액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

이 실험의 전반적인 목표는 작은 PCR 앰플리콘을 분석하여 독성 복어의 빠르고 정확한 유전형 분석을 수행하는 것입니다. 복어 요리를 준비하는 데 사용되는 복어의 식용 부분은 종에 따라 다르며 일부 종은 몸 전체에 독소를 함유하고 있습니다. 이 근육, 데이터베이스, 마스, 복어의 지느러미, 출생 피부는 모두를 위한 완전한 안전 식품과 조사의 관점에서 복어의 유전형 분석에 도움이 될 수 있습니다.

키트를 사용하여 DNA를 추출하려면 먼저 0.5 또는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 30-50 밀리그램의 물고기 조직을 넣습니다. 마이크로 주걱을 사용하여 지느러미와 피부가 없는 조직을 으깨십시오. 180마이크로리터의 동물 조직 용해 완충액과 40마이크로리터의 proteinase k 및 vortex를 간단히 추가합니다.

섭씨 56도의 블록 히터에서 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 13000xg에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 키트에서 구아니딘 염산염이 포함된 200마이크로리터의 차트로픽 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 200 마이크로 리터의 99.5 % 에탄올을 넣고 와류로 혼합합니다. 침전물을 포함한 혼합물을 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 13000xg에서 1분 동안 원심분리한 후 플로우 스루를 폐기합니다.

키트에서 구아니딘 염산염이 포함된 500마이크로리터의 세척 완충액을 추가하고 이전과 같이 원심분리기를 추가합니다. 플로우 스루와 수집 튜브를 폐기하십시오. 키트와 함께 제공된 새로운 2밀리리터 수집 튜브에 스핀 컬럼을 놓습니다.

500 마이크로 리터의 세척 버퍼 2를 추가하고 20, 000xg에서 3 분 동안 원심 분리기를 사용하십시오. 플로우 스루(flow-through)와 수집 튜브를 폐기한 후 스핀 컬럼을 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 200마이크로리터의 용출 완충액을 스핀 컬럼 멤브레인의 중앙에 피펫팅합니다.

1분 후 6000xg에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 알루엣을 일회용 자외선 큐벳에 피펫으로 만듭니다. 분광 광도계를 사용하여 220-300 나노 미터에서 aluette의 자외선 스펙트럼과 260 나노 미터에서 흡광도를 측정합니다.

무계면활성제 시약을 사용하는 것은 액체 크로마토그래피의 성공에 매우 중요한데, 그 이유는 시약이 실제로 분석 컬럼에 손상을 줄 수 있기 때문입니다. 오염을 피하기 위해 깨끗한 벤치에서 작업하면서 추출된 각 DNA 샘플에 대해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음에서 양성 대조군 및 음성 대조군을 25마이크로리터 PCR로 설정합니다. 간편한 작동을 위해 template DNA가 없는 모든 시약을 함유한 충분한 양의 cocktail을 만들어 분주합니다.

PCR 산물에 3개의 프라임 아데닌 돌출부가 추가되는 것을 방지하기 위해 교정 활성이 있는 DNA 중합효소를 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 표시된 사이클 프로그램을 사용하여 열 순환기에서 PCR 증폭을 수행합니다. 효소 분해를 수행하려면 2마이크로리터의 효소 분해 완충액을 PCR 용액에 추가합니다.

각 제한 효소를 1마이크로리터씩 넣고 부드럽게 섞습니다. 열 순환기에서 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양한 다음 섭씨 72도에서 5분 동안 배양합니다. 0.2 - 0.5 미크론 원심 필터 장치로 반응 용액을 여과하여 막힘을 방지하고 분석 컬럼 손상을 방지합니다.

여과액을 테이퍼 폴리프로필렌 바이알에 옮기고 분석할 때까지 섭씨 20도에서 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1리터 병에 hexafluoroisopropanol 및 triethylamine 용액을 준비합니다. 병을 액체 크로마토그래피 기기의 라인 A에 연결하고 직접 냉각 휴대용 냉장고를 사용하여 병을 냉각시켜 기화를 방지합니다.

메탄올로 채워진 다른 병을 라인 B.에 연결하십시오.보호 컬럼과 분석 컬럼을 기기에 연결합니다. 컬럼을 평형화하기 위해 초기 이동상을 흐르게 합니다. C-Trap 압력을 제어하기 위한 소프트웨어 없이 질량 분석기를 사용하는 경우 바를 수동으로 제어하여 C-Trap의 압력을 줄여야 합니다.

이렇게 하려면 손잡이를 당겨 잠금을 해제하고 손잡이를 시계 반대 방향으로 아주 천천히 돌려 고진공 압력을 1/3로 줄입니다. 표시된 압력은 지연된 방식으로 점진적으로 변경되어야 합니다. 저압에 대한 경고 메시지를 무시합니다.

손잡이를 눌러 잠급니다. 보정을 설정한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가열된 전기 분무 이온화 프로브를 위치 B에서 질량 분석기의 인터페이스에 더 가깝게 이동하고 프로브와 튜브가 있는 주사기에 연결합니다. 내장된 주사기 펌프를 사용하여 분당 10마이크로리터의 유속으로 캘리브rant를 지속적으로 주입합니다.

맞춤형 보정 테이블에서 6개의 하위 질량 이온만 확인하십시오. 신호의 강도가 안정화된 후 보정을 진행합니다. 보정 후 6개의 더 높은 질량 이온만 확인하고 보정을 진행합니다.

실패를 방지하기 위해 한 번에 모든 이온을 사용하여 교정하지 마십시오. 분당 0.4밀리리터의 유속으로 프로브를 D 위치로 이동하고 불활성 금속 튜브로 기기에 연결합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 매개변수를 설정한 후 바이알 바닥을 두드려 기포를 제거합니다.

샘플 랙에 샘플 바이알을 놓고 자동 샘플러를 사용하여 1마이크로리터의 샘플을 주입하여 분석을 시작합니다. 브라우저 소프트웨어로 원시 데이터 파일을 열고 양성 및 음성 대조군을 포함한 모든 수집이 성공적으로 완료되었는지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방법을 설정한 다음 실행 큐 탭에서 실행 버튼을 클릭하여 디콘볼루션 소프트웨어를 시작합니다.

신호가 완료된 후 행을 선택하고 상단 캡션에서 결과 열기를 클릭하여 디콘볼루션의 결과를 가져옵니다. 다음은 negative control과 puffer fish 샘플에서 얻은 일반적인 총 이온 전류 크로마토그램입니다. 각 피크는 길이에 따라 분리되는 DNA 듀플렉스를 나타냅니다.

이 예에서는 복어 샘플에서 세 개의 봉우리가 관찰됩니다. 이 피크는 두 개의 엔도뉴클레아제를 사용한 앰플리콘 분해의 결과입니다. 음성 대조군 샘플에서 피크가 관찰되지 않습니다.

각 피크는 다중 전하를 띤 이온으로 구성된 질량 스펙트럼을 나타냅니다. 질량 스펙트럼을 확대하면 수십 개의 동위원소로 분해된 피크를 눈에 띄게 만들 수 있습니다. 이 분해능은 단일 동위원소 질량을 측정하기 위한 필수 조건이며 고분해능 질량 분석기를 통해서만 실현 가능합니다.

이 예에서 세 번째 피크의 단동위원소 질량은 16296.7656 및 16468.6616 Daltons입니다. 3ppm의 질량 허용 오차를 고려할 때 측정값은 여기에 표시된 바와 같이 takifugu rubripes의 이론 값과 동일합니다. 이 기술을 숙달하면 일반적인 악기와 기구를 사용하여 하루 만에 수행할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 유전형 분석을 위해 액체 크로마토그래피, 고분해능 질량 분석법으로 소형 앰플리콘을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 염기서열 변이가 분석할 작은 앰플리콘에 반영되는 경우 다른 DNA 다형성을 분석하는 데 적용할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 염기 조성만 식별하며 동일한 머큐어 내의 염기 치환은 구별할 수 없습니다.