의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

이 폴리머 마이크로어레이 기술의 전반적인 목표는 비생물적 표면에 대한 박테리아의 부착을 조절할 수 있는 합성 폴리머를 식별하는 것입니다. 이 방법은 의료 기기에 대한 박테리아 부착을 억제하는 단순하고 비용 효율적인 바이오 소재의 발견 과정을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한 번에 하나의 소재를 테스트하는 기존의 바이오 소재 연구와 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 자산에서 수백 개의 폴리머를 동시에 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

우선, 텍스트 프로토콜에 따라 폴리머 용액을 준비하고 이를 384-웰 플레이트의 웰에 첨가합니다. 48행 32열로 배열된 총 1536개의 스팟으로 구성되어 폴리머를 4중 반복으로 프린팅하는 루틴을 생성하며, 각 섹션을 프린팅한 후 핀을 세척할 수 있도록 한 번에 32개의 폴리머 용액씩 프린팅합니다. 이제 아가로스 코팅 슬라이드를 플랫폼 위에 놓고, 슬라이드가 제자리에 고정될 수 있도록 진공 밀봉이 잘 되었는지 확인합니다.

모든 핀이 동일한 높이가 되도록 프린트헤드를 조정하려면, 헤드를 유리 슬라이드 위로 수동으로 내린 후 핀들이 동시에 올라오는지 확인하십시오. 웰 플레이트의 A1 웰이 홀더의 우측 상단에 오도록 플레이트 홀더 위에 배치하고, 웰 플레이트가 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 안내 메시지가 나타나면 슬라이드와 웰 플레이트가 제 위치에 있는지 확인하십시오.

각 섹션 사이에 핀을 세척할 수 있도록 한 번에 한 섹션씩 출력하십시오. 그런 다음 아세톤에 적신 페이퍼 타월을 사용하여 핀을 철저히 세척하십시오. 이어서 마른 티슈 페이퍼를 사용하여 핀이 완전히 건조되었는지 확인하십시오.

마이크로어레이 인쇄가 완전히 완료되면, 슬라이드 홀더에 넣어 40 °C로 설정된 진공 오븐으로 옮겨 건조함으로써 폴리머 스팟 내의 N&P를 제거합니다. 그다음 UV 램프를 사용하여 플레이트를 30분 동안 멸균합니다. 슬라이드에 박테리아를 접종하기 전에, 텍스트 프로토콜에 따라 배경 형광값을 측정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 마이크로어레이용 접종균을 배양하고 준비한 후, UV 멸균된 폴리머 마이크로어레이를 직사각형 4-웰 플레이트에 배치하고 혼합 박테리아 배양액 6 mL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 완만하게 흔들어주며 5일 동안 배양합니다. 배양이 끝난 후, PBS를 사용하여 마이크로어레이를 부드럽게 두 번 헹굽니다.

그다음 PBS에 희석한 1 µg/mL의 DAPI를 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 이어서 마이크로어레이를 새로운 4-웰 플레이트로 옮기고, 마이크로어레이가 잠기도록 PBS를 채운 뒤 부드럽게 흔들어 줍니다. 그다음 PBS를 한 번 교체하고 세척 과정을 반복합니다.

헹군 후, 공기 흐름 하에 마이크로어레이를 건조시킨 다음 실링 필름을 부착하고 마이크로어레이 슬라이드에 유리 커버 슬립을 고정합니다. 접착제가 마르면 70% ethanol을 사용하여 외표면을 멸균합니다. 20x 대물렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여, 명시야 및 strappy 채널에서 각 폴리머 스팟의 단일 이미지를 캡처합니다.

커버 슬립에 폴리머를 코팅하려면, 테트라히드로푸란 또는 다른 적절한 용매에 HIT 폴리머 용액을 준비합니다. 스핀 코터를 사용하여 적절한 크기의 원형 유리 커버 슬립에 폴리머 용액을 2000 RPM으로 10초 동안 스핀 코팅합니다. 코팅된 커버 슬립을 대류 오븐에서 40 °C로 하룻밤 동안 건조합니다.

박테리아를 접종하기 전, UV 램프를 사용하여 커버 슬립을 30분 동안 멸균합니다. UV 멸균된 커버 슬립을 표준 12 또는 24웰 플레이트에 넣고, 이 비디오의 앞부분에서 보여준 방식대로 박테리아와 함께 배양합니다. 배양 후, 0.1 molar cacodylate buffer를 사용하여 코팅된 커버 슬립을 두 번 세척한 다음, 2.5% weight per volume glutaraldehyde와 0.1 molar cacodylate buffer로 샘플을 2시간 동안 고정합니다.

커버슬립을 1% osmium tetroxide로 상온에서 1시간 동안 후고정합니다. 그 후 에탄올 계열 용액에서 각 농도당 30분씩 탈수 처리합니다. 그런 다음 스퍼터 코터(sputter coater)와 60~40% 금-백금 합금 혼합물을 사용하여 30 mA의 전류와 0.75 torr의 진공 상태에서 샘플을 코팅합니다.

SEM으로 이미지를 촬영한 후, 코팅되지 않은 커버슬립과 아가로스 또는 HIT 폴리머가 코팅된 커버슬립의 이미지를 시각적으로 비교하여 폴리머의 박테리아 결합 또는 반발 능력을 확인합니다. 카테터의 말단 웰 부분과의 호환성 및 HIT 폴리머의 용해 능력을 평가하기 위해, 카테터 조각을 용매에 담그고 12시간 동안 배양한 후 카테터의 무결성과 용매의 투명도를 시각적으로 평가합니다. SEM을 통해 카테터에 부착된 박테리아를 분석하려면, 아세톤에 10% 폴리머 용액을 준비합니다.

200 µL 마이크로피펫 팁을 절단된 카테터 조각의 중간 부분에 눌러 고정한 후, 해당 조각을 폴리머 용액에 약 30초 동안 담급니다. 코팅된 조각을 상온 조건에서 30분 동안 건조한 다음, 카테터 조각을 폴리머 용액에 다시 침지하여 2차 코팅을 수행하고 상온 조건에서 하룻밤 동안 건조합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 코팅된 카테터 조각과 코팅되지 않은 카테터 조각을 접종된 LB에서 배양한 후, 1 mL의 PBS를 사용하여 카테터를 세척합니다.

그 후 PBS에 희석된 10% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하여 박테리아를 30분 동안 고정합니다. PBS로 세척한 후, DAPI를 사용하여 카테터 조각에 부착된 박테리아를 20분 동안 염색합니다. 마지막으로 1 mL의 PBS로 세척합니다.

챔버 내 샘플의 배치를 확인하십시오. 다음 설정을 사용하여 카테터 조각의 공초점 이미지를 촬영합니다. 카테터의 100 µm 길이에 걸쳐 50장의 이미지를 z-stacking하여 공초점 이미지 촬영을 완료하십시오.

UV 처리 및 박테리아 배양 후, 1 mL의 PBS를 사용하여 조각들을 2회 세척하고, PBS에 희석된 10% formaldehyde가 담긴 48-웰 플레이트에 옮겨 30분 동안 방치합니다. 샘플 고정이 완료되면 PBS로 다시 한번 세척하고 실온에서 하룻밤 동안 건조합니다. 그 다음 전도성 탄소 디스크가 부착된 스터브에 고정시키고 스퍼터 코터를 사용하여 금 코팅을 수행합니다.

주사 전자 현미경을 이용한 이미징 전 단계입니다. 이 그림은 마이크로어레이 분석으로 확인한 여러 폴리머에 대한 박테리아의 부착 상태를 보여줍니다. 폴리머 없이 프린팅된 스폿은 음성 대조군으로 작용하는데, 이는 아가로스가 박테리아 결합에 강한 저항성을 가져 형광 강도가 매우 낮기 때문입니다.

제시된 폴리머들은 합금 결합성을 나타내지만, 대부분의 경우 폴리머의 방오 특성은 테스트한 박테리아 종에 따라 크게 다릅니다. 이는 서로 다른 종 간의 부착 메커니즘에 큰 차이가 있음을 반영합니다. 저결합성 폴리머는 아가로스(agarose)와의 비교를 통해 쉽게 식별할 수 있습니다.

고결합성 폴리머는 어레이에서 식별될 가능성이 높으며, 이후 실험의 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다. DAPI 채널에서 자가 형광을 나타내지 않는 폴리머의 경우, 스폿 이미지의 정성적 비교를 시각적으로 수행할 수 있습니다. 식별된 22종의 적절한 폴리머에 대해 박테리아 방지 특성을 확인하기 위해 더 넓은 표면의 코팅을 테스트하는 스케일업 실험을 수행하였습니다.

여기에 SEM으로 분석하여 유리 커버슬립 코팅에 사용된 성능이 가장 우수한 샘플들을 보여줍니다. 이 그림들은 공초점 현미경과 SEM으로 분석한 카테터 절편을 보여줍니다. 두 가지 현미경 분석 방법 모두 표면에서 직접 세포 수를 측정할 수 있어, 세포 부착의 감소가 쉽게 관찰되므로 명확한 데이터를 제공한다는 장점이 있습니다.

이 절차를 통해 혈청 또는 혈액 성분을 테스트하여 박테리아 결합에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 동물 모델을 사용하여 고분자 코팅의 임상적 사용 가능성을 평가할 수 있습니다. 화학 물질 및 병원성 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있음을 잊지 마십시오.

개인 및 환경적 위험을 완화하기 위해 취급 및 폐기 과정에서 필요한 관리 조치가 이루어져야 합니다.