Name: 인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 학습하세요 흑색 종 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 종양 면역 요법과 전이성 흑색 종 치료에 무제한의 종양 특이 T 세포를 제공하여 암 면역 치료를 혁신합니다.

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조직 조달 코어의 Deborah Postiff 씨와 Jackline Barikdar 씨, 그리고 미시간 대학교 만능 줄기 세포 코어 연구소의 Cindy DeLong 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 미시간 대학의 스타트업 자금과 중앙 외과 협회(Central Surgical Association), 미국 외과의 협회(American College of Surgeons), 흑색종 연구 연합(Melanoma Research Alliance) 및 NIH/NCI(1K08CA197966-01)의 보조금으로 F. Ito에 지원되었습니다.

참고 : 환자는 셀위원회가 연구를 승인 줄기 임상 시험 심사위원회와 인간 다 능성에 참여하는 동의를 제공해야합니다. 1. 분리 및 TILS의 문화 <ol><li> 병리 서비스 / 조직 조달 코어에서 병리 조직 학적 진단을 위해 필요하지 않습니다 종양 물질을 얻습니다. 30 ml의 종양 수집 미디어 (표 1)과 50 ml의 튜브에 종양 표본의 20-100g를 놓습니다. </li><li> 고체, 회사, 가위를 사용하여 깨지기 쉬운 및 / 또는 피 묻은 괴사 지역에서 종양 표본의 정상 조직을 해부하다. 괴사 조직을 제거한 후 가능한 한 작게 시편을 말하다하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 dissociator 종양 분리 키트 (인간)를 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 다진 표본. 50 ML 튜브에 설정되어있는 70 μm의 셀 스트레이너와 서스펜션 필터와 함께 스트레이너을 2 회 반복한다RPMI 1640 2 ㎖. </li><li> 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 T 세포 배지 (표 1) 10ml에 세포를 재현 탁. </li><li> 예컨대 피콜 100 % 구배 용액 10 ㎖의 하부 단계 및 둘 베코 인산염으로 희석하고 75 % 구배 용액 30 ㎖의 중간 단계로 50 ㎖의 튜브 (구배 용액)으로 두 단계 구배 용액을 준비 완충 식염수, 아니 칼슘, 아니 마그네슘 (D-PBS (-)). </li><li> (단계 1.5) 구배 용액에 (단계 140에서) 세포 현탁액 층을 포함한다. 45 분 동안 20 ° C에서 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 100 % 구배 용액 및 50 ㎖ 튜브에서 75 % 구배 용액의 계면에서 농축 TILS을 함유하는 층을 수집한다. D-PBS 중 20 ~ 30 ml를 첨가하여 농축 TILS와 용액의 희석 층 (-). </li><li> 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 10 ml의에 TIL 풍부한 부분을 재현 탁T 세포 매체. </li><li> 배양 37 ° C에서 6 웰 플레이트에 2 T 세포 배지 ㎖의 6000 IU / ml의 재조합 인간 (RH) IL-2로한다 (단계 1.8)에서 분획, 5 % CO 2. </li><li> 배양 개시 후 5 일에 절반 미디어를 변경 한 후 2-3 일마다. </li><li> 1의 비율로 세포 분열 2 : 트립신없이 부드럽게 80~90%에 포화 상태에 도달 할 때 우물의 수를 두배로 현탁 한 후. 6000 IU / ml의 신선한 T 세포 매체와 rhIL-2의 절반 량 (1ml)에 추가한다. </li></ol> 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 셀 플레이트 2. 준비 <ol><li> 80-90% 합류 (3-4 × 106 세포)까지 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 SNL 피더 세포 배지 (표 1) 10ml에 문화 SNL 피더 세포로 진행한다. </li><li> 직접 SNL 피더 세포 배양 접시에 0.4 ㎎ / ㎖ 마이 토마 이신 C 용액 310 μl를 추가하고 37 ° C 2 시간 15 분, 5 % CO 2 부화. 미디어 a를 대기음ND 5ml를 D-PBS로 두 번 세포를 씻어 (-). </li><li> 0.5 ml의 0.25 % 트립신 / 1mM의 EDTA를 첨가하고 세포를 해리 1 분 동안 실온에서 배양한다. 중화 SNL 피더 세포 미디어 4.5 ML을 추가하고 하나의 현탁액에 세포를 재 - 일시 중지합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 세포를 전송합니다. 미디어 대기음 SNL 피더 세포 배지 10ml에 다시 현탁 한 후 혈구 세포 계산. </li><li> 플레이트 1.5 × 10 6 10cm 접시에 SNL 피더 세포의 웰 당 세포와 37 ° C에서 품어, 5 % CO 2. 삼일 이내에 SNL 피더 세포를 사용합니다. </li></ol> 센다이 바이러스를 사용하여 iPSCs의 3 세대 (SEV) 벡터 <ol><li> 수확 TILS 및 플레이트 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / ㎖) TILS 5 × 105 세포를 활성화하고 수용성 마우스 항 - 인간 CD28 (/ ㎖ 5 μg의) (단계 1.11)에서, rhIL-2 세에서 6 웰 플레이트에서 T 세포 배지 2 ㎖에 (6000 IU / ㎖)7 ° C를 5 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 피펫을 사용하여 15 ml의 튜브 (단계 3.1)을 TILS를 수확하고, 혈구와 세포 수를 계산합니다. </li><li> 500 μL의 rhIL-2 1 판 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / mL)로 TILS의 X 105 세포 및 가용성 마우스 항 - 인간 CD28 (5 μg의 / ㎖) (60 IU / ㎖) 활성화 37 ° C에서 24 웰 플레이트에 웰 당 프로그래밍 미디어 (표 1), 24 시간 동안 5 % CO 2의. SEV 감염에 대한 3 우물을 준비합니다 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC (1도) SEV 감염 (GFP : 녹색 형광 단백질) (1도) 세포 수 (1 웰). </li><li> (단계 3.3에서) 24 시간 후, 혈구와 세포 수를 계산하고 감염의 다양한 (3-20) 다중도 (MOI) 각 바이러스의 양을 결정합니다. -80 ° C 저장 영역에서 센다이 바이러스 벡터 튜브 한 세트를 제거합니다. 수조 (37 ° C)에서 신속하게 SEV 벡터를 해동하고 얼음에 배치합니다. 바이러스의 양 (μL)= MOI (CIU / 셀) 바이러스 / 역가 세포의 X 번호 (CIU / ㎖) × 10-3 (μL / ㎖) </li><li> 활성화 TILS 포함 매체로 10-20 MOI에서 SEV 벡터의 혼합물을 첨가하여 개별적 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC을 수행 네 센다이 바이러스 벡터 튜브의 각각의 계산 된 양을 추가한다. </li><li> 형질 도입 효율을 확인하려면 활성화 TILS의 우물에 SEV-GFP의 계산 된 볼륨을 추가합니다. </li><li> (단계 3.5에서 3.6 단계) 접시를 놓고 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서. 24 시간 후, 형광 현미경 하에서 SEV-GFP 감염 TILS를 사용하여 감염 효율을 추정한다. </li><li> 15 ML 튜브에 (단계 3.5에서) 세포를 수집합니다. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 영장류 ES 세포 매체와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 hESC의 미디어 0.5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 접점 10cm의 접시에 현탁액을 전송인 hESC의 배지 10ml에 SNL 피더 세포 미토 마이신 C는 처리. 식민지가 성장 될 때까지 다른 모든 날 hESC의 미디어를 변경합니다. </li><li> 21 일 (18)의 주위에, 클린 벤치에서 10 μl의 팁을 사용하여 현미경으로 식민지 주위 SNL 피더 세포를 제거합니다. </li><li> 10 μl의 팁을 사용하여 콜로니를 긁어 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰 당 iPSCs 배지 100 ㎕에 200 ㎕의 팁을 사용하여 전송. 피펫 최대 2-3 시간에 아래로 50 ~ 100 μm의 평균 크기가 작은 덩어리로 식민지를 중단합니다. </li><li> 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 iPSCs 매체의 웰 당 2 ㎖ 중의 (단계 2)에서 미토 마이신 C 처리 SNL 피더 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에 작은 덩어리로 이동. 매일 iPSCs 미디어를 변경합니다. </li><li> 모든 5~6일 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 신선한 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 세포와 6 잘 조직 배양 플레이트에 iPSCs를 전송합니다. immun 각 클론의 접시 당 2 우물을 준비ostaining. </li><li> 만능 마커 (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 OCT3 / 4) (1) 면역 조직 화학 염색을하여 각 클론의 전체 재 프로그래밍을 결정합니다. 참고 : 만능 잠재력의 추가 평가를 위해 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인이 배아 체 형성과 분화 분석 또는 기형 종 형성 분석 (16)에 의해 삼 배엽으로 분화 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인은 세포 유전 학적 분석에 의해 정상 핵형을 보여 있는지 확인합니다. </li><li> 기형 종 형성, 미분화 TIL 유래 IPSC DMEM 6-8 주령 암컷 NOD / SCID 마우스의 피하 조직에 10 % FCS를 함유하는 100 ㎕ (1 × 106) 현탁액을 주입. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 기형 종 섹션. </li></ol> SSEA3, SSEA4, TRA1-60 및 TRA1-81에 대한 iPSCs 4. 면역 형광 염색법 <ol><li> 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 및 4 % PA 1 mL로 iPSCs 해결10 분 동안 raformaldehyde 솔루션입니다. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회 1 mL로 iPSCs 씻는다. 참고 :이 독성이 있기 때문에 파라 포름 알데히드를 사용하는 경우주의해야합니다. </li><li> 30 분 동안 버퍼 (표 1)과 차단 iPSCs를 전처리. 한편, PBS 및 트리톤 희석 차 항체 (래트 항 - 인간 SSEA3 마우스 항 - 인간 SSEA4 마우스 항 - 인간 TRA1-60, 마우스 항 인간 TRA1-81) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액 -100 (총 용적 1 ㎖). </li><li> 차단 버퍼 (표 1)를 제거합니다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 한편, 이차 항체 (항 - 마우스 IgG를 및 IgM의 또는 항 래트 IgM의) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액. </li><li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 1 ml의 PBS 3 회, 각과 iPSCs를 씻는다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 암실에서 실온에서 45 분 동안 배양한다. </l난&gt; <li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경으로 iPSCs을 준수하십시오. </li></ol> Oct3에 대한 iPSCs 5. 면역 형광 염색 / 4 <ol><li> 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 10 분간 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 1 mL로 iPSCs 해결. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회와 iPSCs를 씻는다. </li><li> permeabilization 완충액 (표 1)를 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 버퍼 (표 1) 차단 추가합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 한편, 버퍼를 차단의 기본 항체 (마우스 항 - 인간 Oct3 / 4) 1:50 희석. </li><li> 희석 차 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 1ml를 3 회 각을 iPSCs를 씻는다. 한편, 디(항 - 마우스 IgG / IgM의 염소) 류트 이차 항체 1 : 100 버퍼를 차단한다. </li><li> 희석 차 항체 용액을 첨가하고 45 분 동안 암실에서 실온에서 배양한다. </li><li> 희석 보조 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경에서 iPSCs을 준수하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기, 우리는 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 네 개의 전사의 SEV 매개 형질 도입에 의해 iPSCs에 흑색 종 TILS를 재 프로그래밍하기위한 프로토콜 요인 보여 주었다. 이 방법은 T 세포를 재 프로그램하는 SEV 시스템을 사용하여, 비 - 통합 방식 (7)의 이점을 제공한다. 이전의 연구는 SEV 리 프로그래밍 시스템은 섬유 모세포뿐만 아니라 말초 혈액 T 세포 7,17뿐만 아니라 재 프로그래밍 고효율 및 신뢰성있는 것으로 나타났다. 또, 최근에는 더 분화되고 그러한 PD-1과 같은 SEV 16 벡터하여 재 프로그램 할 수있는 말초 혈액 T 세포보다 같은 억제 수용체의 높은 수준의 발현이 흑색 TILS을 보여 주었다. SEV 벡터와 항 CD3 / CD28 자극과 감염의 타이밍은 재 프로그래밍 TILS 중요했다. 말초 혈액 T 세포를 대상 7 whil으로부터 수확 후 즉시...

전사 인자의 정의 된 설정의 과발현을 통해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 생성을 허용 세포 리 프로그래밍 기술은 세포 기반 치료 1,2- 분야에서 큰 가능성을 보유하고있다. 이러한 iPSCs는 전사와 후생 유전 학적 특징을 나타내는 유사 배아 줄기 세포 (는 ESC) 3-5 자기 갱신과 다 능성에 대한 용량을 가지고있다. 지난 10 년 동안 프로그래밍 기술로 만든 놀라운 진보는 우리가 심지어 T 세포 6-8으로 말기 분화 세포에서 인간 iPSCs를 생성 할 수있다. T 세포 유래 iPSCs는 (TiPSCs)는 TiPSCs 9-11에서 항원 특이 적 T 세포의 재생을 허용하는 원 T 세포와 같은 T 세포 수용체 (TCR) 쇄 유전자의 동일한 재 배열 된 구성을 유지한다. 흑색 침윤 림프구의 약 80 % (TILS)이 환자의 종양 특이 적 종양 관련 항원 A를 인식 얻은차 원래 암세포 (12)에 대한 세포 독성을 유지한다. 특히 TILS에 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1)의 발현은 돌연변이 neoantigen 특정 CD8 + 림프구 (13)을 포함한자가 종양 반응성 레퍼토리를 식별하는 것으로 밝혀졌다. 예비 lymphodepleting 요법 및 인터루킨 -2 (IL-2)의 전신 투여와 함께 전 생체 확장자가 TILS의 입양 전송 환자 (14)의 하위 집합에서 전이성 흑색 종의 실질적인 회귀가 발생할 수 있습니다. 전임상 모델에서 환자의 결과를 유도에도 불구하고, 불량한 주입 된 T 세포의 생존과 면역 억제 경로의 존재는 T 세포 대체 치료 잠재력을 손상시킬 것으로 보인다. 현재 임상 프로토콜은 다수 얻기 위해자가 T 세포의 광범위한 생체 조작을 필요로한다. 이것은 생존율이 불량한 말단 분화 된 T 세포를 감소 prol의 발생을 초래iferative 용량, PD-1 (15)의 높은 수준. 대체 T 세포 요법이 이론적 한계에 대한자가 면역 T 세포의 무제한 소스를 제공 할 수 iPSCs를 사용함으로써 극복 될 수있다. 최근 센다이 바이러스 (SEV) 네 개의 전사 인자 - 매개 전달, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC × 16 PD-1의 높은 발현 수준을 흑색 TILS의 프로그래밍을보고 하였다. 레트로 바이러스 벡터가 재 프로그래밍 유전자를 표현하기 위해 호스트 염색체에 통합을 필요로하지만, SEV 벡터가 아닌 통합하고 결국 세포질에서 제거된다. 효율성을 재 프로그래밍하는 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 비해 6-8 SEV 시스템 훨씬 높다. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 의해 생성 된 일부 IPSC 클론 nonlymphoid 계통 6-8에서 할 수 있지만 또한 SEV 특히, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서의 T 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기, 우리는 세부 사항절차는 인간 흑색 종 TILS의 단리 및 활성화와 SEV 리 프로그래밍 시스템을 사용 TIL 유래 iPSCs의 발생 구현.

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml 원뿔형 Cntrifuge 튜브</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>생명 기술</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>인간 AB 혈청</td><td>생명 기술</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>생명 기술</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(1000x, 55mM)</td><td>생명 기술</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>생명 과학 기술</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>생명 과학 기술</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 플러스</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>생명 과학 기술</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정제 된 NA / LE 마우스 Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>정제 된 NA / LE 마우스 Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland 제약 Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 조직 배양 플레이트 (6-well)</td><td>코닝</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 조직 배양 플레이트 (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai 바이러스 벡터</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL 피더 셀</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>미토 마이신 C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>물에 용해 (0.5 mg / ml)</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

생체의 입양 전송 전이성 흑색 종 환자의 상당한 부분 집합의 내구성과 완전한 응답을 중재 할 수자가 종양 침윤 림프구 (TILS)을 확장했다. 이 접근법의 주요 장애물 텔로미어 단축에 의한 전사 T 세포의 감소 된 가능성, 그리고 TILS의 제한된 수의 환자로부터 얻은. 그러나, 이들 덜 분화 된 T 세포의 다수 발생하는 문제이다 텔로미어 길이 덜 분화 된 T 세포는 T 세포 대체 요법을위한 이상적인 T 세포의 서브 세트 일 것이다. 대체 T 세포 요법이 제한 이론적하여 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에 의해 극복 될 수있는 자기 갱신 능성, 길쭉한 텔로미어를 유지 및 면역 요법자가 T 세포의 무제한 소스를 제공한다. 여기서는 TILS로 프로그래밍 인자의 형질 센다이 바이러스 벡터를 사용 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 생성완전히 재 프로그래밍, 벡터없는 클론이야. 이러한 TIL 유래 iPSCs는 T 세포 대체 요법에 대한 환자 - 덜 분화 된 종양 특이 적 T 세포를 생성 할 수있을 것이다.

그림 1은 항 CD3 / CD28와 활성화 및 TILS에 OCT3 / 4, KLF4, SOX2 및 c-MYC의 유전자 전달 뒤에 rhIL-2 흑색 종 TILS의 초기 확장을 포함하는 절차의 개요를 보여줍니다 iPSCs의 생성. 일반적으로, rhIL-2 시작과 문화에 TILS는 구체에게 문화의 개시 후 21-28일을 형성한다. 이 시점에서, TILS는 항 CD3 활성화 될 준비가되어 / CD28가. 그림 2A 문화에 TILS은 rhIL-2 21 일에, 활성화 될 준비가 쇼 항 CD3 / CD28.도 2b는 GFP 소개를 보여줍니다 (20)에 형질 전환 된 센다이 바이러스 (SEV)에 의해 MOI. 그림 2C는 18~21일 SEV 감염 후에 나타나는 SNL 피더 세포에 대한 전형적인 만능 클론을 보여줍니다. 그림 2D가 발...

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

본 실험의 전반적인 목표는 흑색종 침윤 림프구로부터 유도 만능 줄기세포(iPSCs)를 생성하는 것입니다. 이 방법은 특히 암 면역요법과 관련된 종양 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 침윤 림프구로부터 인간 iPS 세포를 생성함으로써, 면역 요법을 위해 덜 분화된 종양 특이적 T 세포를 무제한으로 제공할 수 있다는 점입니다.현재 임상에서 T 세포의 낮은 생존율이 적응형 T 세포 치료의 주요 제한점으로 작용하고 있어, 본 기술은 전이성 흑색종 치료에 응용될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 종양 미세환경 내 T 세포 수용체 레퍼토리 연구에도 유용할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 본 연구실의 박사후 연구원인 Kumiko Iwabuchi 박사가 진행하겠습니다.종양 조직을 확보한 후, 5~20g의 종양 표본을 선택하고 가위를 사용하여 종양 샘플의 취약하거나 혈액이 섞인 괴사 부위로부터 정상적이고 단단하며 견고한 조직을 분리합니다. 분리된 표본을 가능한 한 잘게 다진 다음, 제조사의 지침에 따라 해리 장치와 인간 종양 해리 키트를 사용하여 다져진 종양 조각들을 단일 세포 현탁액으로 분산시킵니다. 해리가 끝나면 세포를 70 micron 스트레이너를 통해 50 milliliter 튜브에 필터링하고, 스트레이너를 2 milliliter의 RPMI 1640으로 두 번 세척합니다.그 다음 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 10 milliliters의 신선한 T-세포 배지에 세포를 재현탁합니다. 밀도 구배법으로 세포를 분리하기 위해, 먼저 새로운 50 milliliter 튜브에 칼슘 또는 마그네슘이 없는 DPBS에 희석한 75% gradient solution 30 milliliters를 층 형성시키고, 그 위에 100% gradient solution 10 milliliters를 층 형성시킵니다. 그런 다음 층이 섞이지 않도록 주의하며 세포를 gradient solution 위에 조심스럽게 올린 후 시료를 원심분리합니다.분리가 완료되면, 밀도 구배 용액의 경계면에 농축된 종양 침윤 림프구(TILs)를 새로운 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고, 20~30밀리리터의 신선한 DPBS로 세포를 세척합니다. 펠릿을 10밀리리터의 신선한 T세포 배지에 재현탁한 후, 6구 플레이트의 5개 웰에 웰당 2밀리리터의 TILs를 분주합니다. 그 후 37도, 5% 이산화탄소 조건에서 5일 동안 Recombinant Human IL-2를 첨가하여 TIL을 배양합니다. 5일째 되는 날에 각 웰의 배지를 절반 교체하고, 이후 2~3일마다 반복해서 교체합니다.배양 세포의 합류도가 80~90%에 도달하면, 파이펫을 사용하여 각 웰의 세포를 부드럽게 재현탁하고 Recombinant Human IL-2가 첨가된 신선한 T-cell 배지 1 mL에서 배양 세포를 1:2 비율로 분할합니다. mitomycin-C 처리된 SNL feeder 플레이트를 준비하려면, 먼저 0.1% gelatin 코팅된 10 cm 디쉬에서 SNL feeder 세포를 10 mL의 SNL feeder cell 배지로 배양합니다. 세포의 합류도가 80~90%가 되면, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 2시간 15분 동안 mitomycin C로 feeder 세포를 처리합니다.배양 종료 후, 5 mL의 DPBS로 세포를 2회 세척합니다. 그런 다음 실온의 Trypsin-EDTA를 사용하여 피더 세포를 분리합니다. 1분 후 4.5 mL의 신선한 SNL 피더 배지를 첨가하여 해리 반응을 중화시키고, 단일 세포 현탁액을 15 mL 원심분리용 튜브로 옮겨 원심분리합니다.세포 수 측정을 위해 펠렛을 10 mL의 신선한 SNL feeder cell 배지에 다시 현탁합니다. 그 후, 10 cm 디쉬의 웰당 1.5 × 10⁶개의 SNL feeder cell을 분주하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최대 3일 동안 배양합니다. Sendai Virus를 이용한 iPSC를 생성하기 위해, Recombinant Human IL-2와 수용성 mouse anti-human CD28이 첨가된 2 mL의 신선한 T cell 배지와 함께 mouse anti-human CD3가 코팅된 새로운 6-웰 플레이트의 웰당 5 × 10⁵개의 TILs를 옮겨줍니다.세포 배양 인큐베이터에서 TIL을 5일 동안 활성화합니다. 그 다음, 파이펫을 사용하여 세포 수를 세기 위해 배양물을 15 milliliter 원뿔형 튜브에 모읍니다. 이어서, Recombinant Human IL-2와 가용성 마우스 anti-human CD28이 첨가된 재프로그래밍 배지 500 microliters를 사용하여, anti-human CD3가 코팅된 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 × 10⁵ 개의 TIL을 분주합니다.세포 배양 인큐베이터에서 24시간 후, 각 웰의 세포 수를 측정하고 적절한 감염 다중도(multiplicity of infection)에 맞춰 여러 부피의 바이러스를 준비합니다. 그런 다음 10에서 20 MOI 농도의 Sendai Virus 벡터 혼합물을 적절한 부피의 배지에 첨가하고, 바이러스가 포함된 배지를 TILs의 각 웰에 추가합니다. 형질도입 효율을 결정하기 위해, 계산된 부피의 Sendai Virus GFP를 활성화된 TILs 웰에 넣고 배양물을 인큐베이터에 24시간 동안 다시 보관합니다.다음 날, 형광 현미경으로 Sendai Virus GFP 감염 세포를 관찰하여 형질도입의 감염 효율을 추정합니다. 각 웰의 바이러스 감염 세포를 15 milliliter 튜브에 모아 원심분리하고, primate embryonic stem cell medium과 basic fibroblast growth factor가 첨가된 human embryonic stem cell medium 0.5 milliliters에 펠렛을 재현탁합니다. 이어서 세포에 신선한 human embryonic stem cell medium 9.5 milliliters를 추가하고, 현탁액을 mitomycin C 처리된 SNL feeder cell 플레이트로 옮깁니다.이 이미지에서는 Recombinant Human IL-2와 함께 21일 동안 배양되어 anti CD3 및 CD28로 활성화될 준비가 된 TILs가 표시되어 있습니다. TILs는 20의 감염 다중도(multiplicity of infection)로 Sendai Virus를 통해 형질전환될 수 있습니다. 여기에서는 Sendai Virus 감염 18~21일 후 SNL feeder 세포 상의 전형적인 다능성 클론이 표시되어 있습니다.이 대표적인 핵형 분석도(karyogram)에서 관찰되는 바와 같이, TIL 유래 iPSC는 정상적인 핵형을 나타냅니다. TIL 유래 iPSC의 다능성 마커 발현을 확인하기 위한 면역형광 염색 결과, 이들 세포는 전형적인 다능성 마커들이 예상 수준으로 발현됨을 보여줍니다. 또한, 흑색종 TIL에서 유래한 iPSC는 세 가지 배엽의 다양한 세포들을 포함하는 기형종을 형성할 수 있습니다.또한, 모세관 전기영동으로 분석한 결과 TIL 유래 iPSC는 T 세포 수용체 재배열을 유지하고 있었습니다. 당사에서 처음으로 개발한 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 전이성 흑색종 환자를 위한 더욱 효과적인 암 면역요법을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 절차를 수행할 때, Sendai Virus 감염 전 T 세포의 증식 및 생존력을 확인하고 GFP 발현 정도를 통해 감염 효율을 평가하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청하고 나면 흑색종 TIL에서 인간 TIL 세포를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포로부터 T lymphocytes의 생성은 T 세포 기반 immunotherapy에 대한 배아 줄기 세포를 사용하는 대체 방식을 제공합니다. 방법 중 하나를 이용하여...

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 동영상은 종양 항원 특이적 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 CD8αβ+ T 세포를 생성하는 분석을 보여줍니다. 종양 항원 특이적 iPSC는 기질 세포 단층에서 성장하며 조혈전구세포(HPC)로 분화됩니다. HPC는 분화 배지를 사용하여 CD4+, CD8+, 이중 양성 T 세포로 분화됩니다. 그런 다음 이러한 세포를 자극하여 CD8을 발현하는 단일 양성 T 세포를 생성합니다.

유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사...

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

학습하세요 흑색 종 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 종양 면역 요법과 전이성 흑색 종 치료에 무제한의 종양 특이 T 세포를 제공하여 암 면역 치료를 혁신합니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

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