고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

이 절차의 전반적인 목표는 염증성 림프구성 고전 호지킨 림프종 또는 CHL 종양에서 생존 가능한 Hodgkin Reed-Sternberg 또는 HRS 세포를 분리하고 농축하여 고품질 전체 엑솜 차세대 염기서열분석 데이터를 생성하고 분석하는 것입니다. 이 방법은 주요 동인 돌연변이, 면역 회피 돌연변이의 식별, 분류 내 유전 다양성 관찰 등 CHR 생물학의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 품질과 순도가 매우 높은 종양 유래 DNA를 생성합니다.

사전 증폭 단계가 필요 없는 차세대 염기서열분석 라이브러리의 생성을 용이하게 합니다. 이 기술은 하위 분류 및 예후에 도움이 될 수 있으므로 Hodgkin 림프종의 진단에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 일부 변화는 특정 약물에 대한 감수성 또는 내성을 나타낼 수 있으므로 치료 선택에 영향을 미칠 수 있습니다.

Jonathan From은 유세포 분석으로 HRS 세포를 시각화하는 방법을 발견하고 이러한 세포를 가지고 첫 번째 분류 실험을 수행했을 때 이러한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 세포를 준비하기 전에 미리 적정된 항체를 어두운 유리 바이알에 혼합합니다. 그런 다음 PBS와 BSA를 추가하여 항체 칵테일을 최대 100마이크로리터 용량까지 가져옵니다.

그리고 바이알을 액체 질소에서 얼음 양동이 또는 드라이 아이스로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 관심 세포를 빠르게 해동합니다. 소량의 냉동 부분만 남으면 섭씨 37도의 해동 매체 45ml가 들어 있는 50ml 원추형 튜브에 세포를 붓고 극저온 바이알을 1ml의 새 해동 배지로 두 번 헹굽니다.

두 번 헹굼을 모두 모은 후 세포가 실온에서 15분 동안 소화되도록 합니다. 세포가 다시 평형을 이루면 원심분리로 수집합니다. 상층액의 마지막 200마이크로리터를 제외한 모든 것을 흡인합니다.

나머지 해동 매체에 세포를 다시 현탁시키고 세포를 2-3분 더 휴지시킵니다. 그런 다음 100마이크로리터의 항체 칵테일에 세포를 담아 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 3ml의 분류 배지로 세포를 세척하고 1ml의 새로운 분류 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 5ml 플로우 튜브 상단 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 튜브와 여과기를 1ml의 선별 배지로 헹구고 세포를 얼음 위에 올려 놓습니다. 세포 분류를 시작하기 전에 실험 메뉴 아래의 유세포 분석기 소프트웨어에서 새 실험을 선택하고 기기 상태 창을 엽니다.

parameters 탭에서 사용하지 않는 매개변수를 삭제합니다. 그런 다음 실험 탭을 다시 열고 보정 설정을 선택하여 보정 컨트롤을 만듭니다. 브라우저 창에서 더하기 기호를 클릭하여 compensation control specimen을 확장하고 데이터를 기록하지 않고 compensation control tubes를 실행합니다.

각 플로라 크롬에 대한 양성 염색 비드 개체군이 10, 000 및 100, 000 채널 사이에 있도록 필요에 따라 검출기 전압을 조정합니다. 그리고 기본 감지 채널에서 가장 밝습니다. 각 튜브의 각 매개변수에 필요한 전압을 기록합니다.

그런 다음 compensation control specimen 아래에서 마우스 왼쪽 버튼을 한 번 클릭하여 staind되지 않은 control tube를 강조 표시하고 stained되지 않은 control tube를 sample stage에 로드합니다. Acquisition Control 창에서 Load를 클릭하고 모든 파라미터에 대한 개별 보상 제어를 검출기 전압 필드로 실행하여 결정된 전압을 수동으로 입력합니다. 레코드를 클릭하여 염색되지 않은 제어 데이터를 얻습니다.

그런 다음 나머지 모든 보정 컨트롤을 실행하여 감지기 설정을 변경하지 않고 데이터를 기록합니다. 모든 대조군이 분석되면 계속 진행하기 전에 멸균 탈이온수 튜브를 5분 동안 실행하여 기기에서 잔류 물질을 제거합니다. HRS 분류를 위한 세포를 게이트하기 위하여는, 실험적인 관을 적재하고 적어도 100, 000의 사건을 기록하고 있는 동안 3, 000에서 4의 초당 000의 사건을 취득하기 위하여 유속을 조정하십시오.

1,000개의 셀에 1개 정도로 적을 수 있는 모집단을 시각화하기에 충분한 이벤트를 기록해야 합니다. 체세포 B 세포 및 T 세포 대조군을 식별하려면 각각 CD20 및 CD5 양성 세포를 게이트합니다. 모든 게이트가 설정되면 세포를 7-8 밀리리터의 수집 매체가 들어있는 사전 냉각 된 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 분류합니다.

종류가 끝나면 분리된 세포 집단을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그리고 원심분리에 의해 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 1ml의 새 PBS로 세포를 씻고 작은 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 각 튜브에서 상층액을 제거합니다.

라이브러리 증폭 및 포인트 8X 비드 클린업 후 원하는 범위에서 단편 크기의 정상적인 광 분포를 관찰해야 합니다. 이 모양에서 편차를 보이는 라이브러리는 고분자량 또는 저분자량 아티팩트의 존재를 나타내며 이상적으로는 염기서열을 분석해서는 안 됩니다. 예를 들어, 어댑터 이량체는 때때로 첫 번째 뾰족한 X 비드 클린업을 통해 이월되어 125 - 130 염기쌍을 중심으로 하는 날카로운 피크로 나타날 수 있습니다.

이 경우 뾰족한 X 비드 클린업을 추가로 수행한 다음 이량체를 성공적으로 제거할 수 있도록 크기 분포를 반복적으로 시각화해야 합니다. 레인당 4개 샘플의 다중화 염기서열분석 후, 타겟 전체에 걸쳐 50-100X의 커버리지 깊이의 중앙값을 달성할 수 있습니다. 1나노그램 라이브러리에서 생성된 복제 수 플롯은 가짜 복제 수 증가 및 손실을 초래할 수 있습니다.

고전적 호지킨 림프종 사례의 약 70%는 B2M 및 820개의 돌연변이 및/또는 클론성으로 보이는 결실을 가지고 있으며, 이는 상대적인 종양 함량을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. T 세포가 체세포 대조군으로 사용되는 경우, HRS 염기서열분석은 T 세포 수용체 알파, 델타 및 베타 위치에 해당하는 위치에서 상당한 복제 수 증가를 보여줄 것입니다. 뿐만 아니라 B 세포 수용체, 중쇄 및 카파 경쇄 위치에서 상당한 손실이 있을 뿐만 아니라 엑솜 사례당 100-400개의 체세포 돌연변이가 전체 돌연변이 부담을 줍니다.

일단 숙달되면, 세포 분류 및 염기서열분석 라이브러리 구축을 포함한 이 기술은 적절하게 수행된다면 3-4일 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 우리는 호지킨 림프종에 대한 더 많은 지식을 얻고 보다 구체적인 맞춤형 치료법으로 나아가기 위해 후성유전학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 더 큰 전향적 연구 및 기타 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 방법을 통해 비교적 많은 수의 고순도 HRS 세포를 연구할 수 있었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 HRS 세포를 분리하고 게놈 분석을 시작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.