올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

이 RNA 면역침전 기술의 전반적인 목표는 특정 올리고뉴클레오티드 유도를 통해 진핵 세포에서 형성된 내인성 RNA 단백질 복합체를 선택적으로 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 유전자 발현을 조절하기 위해 레트로바이러스 전사체의 5개 프라임 UTR을 정의하는 RNA 결합 단백질의 구성과 같은 전사 후 제어 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 관심 있는 특정 RNA 단백질 복합체를 선택적으로 분리하고 특성화하는 동시에 RNP 다운스트림에 대한 보다 포괄적인 분석을 수행할 수 있는 가능성을 유지할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 바이러스 감염 및 수많은 세포 질환에 대한 근본적인 이해로 확장됩니다. 또한 유전자 발현의 전사 후 조절 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이는 실행 가능한 새로운 약물 표적을 의미할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양하고 FLAG 태그 단백질의 면역침전을 수행한 후, pro-TG 마그네틱 비드 슬러리의 IP당 60마이크로리터를 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 조심스럽게 피펫팅하여 보관 용액을 제거합니다. 그런 다음 랙에서 튜브를 제거합니다.

600마이크로리터의 1x 세척 버퍼를 추가합니다. 그리고 비드를 세척하고 평형을 이루기 위해 실온에서 3분 동안 튜브를 엔드 로테이터에 놓습니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 세탁 버퍼를 제거합니다.

그런 다음 신선한 1x 세척 버퍼 10 볼륨을 추가합니다. 평형을 이룬 pro-TG 마그네틱 비드에 면역침전 FLAG 항체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 최소 30분 동안 회전시켜 면역침전 항체를 접합합니다.

자석에 튜브를 놓고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 자석에서 튜브를 제거하고 비드에 1x 세척 버퍼를 추가하고 실온에서 3분 동안 회전합니다. 세척 단계를 두 번 반복하고 최종 버퍼를 제거합니다.

흡인에 의해 세포에서 배양 배지를 제거하고 1.5ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 축축하고 부착된 세포를 제거합니다. 세포 현탁액을 새 튜브에 피펫으로 넣은 다음 섭씨 4도에서 226배 G로 4분 동안 배양액을 원심분리합니다.

375마이크로리터의 얼음처럼 차가운 저염 완충액을 세포 펠릿에 추가하고 얼음에서 5분 동안 샘플을 배양하여 팽창을 허용합니다. 저염 용해 완충액에 세포 펠릿을 추가하고 다시 현탁시킬 때 주의를 기울여 조기에 기계적 중단이 발생하지 않도록 완전히 잠기고 팽창시키는 것이 중요합니다. 세포질 세포 용해물을 수집하려면 125마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액을 추가한 다음 사전 냉각된 Dounce 균질화기를 사용하여 10번의 스트로크를 수행합니다.

방출된 세포질 용해물의 원형질막 용해 및 오염 물질을 가능하게 할 만큼 충분한 힘으로 균질화합니다. 그러나 기계적 중단을 과도하게 확장하지 않도록 주의하고 핵 오염, RNA 단백질 복합체의 파괴 또는 방출된 균질산물의 손실 위험을 감수하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 상등액을 얼음 위에 올려진 새 1.7ml 튜브로 옮깁니다.

총 단백질 농도를 측정합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 10%를 예약하여 입력 제어로 사용합니다. 면역침전을 수행하려면 원하는 부피의 수확된 세포 용해물을 타겟 항체 접합 비드에 추가합니다.

1x 세척 버퍼를 사용하여 총 부피를 최대 600마이크로리터까지 가져오고 샘플을 실온에서 회전시킵니다. 90분 동안 배양한 후 IP 튜브를 자석 랙에 올려 비드를 수집합니다. 그런 다음 상층액을 수집하여 흐름으로 예약합니다.

다음으로, RNP 결합 항체 접합 비드에 10부피의 얼음처럼 차가운 NETN 150 세척 버퍼를 추가하고 실온에서 3분 동안 샘플을 회전시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 1x binding buffer에 고정된 RNP 복합체를 다시 현탁시킨 후 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 1x binding buffer의 잔량을 조정합니다. 그리고 튜브를 섭씨 70도에서 3분 동안 가열합니다.

동족 RNA 단백질 복합체를 분리하려면 관심 RNA의 3개 프라임 염기서열 경계에 상보적인 약 30개의 뉴클레오티드 DNA 올리고를 추가합니다. 그리고 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들며 배양합니다. 튜브에 5-10개의 유닛 또는 RNase H를 추가하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양하여 RNA DNA 하이브리드에서 RNA를 절단합니다.

그런 다음 포획된 관심 RNP 복합체를 포함하는 상등액을 멸균 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 면역침전된 RNA를 수집하려면 750마이크로리터의 산성 구아니디늄 티오시아네이트 시약에 포획된 RNA 복합체의 총 샘플의 절반을 다시 현탁시킵니다. 튜브에 클로로포름 200마이크로리터를 넣고 10초 동안 세게 흔든 다음 실온에서 3분 동안 배양합니다.

원심분리 후 새 튜브에 수성상을 수집하고 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가합니다. 잘 섞어 샘플을 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다. 샘플에 1마이크로리터의 글리콜 블루를 첨가하고 효율적인 침전 또는 향후 처리를 위해 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

16, 000 시간 G에서 10 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리하십시오. P200 마이크로피펫을 사용하여 RNA 펠릿을 방해하지 않도록 상등액을 조심스럽게 수집하고 폐기합니다. 각 튜브에 500마이크로리터의 75% 에탄올을 추가합니다.

튜브를 5분 동안 소용돌이치고 원심분리합니다. 방금 설명한 것처럼 상층액을 조심스럽게 모아 버립니다. 펠릿을 2-3분 동안 자연 건조하고 100마이크로리터의 RNase 자유수를 사용하여 다시 현탁시킵니다.

100마이크로리터의 RNA 샘플을 RNA 클린업 컬럼에 적용합니다. 그리고 제조업체 프로토콜에 따라 처리하십시오. 마지막으로 RNA를 30마이크로리터의 RNase 자유수에 용리하고 최대 3개월 동안 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

증식 세포에서 형성된 전사 후 조절 요소 또는 PCE, GAG, RNA, RHA 리보핵단백질 복합체를 분리하기 위해. FLAG-MS2 RNP 면역침전은 형질주입된 HECK293세포 용해물에서 수행되었습니다. 결과는 FLAG-MS2 단백질의 효율적인 침전을 보여줍니다.

DHX9/RHA는 RNP 복합체에서 발견되며 IgG 동위원소 대조군이나 음성 대조군 내에 있지 않습니다. 여기에 표시된 것은 RNase H 분해된 RNA DNA 복합체의 웨스턴 블롯입니다. RNase H는 PCE GAG RNA(절단된 PCE GAG RNA)를 절단하여 5개의 프라임 UTR에 특이적으로 결합된 RNP 복합체를 방출합니다.

DHX9/RHA 관련 RNP는 용리액에서 농축되었습니다. 중요한 것은 FLAG-MS2 결합 RNP가 항체 접합 비드와 함께 남아 있었다는 것입니다. 이 실험에서는 세포 및 용리액에 레트로바이러스 PCE GAG RNA를 포함하는 MS2 줄기 루프의 HO 면역침전을 RT-PCR 및 QRT-PCR에 의해 검증했습니다.

그 결과 DHX9/RHA와 레트로바이러스 five prime UTR 사이의 선택적 연관성이 확인되었으며, 이는 표적 번역 제어에 중요한 고유한 RNP로 강조되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 온전한 RNP 복합체를 유지하고 관심 있는 특정 RNP 복합체를 분리하기 위해 모든 단계를 효율적이고 신중하게 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 질량 분석 및 RNA-Seq와 같은 다른 방법을 수행하여 표적 RNA와의 전체 단백질 연관성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 및 특정 RNP 내에 포함된 모든 전사체의 영역 또는 완전한 분석. 개발 후 이 기술은 전사 후 유전자 제어 분야의 연구자들이 병원성 바이러스 유전자 만료를 관장하는 고유한 RNA 단백질 복합체와 세포 유전자 발현 제어의 일반적인 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 온전한 세포 RNP 복합체를 수확하고 선택적 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 사용하여 그 조성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 바이러스 및 생물학적 샘플과 산이나 페놀과 같은 유해 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점도 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비와 같은 모든 예방 조치를 취해야 합니다.