계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

본 절차의 전반적인 목표는 3D 공동 배양 중에 서로 다른 세포군 사이의 관계를 조사하기 위해 재현 가능하게 이층 알긴산 하이드로겔 디스크를 제작하는 것입니다. 이 방법은 공간적으로 불균일한 3D 배양 내에서 여러 세포군 간의 상호작용 연구를 용이하게 하며, 이는 조직 공학 및 하중 지지 조직의 생리학에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기계적 자극에 구조적으로 유리한 세포가 파종된 다층 알긴산 하이드رو겔을 구축하는 간단하고 경제적이며 재현 가능한 방법을 제공한다는 점입니다.

본 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Poonam Sharma가 진행하겠습니다. alginate 디스크를 형성하려면, 먼저 3x3인치 엔드 플레이트 위에 두꺼운 여과지를 쌓고, 그 위에 세포 마이크로시브 막을 올립니다. 멸균된 스패튤라를 사용하여 막과 여과지를 평평하게 폅니다.

그런 다음, 적층물을 종이 타월 더미 위에 뒤집어 놓고 재료를 압착하여 과잉의 염화 칼슘 용액을 제거합니다. 이어서, 원통형 웰이 있는 겔 형성 몰드를 마이크로시브 막 위에 배치하고, 바인더 클립을 사용하여 몰드를 좌우측의 엔드 플레이트에 부드럽게 고정합니다. 이제, 두꺼운 여과지 한 장을 작은 엔드 플레이트 위에 쌓고, 그 위에 마이크로시브 막 한 장을 얹은 다음, 방금 시연한 것과 같이 적층물을 뒤집어 과잉의 염화 칼슘을 제거합니다.

몰드 양쪽 절반이 모두 준비되면, 멸균된 alginate 배지 1mL당 관심 세포 1x10⁶개를 다시 현탁합니다. 세포가 적절하게 분산되면 혼합물은 균일하게 탁한 상태로 보입니다. 그런 다음, 몰드 구조체의 하단 절반에 있는 직경 6mm, 높이 3mm의 개별 웰에 세포 130µL를 한 방울씩 옮깁니다.

각 웰의 가장자리에 약간 볼록한 메니스커스가 보여야 합니다. 모든 세포의 파종이 완료되면, 멸균 스패튤라를 사용하여 몰드 구조의 상단 절반을 조심스럽게 매끄럽게 펴줍니다. 그런 다음, 마이크로시브 멤브레인이 웰 위에 오도록 몰드를 뒤집은 후, 세포와 알긴산 혼합물이 포함된 웰을 완전히 덮도록 주의하며 웰 위에 몰드를 배치하십시오.

몰드가 제자리에 위치하면, 로딩된 몰드 구조물을 들어 올리고 중앙을 단단히 누른 상태에서 나머지 두 면에 바인더 클립을 설치하여 몰드의 상하반부를 고정합니다. 세포 알긴산 용액이 웰 안에 안정적으로 자리 잡아야 합니다. 다음으로, 전체 몰드 구조물을 세포 배양 후드 내의 실온에서 102 millimolar 염화칼슘 용액에 90분 동안 담급니다.

배양이 끝나면 구조물을 종이 타월 더미 위로 옮기고, 상단 엔드 플레이트를 몰드에 고정하고 있던 두 개의 바인더 클립을 제거하십시오. 구조물의 두 부분을 분리합니다. 웰 내에 형성된 하이드로젤에는 기포가 없어야 하며, 웰을 완전히 채우고 있어야 합니다.

남은 두 개의 바인더 클립을 제거하고 하이드로젤이 포함된 몰드를 남은 엔드 플레이트에서 분리합니다. 스패튤라를 사용하여 하이드로젤이 들어 있는 웰의 가장자리를 조심스럽게 따라가며 젤을 살살 떼어냅니다. 그런 다음, 하이드로젤을 염화 칼슘과 염화 마그네슘이 포함된 DPBS 수조로 직접 옮깁니다.

1분에서 5분 후, 하이드로젤을 6-웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰에는 37°C, 5% CO2 조건에서 최소 1시간 동안 젤이 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 바질 성장 배지 용액을 채웁니다. 배양 마지막 30분 동안, 젤 형성 몰드 높이의 절반 크기인 웰이 있는 몰드를 왼쪽과 오른쪽의 3x3인치 또는 3x1.5인치 알루미늄 엔드 플레이트에 바인더 클립으로 고정하여 커팅 몰드를 만듭니다. 그 다음, 젤 형성 몰드보다 웰 직경이 3mm 더 큰 몰드를 3x3인치 알루미늄 엔드 플레이트의 좌우 양측에 클립으로 고정하여 어닐링 몰드를 만듭니다.

이제 하이드로젤을 절단 몰드 웰로 옮깁니다. 각 젤은 웰에 꼭 맞게 들어가야 하며, 젤의 절반이 몰드 위로 돌출되어야 합니다. 그다음 메스를 사용하여 몰드 표면을 따라 잘라 하이드로젤을 반으로 절단합니다.

겔의 상단 절반을 뒤집어 개방형 몰드 웰에 넣습니다. 겔 조각이 웰에 딱 맞게 들어가야 하며, 이제 두 절반 모두 몰드 높이와 동일해야 하고 절단된 내부 표면이 보여야 합니다. 다음으로, 건조된 세포 마이크로시브 막(cell microsieve membrane) 조각을 웰 위에 덮어 막이 어닐링될 모든 겔 절반과 접촉하게 한 후, 막을 두꺼운 거름종이 조각으로 덮습니다.

겔이 완전히 덮이면 EDTA가 첨가된 소듐 시트레이트로 여과지를 적신 후, 겔을 상온에서 배양합니다. 1분 후, 세포 마이크로시브 막과 두꺼운 여과지를 제거하고 바인더 클립을 풉니다. 그다음 몰드를 열고, 절단면이 위를 향하도록 하여 겔 절반을 준비된 어닐링 몰드로 옮깁니다.

스패튤라를 사용하여, 절단면이 첫 번째 겔의 절단면과 맞닿도록 처리된 두 번째 반쪽 겔을 첫 번째 겔 위에 옮깁니다. 모든 겔을 배치한 후, 스패튤라로 겔을 가볍게 눌러 기포를 제거하고, 어닐링 몰드를 염화칼슘 배스에 조심스럽게 잠기게 합니다. 30분 후, 어닐링 몰드를 페이퍼 타월 위에 옮기고 바인딩 클립을 제거합니다.

그런 다음, 몰드를 엔드 플레이트에서 분리하고 겔을 DPBS 배스에 잠시 옮긴 후, 적절한 세포 배양 배지에 침전시킵니다. 완성된 이층 겔은 초기에 세포군이 완전히 분리된 상태를 보이며, 이는 녹색 또는 적색 세포 추적 염료로 표지된 293 FT 세포 이미지에서 확인할 수 있습니다. 어닐링 후 내장된 인간 중간엽 줄기세포의 생존율은 벌크 하이드로겔에서 관찰되는 세포 생존율과 유사하게 층상 하이드로겔 내에서 높게 유지됩니다.

4시간 동안의 비구속 반복 압축 시험에서 각 주기별 최대 응력을 분리한 결과, 세포가 없는 층상 하이드로겔은 벌크형 비층상 세포 제거 하이드로겔에 비해 반복 압축에 대한 응답 크기가 현저히 작게 나타났으며, 두 가지 유형의 하이드로겔 모두 배양 7일 후에도 구조가 유지되었습니다. 모든 재료 준비를 포함하여 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 오류를 방지하고 서로 다른 샘플들을 더 쉽게 추적하기 위해 신중하고 천천히 작업하는 것이 중요합니다.

이 절차 이후, 기계적 자극 및 면역 염색과 같은 다른 방법들을 수행하여 형성될 수 있는 세포 외 기질 내 서로 다른 세포 집단 간의 상호작용에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술을 통해 기계생물학 및 조직 공학 분야의 연구자들은 중간엽 줄기세포, 연골세포, 추간판 속핵 세포와 같은 서로 다른 세포 집단 간의 관계를 더 쉽게 조사할 수 있을 것입니다. 날카로운 도구, 생물학적 물질, 특히 인체 세포를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호구를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.