야생형 균주의 PCR 생성물을 포함합니다.7번 레인은 양성 knockout을 보여주는 반면, 1번 레인은 위양성을 나타냅니다. KU70 knockout 균주의 선택 마커 유전자는 최종적으로 CRE recombinase의 발현을 통해 제거되었습니다. 마커가 없는 양성 형질전환체는 YPD 플레이트에서만 성장하는 것을 통해 확인되었습니다.KU70 유전자의 결손 이후 유전자 결손율의 증가를 검증하기 위해, KU70 녹아웃 균주에서 동일한 절차를 사용하여 11개의 표적 유전자를 개별적으로 결손시켰습니다. 각 유전자 파괴는 PCR로 확인하였으며, 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있으며 1번, 2번, 4번 레인이 양성 녹아웃으로 확인되었습니다. Yarrowia lipolytica PO1G KU70 결손 platinum 균주는 다른 염색체 결손 돌연변이를 구축할 때 경로 공학 및 균주 최적화 응용을 위한 더 효율적인 시스템이자 더 나은 선택지를 제공합니다.이 영상을 시청한 후에는 yarrowia lipolytica PO1G 세포에서 상동 재조합을 이용한 표적 단일 유전자 결손 전략에 대해 종합적으로 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

그린 몬스터 방법은 리포터 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질로 표시된 여러 삭제의 급속한 조립이 가능합니다. 이 방법은 반복 삭제의 성적 구색의 사이클 등 삭제를 들고 세포의 형광 기반의 강화를 통해 효모 변종 운전에 기반을두고 있습니다.

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

적응 진화와 분리 기술을 설명하고 신속하게 육탄 당과 효소의 오탄당의 혼합 당이 undetoxified 가수 분해물을 당화 및 40g / L의 에탄올을 통해 축적 소비 할 수있는 Scheffersomyces stipitis 변형의 파생 상품 NRRL Y-7124을 얻었다 증명된다.

에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

미생물 공학의 '설계-구축 테스트' 주기의 병목 현상은 균주의 기능적 스크린을 수행할 수 있는 속도입니다. 우리는 액적 기반 RNA 시퀀싱을 활용하는 실험당 수백에서 수천 개의 효모 세포에 적용되는 균주 스크리닝을 위한 높은 처리량 방법을 설명합니다.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 Saccharomyces eubayanus 의 전사 활성을 측정하여 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링함으로써 대사 적응의 실시간 분석을 가능하게 하고 다양한 조건에서 산업 발효를 위한 균주 최적화를 지원합니다.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

배우세요 Yarrowia lipolytica Po1g에서 효율적인 유전자 삭제 및 형질전환 방법을. KU70 유전자 삭제를 통해 동원 재조합률을 높이고 Cre/LoxP 시스템으로 마커 구조를 제거하여 바이오연료 및 생물생산을 위한 균주 공학에 활용합니다.

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

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