의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

이 중합체 microarray 기술의 전반적인 목표는 비생물적 표면에 박테리아의 부착 조절할 수 있는 합성 중합체를 확인하기 위한 것입니다. 이 방법은 의료 기기에 대한 박테리아 부착을 억제하는 간단하고 비용 효율적인 생체 재료의 발견을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한 번에 하나의 재료를 테스트하는 기존 생체 재료 연구와 비교할 때 이 기술의 주요 장점은 단일 자산에서 수백 개의 폴리머를 동시에 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

시작하려면 폴리머 용액을 준비하고 텍스트 프로토콜에 따라 384웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 48개 행과 32개 열로 배열된 1536개 스폿으로 구성된 4중 폴리머를 4중으로 인쇄하고, 한 번에 32개의 폴리머 용액을 인쇄하여 각 섹션을 인쇄한 후 프린터를 중지하여 핀을 청소할 수 있도록 하는 루틴을 만듭니다. 이제 아가로스 코팅된 슬라이드를 플랫폼에 놓고 슬라이드를 제자리에 고정할 수 있는 양호한 진공 밀봉을 확인합니다.

모든 핀이 동일한 높이에 있도록 프린트 헤드를 조정하려면 헤드를 유리 슬라이드에 수동으로 내리고 핀이 동시에 위로 이동하는지 확인합니다. 홀더의 오른쪽 상단에 웰 A1이 있는 플레이트 홀더에 웰 플레이트를 놓고 웰 플레이트가 단단히 고정되었는지 확인합니다. 메시지가 표시되면 슬라이드와 웰 플레이트가 제자리에 있는지 확인합니다.

한 번에 한 섹션씩 인쇄하여 섹션 사이의 핀을 청소할 수 있습니다. 그런 다음 아세톤을 적신 종이 타월을 사용하여 핀을 철저히 청소하십시오. 그런 다음 핀이 완전히 건조되었는지 확인하기 위해 마른 티슈 페이퍼를 사용합니다.

마이크로어레이가 완전히 인쇄되면 슬라이드 홀더에 넣고 섭씨 40도로 설정된 진공 오븐에 옮겨 건조시켜 폴리머 스폿의 N&P를 제거합니다. 그런 다음 자외선을 사용하여 30분 동안 플레이트를 살균합니다. 슬라이드에 박테리아를 접종하기 전에 텍스트 프로토콜에 따라 배경 형광을 측정합니다.

마이크로어레이를 위한 접종물을 배양하고 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 UV 멸균 폴리머 마이크로어레이를 직사각형 4웰 플레이트에 넣고 6밀리리터의 혼합 박테리아 배양물을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5일 동안 부드럽게 저어 접시를 배양합니다. 배양 후 PBS를 사용하여 마이크로어레이를 두 번 부드럽게 헹굽니다.

그런 다음 PBS에 DAPI 밀리리터당 1마이크로그램을 추가하고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 마이크로어레이를 새로운 4웰 플레이트로 옮기고 마이크로어레이를 PBS로 덮은 다음 부드럽게 소용돌이칩니다. 그런 다음 PBS를 한 번 변경하고 세척을 반복합니다.

헹굼 후 공기 흐름에서 마이크로어레이를 건조시킨 다음 밀봉 필름을 바르고 마이크로어레이 슬라이드에 유리 커버 슬립을 부착합니다. 접착제가 마르면 70% 에탄올을 사용하여 외부 표면을 살균합니다. 20x 주관형이 장착된 형광 현미경을 사용하여 명시야 및 스트랩 채널의 각 폴리머 스폿에 대한 단일 이미지를 캡처합니다.

커버 슬립을 폴리머로 코팅하려면 테트라하이드로퓨란 또는 다른 적절한 용매에 HIT 폴리머 용액을 준비합니다. 스핀 코팅기를 사용하여 스핀 코트 원형 유리 커버 슬립을 2000RPM에서 10초 동안 폴리머 용액으로 슬립합니다. 코팅된 커버는 섭씨 40도의 컨벡션 오븐에서 밤새 건조시킵니다.

그리고 박테리아를 접종하기 전에 자외선을 사용하여 커버 슬립을 30분 동안 살균합니다. UV 멸균 커버 슬립을 표준 12 또는 24웰 플레이트에 놓고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 박테리아와 함께 배양합니다. 배양 후 0.1 몰 카코딜레이트 완충액을 사용하여 코팅된 커버 슬립을 두 번 세척한 다음 부피 글루타르알데히드당 2.5% 중량과 0.1 몰 카코딜레이트 완충액으로 샘플을 2시간 동안 고정합니다.

실온에서 1시간 동안 1% 사산화오스뮴으로 덮개를 고정합니다. 각 농도에서 30분 동안 에탄올 시리즈로 탈수하기 전에. 그런 다음 스퍼터 코팅기와 60-40%의 금-백금 합금 혼합물을 사용하여 30밀리암페어의 전류와 0.75torr의 진공을 사용하여 샘플을 코팅합니다.

SEM으로 이미지를 촬영한 후 코팅되지 않은 커버 슬립의 이미지와 아가로스 또는 HIT 폴리머로 코팅된 이미지를 시각적으로 비교하여 폴리머의 박테리아 결합 또는 퇴치 능력을 확인합니다. 카테터의 말단 웰링 부분과의 호환성과 HIT 폴리머를 용해시키는 능력에 대해 다양한 용매를 평가하려면 카테터 조각을 용매에 담그고 12시간 동안 배양한 후 카테터의 무결성과 용매의 투명도를 육안으로 평가합니다. SEM에 의한 카테터의 세균 부착을 분석하려면 아세톤에 10% 폴리머 용액을 준비합니다.

200마이크로리터 마이크로피펫 팁을 카테터의 절단된 부분 중간 부분에 눌러 고정하고 약 30초 동안 폴리머 용액에 조각을 붙입니다. 코팅된 조각을 주변 조건에서 30분 동안 건조시킨 다음 카테터 조각을 폴리머 용액에 다시 담그고 주변 조건에서 밤새 건조하여 두 번째 코팅을 적용합니다. 접종된 LB에서 코팅된 카테터 조각과 코팅되지 않은 카테터 조각을 배양한 후 텍스트 프로토콜에 따라 PBS 1ml를 사용하여 카테터를 세척합니다.

그런 다음 PBS에 10%파라포름알데히드를 사용하여 30분 동안 박테리아를 고정합니다. PBS로 세척한 후 DAPI를 사용하여 카테터 조각의 박테리아를 20분 동안 염색합니다. PBS 1밀리리터로 씻기 전에.

챔버에서 샘플의 배열을 관찰하십시오. 다음 설정을 사용하여 카테터 조각의 컨포칼 이미지를 촬영합니다. 100마이크로미터 길이의 카테터에 걸쳐 50개의 이미지를 z-스태킹하여 컨포칼 이미징을 완성합니다.

UV 처리 및 박테리아 배양 후 1ml의 PBS를 사용하여 조각을 두 번 세척하고 PBS에 10% 포름알데히드가 포함된 48웰 플레이트로 30분 동안 옮깁니다. 샘플을 고정한 후 PBS로 다시 세척하고 실온에서 밤새 건조합니다. 그런 다음 전도성 탄소 디스크가 있는 스터브에 장착하고 스퍼터 코팅기를 사용하여 골드 코팅합니다.

이미징하기 전에 주사 전자 현미경을 사용합니다. 이 그림은 마이크로어레이 분석에 의해 결정된 여러 폴리머에 대한 박테리아 부착을 보여줍니다. 폴리머 없이 프린트된 스팟은 아가로스가 박테리아 결합에 강하게 저항하기 때문에 음성 대조군으로 작용하여 형광이 매우 낮습니다.

표시된 폴리머는 합금 결합이지만 대부분의 경우 폴리머의 발수 특성은 테스트 된 박테리아 종에 따라 크게 다릅니다. 이것은 서로 다른 종에 걸친 애착 메커니즘 간의 큰 차이를 반영합니다. 결합이 낮은 폴리머는 아가로스와 비교하여 쉽게 식별할 수 있습니다.

결합력이 높은 폴리머는 어레이에서 식별될 가능성이 높으며 후속 실험을 위한 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다. DAPI 채널에서 자동 형광을 나타내지 않는 폴리머의 경우, 스폿 이미지의 정성적 비교를 시각적으로 수행할 수 있습니다. 확인된 22개의 적절한 폴리머의 박테리아 퇴치 특성을 확인하기 위해 더 큰 표면의 코팅을 테스트하기 위한 확장 실험을 수행했습니다.

여기에 표시된 것은 SEM으로 분석한 유리 커버 슬립을 코팅하는 데 사용되는 가장 성능이 좋은 샘플입니다. 이 그림은 컨포칼 현미경 및 SEM으로 분석된 카테터 절편을 보여줍니다. 두 가지 미시적 방법 모두 세포 부착의 감소를 쉽게 볼 수 있기 때문에 표면에서 직접 세포 수를 계산할 수 있어 명확한 데이터를 제공할

이 절차에 따라 혈청 또는 혈액 성분을 테스트하여 박테리아 결합에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 임상용 폴리머 코팅의 잠재력을 평가하기 위해 동물 모델을 사용할 수 있습니다. 화학 물질 및 병원성 유기체를 다루는 작업은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

그리고 취급 및 폐기 중에 개인 및 환경 위험을 완화하기 위해 필요한 통제가 이루어져야 합니다.