Name: 고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 고전적 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포를 흐름 정렬로 분리하여 고품질 전체 엑솜 시퀀싱 데이터를 생성하는 방법을. 이 기법은 전증폭 없이 차세대 시퀀싱 라이브러리를 제작할 수 있어 진단 및 치료 전략에 중요한 영향을 미칩니다.

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이 프로젝트 방법의 개발은 Weill Cornell Medical College의 병리학 및 실험 의학과에서 지원되었습니다. 우리는 전산 생물학 및 의학에서의 삼중 제도 연수 프로그램을 부분 기금으로 인정합니다. 우리는 시간과 지식을 우리와 공유 한 과학자, 특히 Maryke Appel에게 감사드립니다. Dan Burgess; 일간카 코자 레와; 차드로 클리어; Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson 및 Tuo Zhang을 포함하여 Weill Cornell Medical College Genomics 핵심 시설의 모든 사람들이 있습니다.

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이 기술을 습득 한 이후의 응용 프로그램 또는 지시 사항 이 작품은 적어도 10 NG의 DNA를 포함하는 샘플에서 exome 시퀀싱을 허용합니다. 임상 적 맥락에서이 한계는 불충분 한 물질로 인해 대부분의 미세 바늘 흡인 표본을 제외하지만 적절한 핵심 생검 및 절제 생검 표본을 포함합니다. 이렇게하면 더 많은 샘플 세트에서 데이터를 수집 할 수 있습니다. 프로토콜 내 중요 단계 적절한 동결 및 해리 기술은 실험의 성공에 매우 중요합니다. 가능한 한 섬유질 절편을 포함하여 전체 샘플을 분리해야합니다. 세포 종류에 130μm 노즐을 이용하는 것은 대형 HRS 세포와 DNA의 수율을 극대화하는 데 중요합니다. 여러 노즐 크기로 엄격하게 통제 된 실험을 수행하지는 않았지만,세포 수율은 100 μm에 비해 큰 노즐을 사용하...

<html> 차세대 시퀀싱의 결과로서의 암 유전체학의 진보는 치료 표적의 확인 및 많은 혈액학 및 비 혈액 종양의 예후에 중요한 돌파구를 가져왔다. 특정 게놈 변형에 기초한 새로운 개별 치료 전략이 많은 종양 유형에 급속히 도입되고있다 (참고 문헌 1 , 2 에서 검토 됨). 림프종 유전체학에서 상당한 발전에도 불구하고, 고전적 Hodgkin lymphoma (CHL)에서 종양 HRS 세포의 게놈은 과소 평가되었다. 이 연구는 반응성 미세 환경 내에서 신생 HRS 세포의 부족으로 인해 어려움을 겪었으므로 정제 된 HRS 세포 집단을 분리하기가 어렵습니다 3 . 원발성 종양에서 생존 가능한 HRS 세포를 분리하는 방법은 Fromm et al. 도 4에 도시 된 바와 같이,이 방법은 CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 및 CD64로 구성된 8 가지 항체 칵테일을 사용하여 CHL 종양 현탁액에서 HRS 세포를 확실하게 식별합니다. 는 적어도 10 7 개의 세포 (약 10 mg 조직)로 구성된 종양 생검에서 얻은 신선 또는 고정 세포 현탁액에서 최소 1,000 개의 생존 가능한 HRS 세포를 분리 할 수 ​​있습니다. 순도는 유세포 분석을 통해 90 % 이상이며 10 개의 연속적인 사례의 exome 게놈 분석에 의해 최소 80 %. 당사는 초기의 CHL 종양에서 수천 개의 생존 가능한 HRS 세포를 신속하게 분리 할 수 ​​있도록 프로세스를 대폭 개선 한 유세포 분석기 분리 기술을 개선했습니다. 우리는 호 지킨 림프종의 일차적 인 경우에서 종양 세포의 첫 번째 전체 exome 서열로 여겨지는 것을 생산하는 기술을 이용했습니다. 우리의 연구는 일개별적인 CHL 사례에 대한 높은 처리량, 게놈 차원의 연구의 타당성 및 CHL 발병 기전의 측면을 설명 할 수있는 잠재력을 지닌 새로운 게놈 변형의 확인을 이끌어 냈다. 우리는 고 처리량 게놈 연구를 위해 추출 된 DNA를 활용하는 파이프 라인을 개발했습니다. 순차적으로 발견 된 최소 1,000 개의 HRS 세포로부터 안정적인 결과를 얻기 위해 Adaptor Ligation 효율을 높이고 DNA 단편 라이브러리를 생성 할 수있는 변형 된 차세대 DNA 라이브러리 제작 절차 8 을 개발했습니다 과도한 증폭없이. 이 방법은 일상적인 임상 시료의 분석과 재발 성 돌연변이 및 염색체 변형의 검출을 가능하게합니다 7 .

<table><tbody><tr><td>페트리 또는 세포 배양 접시 (멸균)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RPMI-1640 미디어</td><td>Roswell Park Memorial Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS), (열 비활성화)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>동결 매체 (RPMI, 20 % FCS, 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)) - 2 % FCS로 신선하게 만들고 멸균</td><td></td><td></td><td></td>RPMI 유지</tr><tr><td>(신선하게 만들거나 최대 1 개월 동안 보관)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>새 칼날</td><td></td><td></td><td></td>이 있는 메스</tr><tr><td>10mL 주사기(바늘 없음)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브, 50mL</td> 원추형 원심분리기 튜브를 처리할 수 있고 400g Hepes 완충액(1M, 세포 배양 등급)을 제공할 수 있는 강제 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pluoronic-F68</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>DNAase-I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D4527-10KU</td><td>는 -200 &# 176에서 RPMI에 5 mg / mL로 저장; C</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>매체 분류 (PBS + 2 % BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic &ndash; F68 (1x))</td>CD64-FITC <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(22)</td><td>Beckman Coulter, 마이애미, FL</td><td></td><td>20 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역정은</td></tr><tr><td>CD30-PE (BerH83)</td> <td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역가를 제안하는</td></tr><tr><td>CD5-ECD (BL1a)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역정은</td></tr><tr><td>CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)</td><td>Ebiosciences, San Diego, CA</td><td></td><td>5 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역정은</td></tr><tr><td>CD20-PC7 (B9E9)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역정은</td></tr><tr><td>CD15-APC (HI98)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역정은</td></tr><tr><td>CD45 APC-H7 (2D1)</td> <td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>10 &mu로 대체 할 수 있습니다. L CD45-크롬 오렌지(J.33, Beckman Coulter)의 권장 부피; 역가를 제안하는</td></tr><tr><td>CD95-Pacific Blue (DX2)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td></td><td>5 &mu; L은 시작 볼륨을 제안했습니다. 역정은</td></tr><tr><td>CD2(5 &mu; g; 클론 RPA-2.10)</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td></td><td>선택적 프로토콜의 경우; 역가를 제안하는</td></tr><tr><td>CD54 (10 &mu; g; 클론 84H10)</td> <td>Serotec, Oxford, United Kingdom</td><td></td><td>선택적 프로토콜용; 역가를 제안하는</td></tr><tr><td>CD58 (10 &mu; g; 클론 TS2/9)</td><td>eBioscience, San Diego, CA</td><td></td><td>선택적 프로토콜의 경우; 역정은</td></tr><tr><td>LFA-1(12 &mu; g; 클론 MHM23)</td> <td>Novus Biologicals, Littleton, CO</td><td></td><td>선택적 프로토콜용; 역정은</td></tr><tr><td>BD CS& T Beads</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accudrop Beads</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BC Versa Comp 항체 캡처 비드</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>보상 비드</td></tr><tr><td>BD-FACS ARIA 5 레이저를 사용하는 ARIA 특별 연구 주문 기기</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>항체 패널에서 형광 색소를 검출할 수 있는 기능이 있는 모든 BD-FACS aria는 충분해야 합니다</td></tr>. <tr><td>Wizard</td><td>Promega</td><td>A2360</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl buffer</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 Sonicator</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td>대안은 microTUBE</td></tr><tr><td></td><td>로 대체될 수 있습니다.Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저처리량 라이브러리 준비 키트</td><td>Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td><td>KK8221</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Exome v.3.0</td><td>Roche Nimblegen</td><td>6465684001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 스타일 범용 어댑터</td><td>통합 DNA 기술(IDT), 아이오와</td><td></td>주 코럴빌 <td>HPLC 정제; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T</td></tr><tr><td>TruSeq 스타일 인덱스 어댑터</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>HPLC 정제; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG</td></tr><tr><td>TruSeq 스타일 PCR 프라이머 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGAGA</td></tr><tr><td>TruSeq 스타일 PCR 프라이머 2</td><td>통합 DNA 기술 (IDT), 코럴빌, 아이오와</td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAG</td></tr><tr><td>뉴클레아제 무료 이중 버퍼</td><td>통합 DNA 기술 (IDT), 코럴빌, 아이오와</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDIVA 소프트웨어</td><td>BD Biosciences, 산호세, 캘리포니아</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 팔콘 튜브</td><td>BD Biosciences, 산호세, 캘리포니아</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 플로우 튜브</td><td>BD Biosciences, 산호세, 캘리포니아</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

고전적인 hodgkin 림프종의 reed-sternberg 세포의 흐름 정렬 및 exome 시퀀싱

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

고전적인 Hodgkin 림프종의 Hodgkin Reed-Sternberg 세포는 염증성 림프구의 배경 내에 희박하게 분포하며 전형적으로 종양 질량의 1 % 미만을 구성합니다. 벌크 종양에서 유래 한 물질은 특성화하기에 충분하지 않은 농도의 종양 함량을 포함합니다. 따라서 8 개의 항체를 이용한 형광 활성 세포 선별 및 측방 및 전방 산란은 후속 연구를 위해 종양에서 수천 개의 HRS 세포를 신속하게 분리 및 농축하는 방법으로 여기에 설명됩니다. 동시에 exome 시퀀싱을위한 표준 프로토콜은 일반적으로 흐름 정렬을 사용하는 경우에도 종종 100-1000 ng의 입력 DNA를 필요로하기 때문에 우리는 고품질의 생산이 가능한 최적화 된 저 입력 라이브러리 구성 프로토콜을 제공합니다 최소 10 ng의 입력 DNA로부터의 데이터. 이 조합은 전체 전자의 하이브리드 화 캡처에 적합한 차세대 라이브러리를 생성 할 수 있습니다.xome baits 또는 더 집중된 대상 패널을 원하는대로 선택할 수 있습니다. 건강한 종양의 T 또는 B 세포와 비교할 때 HRS 세포의 exome sequencing은 돌연변이, 삽입 및 결실, 사본 번호 변경을 포함한 신체적 변화를 확인할 수 있습니다. 이러한 발견은 HRS 세포의 분자 생물학을 밝혀주고 표적 약물 치료를위한 방법을 제시 할 수 있습니다.

생물학적 분석기 플롯은 라이브러리 증폭 및 0.8x 비드 세정 후에 수행해야합니다. 원하는 범위에서 단편 크기의 "정상적인"분포를보아야합니다 ( 그림 2a ). 커브의 눈에 보이는 "어깨"와 같은이 모양의 편차는 고 분자량 또는 저 분자량 아티팩트의 존재를 나타냅니다. 예를 들어, 그림 2b -2d 는 이상적으로 시퀀스되지 않아야하는 가시적 아티팩트가 포함 된 라이브러리의 예를 보여줍니다. 라이브러리가 크게 손상된 경우 DNA를 사용할 수 있고 셀 정렬을 시작하면 라이브러리 구성을 반복하는 것이 좋습니다. 어댑터 이합체는 때로는 처음 0.8x 구슬 정리를 수행 할 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 <strong class="...

여기에서는 고전적인 Hodgkin lymphoma (CHL)의 Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) 세포로부터 고품질, 전체 exome 데이터를 생산하도록 고안된 결합 된 유동 세포 계측법 세포 분류 및 저 입력, 차세대 라이브러리 구성 프로토콜을 설명합니다.

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

이 절차의 전반적인 목표는 염증성 림프구성 고전 호지킨 림프종 또는 CHL 종양에서 생존 가능한 Hodgkin Reed-Sternberg 또는 HRS 세포를 분리하고 농축하여 고품질 전체 엑솜 차세대 염기서열분석 데이터를 생성하고 분석하는 것입니다. 이 방법은 주요 동인 돌연변이, 면역 회피 돌연변이의 식별, 분류 내 유전 다양성 관찰 등 CHR 생물학의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 품질과 순도가 매우 높은 종양 유래 DNA를 생성합니다.사전 증폭 단계가 필요 없는 차세대 염기서열분석 라이브러리의 생성을 용이하게 합니다. 이 기술은 하위 분류 및 예후에 도움이 될 수 있으므로 Hodgkin 림프종의 진단에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 일부 변화는 특정 약물에 대한 감수성 또는 내성을 나타낼 수 있으므로 치료 선택에 영향을 미칠 수 있습니다.Jonathan From은 유세포 분석으로 HRS 세포를 시각화하는 방법을 발견하고 이러한 세포를 가지고 첫 번째 분류 실험을 수행했을 때 이러한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 세포를 준비하기 전에 미리 적정된 항체를 어두운 유리 바이알에 혼합합니다. 그런 다음 PBS와 BSA를 추가하여 항체 칵테일을 최대 100마이크로리터 용량까지 가져옵니다.그리고 바이알을 액체 질소에서 얼음 양동이 또는 드라이 아이스로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 관심 세포를 빠르게 해동합니다. 소량의 냉동 부분만 남으면 섭씨 37도의 해동 매체 45ml가 들어 있는 50ml 원추형 튜브에 세포를 붓고 극저온 바이알을 1ml의 새 해동 배지로 두 번 헹굽니다.두 번 헹굼을 모두 모은 후 세포가 실온에서 15분 동안 소화되도록 합니다. 세포가 다시 평형을 이루면 원심분리로 수집합니다. 상층액의 마지막 200마이크로리터를 제외한 모든 것을 흡인합니다.나머지 해동 매체에 세포를 다시 현탁시키고 세포를 2-3분 더 휴지시킵니다. 그런 다음 100마이크로리터의 항체 칵테일에 세포를 담아 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 3ml의 분류 배지로 세포를 세척하고 1ml의 새로운 분류 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.그런 다음 5ml 플로우 튜브 상단 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 튜브와 여과기를 1ml의 선별 배지로 헹구고 세포를 얼음 위에 올려 놓습니다. 세포 분류를 시작하기 전에 실험 메뉴 아래의 유세포 분석기 소프트웨어에서 새 실험을 선택하고 기기 상태 창을 엽니다.parameters 탭에서 사용하지 않는 매개변수를 삭제합니다. 그런 다음 실험 탭을 다시 열고 보정 설정을 선택하여 보정 컨트롤을 만듭니다. 브라우저 창에서 더하기 기호를 클릭하여 compensation control specimen을 확장하고 데이터를 기록하지 않고 compensation control tubes를 실행합니다.각 플로라 크롬에 대한 양성 염색 비드 개체군이 10, 000 및 100, 000 채널 사이에 있도록 필요에 따라 검출기 전압을 조정합니다. 그리고 기본 감지 채널에서 가장 밝습니다. 각 튜브의 각 매개변수에 필요한 전압을 기록합니다.그런 다음 compensation control specimen 아래에서 마우스 왼쪽 버튼을 한 번 클릭하여 staind되지 않은 control tube를 강조 표시하고 stained되지 않은 control tube를 sample stage에 로드합니다. Acquisition Control 창에서 Load를 클릭하고 모든 파라미터에 대한 개별 보상 제어를 검출기 전압 필드로 실행하여 결정된 전압을 수동으로 입력합니다. 레코드를 클릭하여 염색되지 않은 제어 데이터를 얻습니다.그런 다음 나머지 모든 보정 컨트롤을 실행하여 감지기 설정을 변경하지 않고 데이터를 기록합니다. 모든 대조군이 분석되면 계속 진행하기 전에 멸균 탈이온수 튜브를 5분 동안 실행하여 기기에서 잔류 물질을 제거합니다. HRS 분류를 위한 세포를 게이트하기 위하여는, 실험적인 관을 적재하고 적어도 100, 000의 사건을 기록하고 있는 동안 3, 000에서 4의 초당 000의 사건을 취득하기 위하여 유속을 조정하십시오.1,000개의 셀에 1개 정도로 적을 수 있는 모집단을 시각화하기에 충분한 이벤트를 기록해야 합니다. 체세포 B 세포 및 T 세포 대조군을 식별하려면 각각 CD20 및 CD5 양성 세포를 게이트합니다. 모든 게이트가 설정되면 세포를 7-8 밀리리터의 수집 매체가 들어있는 사전 냉각 된 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 분류합니다.종류가 끝나면 분리된 세포 집단을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그리고 원심분리에 의해 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 1ml의 새 PBS로 세포를 씻고 작은 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 각 튜브에서 상층액을 제거합니다.라이브러리 증폭 및 포인트 8X 비드 클린업 후 원하는 범위에서 단편 크기의 정상적인 광 분포를 관찰해야 합니다. 이 모양에서 편차를 보이는 라이브러리는 고분자량 또는 저분자량 아티팩트의 존재를 나타내며 이상적으로는 염기서열을 분석해서는 안 됩니다. 예를 들어, 어댑터 이량체는 때때로 첫 번째 뾰족한 X 비드 클린업을 통해 이월되어 125 - 130 염기쌍을 중심으로 하는 날카로운 피크로 나타날 수 있습니다.이 경우 뾰족한 X 비드 클린업을 추가로 수행한 다음 이량체를 성공적으로 제거할 수 있도록 크기 분포를 반복적으로 시각화해야 합니다. 레인당 4개 샘플의 다중화 염기서열분석 후, 타겟 전체에 걸쳐 50-100X의 커버리지 깊이의 중앙값을 달성할 수 있습니다. 1나노그램 라이브러리에서 생성된 복제 수 플롯은 가짜 복제 수 증가 및 손실을 초래할 수 있습니다.고전적 호지킨 림프종 사례의 약 70%는 B2M 및 820개의 돌연변이 및/또는 클론성으로 보이는 결실을 가지고 있으며, 이는 상대적인 종양 함량을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. T 세포가 체세포 대조군으로 사용되는 경우, HRS 염기서열분석은 T 세포 수용체 알파, 델타 및 베타 위치에 해당하는 위치에서 상당한 복제 수 증가를 보여줄 것입니다. 뿐만 아니라 B 세포 수용체, 중쇄 및 카파 경쇄 위치에서 상당한 손실이 있을 뿐만 아니라 엑솜 사례당 100-400개의 체세포 돌연변이가 전체 돌연변이 부담을 줍니다.일단 숙달되면, 세포 분류 및 염기서열분석 라이브러리 구축을 포함한 이 기술은 적절하게 수행된다면 3-4일 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 우리는 호지킨 림프종에 대한 더 많은 지식을 얻고 보다 구체적인 맞춤형 치료법으로 나아가기 위해 후성유전학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 더 큰 전향적 연구 및 기타 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 방법을 통해 비교적 많은 수의 고순도 HRS 세포를 연구할 수 있었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 HRS 세포를 분리하고 게놈 분석을 시작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

flow-sorting-exome-sequencing-reed-sternberg-cells-classical-hodgkin

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 겔 타입 10 가교 덱스트란 G-10 컬럼을 사용하여 골수 기질 세포에서 급성 림프구 백혈병 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 부착된 골수 기질 세포 아래로 이동한 종양 세포 집단을 복구하여 "위상 희미한" 종양 세포 집단을 생성하는 데 도움이 됩니다.

G-10 컬럼 기반 백혈병 세포 분류: 골수 기질 세포에서 급성 림프구 백혈병 세포를 정제하는 방법

이 비디오에서는 인간 말초 혈액 B 세포에서 naive B cell, memory B cell 및 plasmablast plasma cell subpopulation의 유세포 분석 기반 분류를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 서로 다른 B 세포 하위 집단은 B 세포 표면에서 발현된 CD19, CD27 및 CD38 수용체에 대한 형광단 기반 항체 결합에 따라 구별된 후 세포 분류를 기반으로 구별할 수 있습니다.

다양한 순환 B 세포 집단에 대한 유세포 분석 기반 세포 분류

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

학습하세요 고전적 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포를 흐름 정렬로 분리하여 고품질 전체 엑솜 시퀀싱 데이터를 생성하는 방법을. 이 기법은 전증폭 없이 차세대 시퀀싱 라이브러리를 제작할 수 있어 진단 및 치료 전략에 중요한 영향을 미칩니다.

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

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