Name: 에서 약탈 먹이 행동을 분석 Pristionchus 및 기타 선충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 학습하세요 Pristionchus pacificus를 이용한 약탈 먹이 행동 분석 방법을. 고속 카메라와 현미경 관찰로 구강 형태와 포식 행동을 정량화하여 행동 신경생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 포식 행동 그림에 대해 Daniel Bumbarger 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 막스-플랑크 협회(Max-Planck Society)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 입 양식 표현형 <ol><li> 아가로 오스 패드에 입 양식 확인 참고 : 선충 입 모프를 시각화 아가로 오스 패드에 가벼운 마취 치료 벌레를 고정하고 다음과 같이 관찰하기 위해. <ol><li> 성장 및 P. 같은 선충 문화를 유지 pacificus에 6cm 표준 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시와 E.의 세균 잔디밭에 공급 대장균 OP50 19. </li><li> 처음 3 ml의 2 % 아가로 오스 솔루션을 만들기 위해 15 ML 튜브에 3 ㎖의 H 2 O 0.06 g 아가로 오스를 추가하여 아가로 오스 패드를 확인합니다. 이 4 ℃에서 1 년까지 저장할 수 있습니다 </li><li> 믹스와 전자 레인지에서 철저하게 아가로 오스를 용융 또는 대안&gt; 88 ° C로 설정 열 블록을 사용 </li><li> 완전히 녹인 후, 아가 로스 10 % 아 지드 화 나트륨 용액 10 μl를 첨가하고 잘 혼합한다. 주의 : 드라이 아 지드 화 나트륨은 반응성이 모든 형태의 독성. </li><li> 1 ml에 사용마이크로 피펫을 표준 유리 현미경 슬라이드의 중간에 액상 아가 지드 믹스만큼이나 300 μL 방울을 놓는다. </li><li> 한천은 냉각하기 전에 신속하게 냉각시 패드를 형성하는 아가로 오스를 평평하게하기 위해 드롭의 상단에 두 번째 현미경 슬라이드를 놓습니다. 필요한만큼 패드에 대해 반복합니다. </li><li> 서로 떨어져 그들을 밀어, 껍질 떨어져 유리 현미경 슬라이드를 사용하기 직전에. 참고 : 아가로 오스 패드가 사전에 너무 멀리 준비하는 경우가 너무 건조 할 수 있고, 선충에 손상을 줄 수 있습니다. </li><li> 패드의 중심에 - (3 μL 2) 마취 아가로 오스 패드에 웜을 전송하려면, M9 버퍼의 드롭 놓습니다. 선택 2-3 젊은 P. 패드를 통해 신중하게 커버 슬립을 배치하기 전에 M9의 드롭로 pacificus 성인. P. pacificus의 선충은 아가로 오스에 고정하고 시각화 할 준비가 될 것입니다. </li><li> 적절한 현미경 A를 마취 된 웜을 포함하는 현미경 슬라이드 이동차 63X 노멀 스키 광학에서 관찰한다. 다음과 같은 기능을 기반으로 모프 ID를 분류 : 추가 하위 복부 치아, 확대 등의 치아와 넓은 입 구멍의 존재하는 eurystomatous 입 모프 동물 나타내는 하나의 지느러미 치아와 좁은 입 개방의 존재가 stenostomatous을 표시하면서 동물 (그림 1). 주 : 동물의 건강을 유지하기 위해, 웜 더 이상 5 분 이상 한천 패드 상에 유지되어야한다. </li><li> 입 모프 식별 한 후, 부드럽게 아가로 오스 패드 떨어져 그것을 밀어 커버 슬립을 제거하여 필요에 따라 eurystomatous 또는 stenostomatous 중 하나 선충을 복구 할 수 있습니다. 조심스럽게 아가로 오스 패드에서 선택한 동물을 선택 신선한 NGM 플레이트에 (대장균 OP50가 밀착 될 수 있도록 도움이되는 선택 사용할 수 있습니다). 정상적인 운동성 행동이 동물이 더 약탈 적 분석에 대한 준비가되어있는에 재개 될 때까지 마취에서 회복을 허용합니다. </li></ol></li> &lt;리&gt; 빠른 입 표현형 주 : 대안 적으로, 더 많은 경험 입 폼 타입 높은 배율 (150X)을 통해 임의의 실체 마취제 치료를 필요로하지 않고 분석 할 수있다. <ol><li> E.의 세균 잔디와 표준 NGM 플레이트에 배치 선충 현미경보기 영역 상에 대장균 OP50. </li><li> 입 크기와 폭의 차이를 검출한다. 참고 : 구조와 같은 더 치아 때문에 입 모프 식별이 단독으로 좁은 입 대 넓은 입 기반으로 관찰 할 수없는이 배율에서. </li></ol></li></ol> 2. 물린 분석 참고 : 물고 분석의 상세한 약탈 행동 분석을 허용합니다. <ol><li> 성장과 표준 NGM 플레이트 (6cm)에 선충 문화를 유지하고 E.의 세균 잔디밭에 공급 대장균 OP50 19. </li><li> 이러한 C.로 선정 먹이 선충 유충의 대량 증가로 분석 번호판을 확인 엘레 또는 알대체적으로 적절한 생태 학적으로 중요한 먹이. 참고 : 성인 C.를 애벌레 단계를 사용하는 것이 중요하므로 간스 적합한 먹이하기에는 너무 크다. <ol><li> C. 유지 엘레 또는 E.의 세균 잔디밭에 표준 NGM 접시와 공급의 다른 잠재적 인 먹이 종 대장균 OP50은 인구 갓 젊은 L1 유충의 풍부 결과, 공복 때까지. 참고 : 기아에 대한 시간 문화를 시작하는 데 사용 선충의 수, E.의 양 등 다양한 환경 및 실험 요인에 따라 달라집니다 콜라이 OP50 첨가하고 상온. </li></ol></li><li> M9 4 개의 이상의 갓 굶주린 먹이 접시를 씻고 15 ML 튜브에 수집하기 전에 모든 큰 동물과 나머지 계란을 제거하기 위해 두 개의 20 μm의 필터를 통해 웜 솔루션을 전달합니다. 만 작은 유충은 용액에 남아 있어야한다. </li><li> 유생 펠렛 1 분 동안 377 XG에서 필터링 된 먹이를 원심 분리 형성한다. </li><li&gt; 더 E.와 6cm의 NGM 플레이트 상에 순수 웜 펠릿의 피펫 3 μL 대장균 OP50 현재와 애벌레는 분석 플레이트를 생성하기 위해 충분히 확산을 위해 적어도 30 분을 기다립니다. 참고 : 표준 분석 플레이트에 순수한 웜 펠릿의 3 μL가&gt; 3,000 먹이 유충이 포함되어 있습니다. 이 포식자와 먹이 사이의 빈번한 접촉을 생성하기에 충분하다. </li><li> 필요한 입 모프 (프로토콜 1)에 대한 화면 약탈 선충. </li><li> 분석 플레이트에서 제대로 분류 육식 동물을 전송, 표준 웜 따기 기술 및 광 실체 현미경 (19)를 사용하여. 세균 오염을 최소화하기 위해 포식자를 전송할 때 분석 플레이트에 가능한 한 적은 OP50 박테리아 전송주의한다. 웜이 전송되는 스트레스 복구 및 웜이 전송에서 손상되지 않은 보장하기 위해 야생 형 운동성 행동을 확인 할 수 있도록 15 분을 기다립니다. 참고 : P.을 굶어 할 필요가 없습니다 PACificus, 그들은 잘 박테리아에 공급하는 동안에도 다른 선충 유충의 고효율 포식자가있다. </li><li> 복구 후, 10 분 동안 빛 실체 현미경을 사용하여 육식 동물을 관찰한다. 이 장비로, 관찰 및 먹이의 움직임을 제한하는 포식자 특징으로, 물고과 같은 별개의 공급 이벤트의 특성, 위치 검출되는 먹이 표피의 개방에 의해 살해을; 및 공급, 먹이 내장 (그림 2A, B 및 영화 1)의 관찰 소비로 분류. </li><li> 검사 및 정확도를 보장하기 위해 10 개인 육 선충 최소 관찰하여 분석을 반복한다. </li></ol> 3. 시체 분석 참고 : 시체 분석이 약탈 행동의보다 신속한 정량을 용이하게한다. <ol><li> 성장과 표준 NGM 플레이트에 선충 문화를 유지하고 세균 리터에 공급E.의 까끄라기 대장균 OP50 19. 앞서 언급 한 분석 플레이트 (- 2.5 프로토콜 2.1)의 삼중를 생성합니다. </li><li> 필요한 입 모프에 대한 화면 약탈 선충은 같은 표준 웜 따기 기술과 각 분석 플레이트에 필요한 입 모프와 빛 실체 전송 5 약탈 선충을 사용하여 프로토콜 1에서 설명했다. 2 시간 동안 먹이와 함께 포식자를 남겨주세요. </li><li> 2 시간 화면 비워 사체 (도 2B와 C)의 존재에 대한 분석 플레이트 후. 웜 조각을 내장 누출 또는 누락을 포함 분명한 형태 학적 결함과 함께 운동의 부재에 의해 시체를 확인합니다. </li></ol> 인두와 치아 운동 4. 분석 <ol><li> 성장과 표준 NGM 플레이트에 선충 문화를 유지하고 E.의 세균 잔디밭에 공급 대장균 OP50 19. 이전에 (- 2.5 프로토콜 2.1) 언급 한 바와 같이 분석 플레이트를 생성합니다. 표준 6cm 경우NGM 판은 적절한 대안으로 2 ml의 NGM을 포함하는 작은 35mm 배양 접시의 뚜껑을 사용하여 객관적이고 현미경 단계 사이에 적합하지 않다. </li><li> 필요한 입 모프에 대한 화면 약탈 선충 기술을 따기 표준 웜 및 광 실체 현미경을 사용하여 프로토콜 1에서 설명한 바와 같이, 분석 플레이트에 하나 제대로 분류 육식 동물을 전송합니다. 웜이 전송되는 스트레스로부터 복구 할 수 있도록 15 분을 기다립니다. </li><li> 고속 카메라 (영화 2 및 3)와, 63X Normaski - 40 현미경에 육식 동물을 관찰한다. 적어도 20 동물의 50 Hz에서 녹음 인두 펌핑 15 초 이상 치아 운동은, 정확한 정량을 보장합니다. 재생 개별 펌프와 치아 이벤트를 계산하기 위해 원하는 속도로 동영상을 기록했다. 참고 : 치아 이동이 입 구멍에 검출 할 만 산부인과 동안 펌핑는 인두의 중간에있는 코퍼스에서 관찰된다지느러미 치아에서 제공. </li></ol>

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저자는 재정적 또는 경쟁적 이해관계를 선언하지 않습니다.

선충은 C.에 신경 생물학 및 행동을 이해하기위한 강력한 시스템을 제공 엘레은 지금까지 기본 도구 인. P.를 포함하지만, 많은 선충 종 결석 또는 모델 생물의 C.에서 복잡 다양 pacificus 표시 행위, 엘레 따라서는 이러한 행동의 진화 및 규제에 관한 흥미로운 질문을 제기. P. 포함하여 많은 다른 선충 종에서 발견 한 같은 추가 행동 pacificus이 약탈 공급 (1), (20)에 결합하여 세균의 식단을 보완 할 수있는 능력이다. 따라서 우리는 개발 및 선충에서 이러한 이전에 unanalyzed 약탈 행위의 쉽고 빠른 특성에 대한 상세한 프로토콜을 설명했다. 첫째, 우리는 선충 구강 내 장치를 공급 변동을 선별하는 방법을 제공하고 있습니다. 정확한 입 타입의 식별은 필수적인 제 s의만 eurystomatous 동물이 육식 공급 할 수있는 최소한 Pristionchus 속에서, 같은 성공적인 포식 분석을 위해 TEP. 그것은 훨씬 덜 침습적 인 입이 방법으로 프로토콜 1.2에 기술 된 &quot;빠른 입 표현형&quot;프로토콜로 변경해 파악하는 것이 가장 좋습니다 따라서는 약탈 행위가 교란 될 수 있다는 가능성이 적습니다. 그러나, 첫 번째 한천 패드에 마취 된 동물 (프로토콜 1.1)을 식별하여 다른 입 구조에 익숙해지는 것이 좋습니다. 원하는 입 모프의 식별에 따라, 우리는 약탈 먹이를 정량화이 분석을 설명했다. 이들은 (프로토콜 2)은 &quot;물린 분석&quot;을 통해하지만 더 깊이있는 행동 분석을 소모 빠른, 높은 처리량 &quot;시체 분석&quot;(프로토콜 3)과 더 많은 시간이다. 이러한 프로토콜 모두 experimen에 따라 분석을 최적화하기 위하여 여러 가지 변형을 허용 매우 유연탈 요구 사항. P.를 사용하여 물린 분석을위한 C.에 pacificus의 포식자 엘레 먹이 10 분의 시간 창에 대한 상호 육 행동 관찰은 다른 공급 이벤트와 함께 물기 상당한 양을 정량화하기에 충분했다. 다시 P.를 이용하여 &quot;시체 분석&quot;에 대한 C.에 pacificus의 포식자 엘레 먹이은 2 시간 5 육식 동물은 빠른 행동 분석을 가능하게 쉽게 정량화하고 일관된 시체 번호를 생산했다. 그러나, 다른 속도로 이동 육 선충의 종을 주목해야한다 다른 속도 먹고 일반적으로 다른 행동 한 큰 다양성을 증명한다. 또한, 다른 먹이 종은 비슷한 이유로 다른 속도로 먹을 수있다. 이는 그러므로 환경 조건에 차이에도 포식자 먹이로 모두 테스트 선충 종에 기초하여 분석을 최적화 할 것을 권장하고있다. 모두 &quot;입&quot;과 &quot;군단 중스트레스 또는 부상 포식자 효율적으로 죽이지 않을 것 같은 먹이와 포식자 모두가 건강한 것이 중요합니다 전자 &quot;분석은. 또한, 신선한 분석 플레이트에 악영향 오류로 이어지는 선충의 건강에 영향을 알아 건조 될 수 있습니다 이전 판과 같은 필수 분석법. 또한 많은 C. 관찰 행동 간스 (21, 22)를 조사하는 완성되었다 이러한 육 분석법 미래 반복이 많은 분석을 자동화 할 수 있도록 기술의 최근 발전을 활용할 수있을 것으로 기대된다. 현재 그들은 약탈 먹이를 폐지 할 가능성이 미세 유체 실에 격리와 고정을 훨씬 더 민감 문의하기 나타나는 문제는 P.의 pacificus와 같은 선충에서 발생할 가능성이 있습니다.이 도전 증명할 수 있지만 개별 선충을 용이하게 할 극복은 미묘한 약탈에 대한 검사한다 행동. 마지막으로, 우리는 또한 FO 방법을 제공 한R 고속 카메라 (4 프로토콜)를 사용하여 치아와 인두 펌핑 동역학을 정량함으로써 육 세균 공급 모드 사이의 비교를 용이하게 선충 공급 장치 자체 검사. C.에서 인두 펌핑 속도의 정량화 엘레은 C. 그러나 여러 해 23 먹이를 모니터링하기 위해 이용되고있다 엘레는 입 작은이 어떤 형태의 부족도 약탈 행동이 부족하다. 치아 활동의 펌핑 인두의 정량을 조합 통해 포식 특정 치아의 모든 신경 분포는 또한 관찰 될 수있다. 때문에 동물은 종종 초점면에서 이동 치아 이동을 관찰하는 데 필요한 배율에 따라서는 짧은 시간 창을위한 치아를 관찰하는 것이에만 가능합니다. 또한, C. 달리 엘레, P.의 인두 pacificus는 지속적으로 오히려 펌프와 공급의 주문에 종사, 펌프하지 않습니다. 따라서, 정확한 인두 PUM에 대한공급하면서 핑 속도는 연속 공급의 15 초를 기록하는 것이 중요하다 결정되어야한다. 여기에 제시된 이러한 방법은 따라서 선충 시스템에서 약탈 행위를 조사하기위한 첫 번째 프레임 워크를 제공한다. 또한, 그들은 또한 미생물, 곰팡이 및 진드기를 포함하여 포식에 추가 생태 학적으로 중요한 생물의 영향을 포함하여 선충 생태계 내의 다른 상호 작용을 조사에 사용하기 위해 적용 할 수있다 . 따라서 그들은 또한 자신의 생태 학적 의미를이 약탈 행위가 규제 그들이 어떻게 진화 수있는 방법과 해부 할 수있는 수단을 제공한다.

그들의 작지만 복잡한 신경계와 선충 행동을 포함한 신경 생물학의 여러 측면을 이해하기위한 강력한 도구를 입증했다. 이 연구의 대부분은 모델 생물 다른 동작의 재산이 성공적으로 해부하고 분석되고있는 예쁜 꼬마 선충에 초점을 맞추고있다. 이들은 thermotactic 5, 6 및 magnetotactic 7에 영향을 미치는, 8, 9 짝짓기 (10) 학습 및 공급 (11)을 행동 4 화성, 3 mechanosensory을 포함한다. 그러나, 다른 더 멀리 관련 선충 종은 rhabditid C.에서 관찰되지 않는 행동을 표시 엘레 또는 대안은 진화 및 규제에 관한 관련 질문을 제기 복잡성의 추가 레벨을 보여줍니다. 이 중 하나 이러한 경우는 훨씬 더 복잡 공급 될 표시 먼 관련 diplogastrid 선충 Pristionchus pacificus에서 관찰 할 수있다haviors와 C에서 관찰 된 것보다 리듬 두 종 상동 인두 신경 (12)을 공유에도 불구하고 간스 1.입니다. 이러한 추가 공급 행동, P.과 일치 그들은 또한 다른 선충의 유충에 공급하여 세균 식단을 보완 할 수있는 탐욕스러운 육식 동물이다로 pacificus 또한, 확장 된식이 범위를 표시합니다. 다행히도, P. pacificus는 비교 및 통합 진화 생물학의 모델로 개발되었다 때문에 많은 분자 유전 도구를 사용할 수 있습니다. 이들은 완전히 시퀀스 및 주석 게놈 (13), 형질 전환 유전자 14 CRISPR / Cas9 (15, 16)뿐만 아니라 새로 발견 된 자매 종을 포함하여 25 밀접하게 관련 종 상세하고 잘 주석 계통 (17)를 포함하는 분자 유전 학적 도구가 포함되어 있습니다. 또한, 다수의 Pristionchus 종의 생태는 P. 등 pacificus 우리입니다많은 종으로 정의 게요 지금 풍뎅이 딱정벌레와 necromenic 협회, 그들은 자주 다른 선충 종 (18)와 공유 호스트를 공유 설명 된. P. pacificus 따라서 새로운 행동의 진화 및 생태 학적 중요성을 해부하기에 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 이러한 P. 같은 선충 종의 약탈 먹이 행동을 분석하기 위해 pacificus 우리는 쉽게 관찰과 약탈 행위의 정량화에 대한 몇 가지 새로운 행동 분석을 개발했다. P.로 pacificus 강하게 올바른 morphotype의 식별이 필수적 1, 2 인, 약탈 행동에 영향을 미치는 동종 이형 입 구조를 표시합니다. 좁은 입 stenostomatous 모프는 하나의 무딘 등의 치아를 담고 있으며, 어떤 약탈 공급에 관여하지 않습니다. 또한, 넓은 입 eurystomatous 모프는 훨씬 더 큰 갈고리 모양의 지느러미 치아와 반대 추가를 포함함께 효율적으로 먹이의 표피를 열고 운영 서브 복부 치아. 비 약탈 stenostomatous 형태로 약탈 eurystomatous의 비율은 P. 내에 Pristionchus 종에 따라 다르며 pacificus 그러나 eurystomatous 입의 비율은 P.에 모프 90 % 2 - pacificus 야생형 균주 (PS312)는 일반적으로 70이다. 또한, 입 형태의 비율이 (모두 알려진 기아뿐만 아니라 알 수없는 요인으로 신호 몇 가지 작은 분자 포함) 환경의 영향을 다른 약탈 eurystomatous 입 양식, 따라서 정확한 식별 및 격리에 따라 변동될 수 있습니다 성공적인 약탈 분석을 위해 필수적이다. 약탈 입 양식에 대한 설명과 함께 우리가 직접 관찰하고, 물고 죽이고 이벤트를 먹이 포함 약탈 행위의 정량화를위한​​ &quot;물린 분석&quot;을 개발했습니다. 여기에 먹이 선충은 필터를 통해 분리된다새로 굶주린 문화의 보내고과 약탈 성인 P.에 노출 짧은 시간 범위 동안 함께 관찰된다 pacificus. 또한, 우리는 육 이벤트 간접적으로 관찰 육 동작의 신속한 선별을 용이하게하기 위해 고 스루풋 &quot;시체 세이&quot;를 개발 하였다. 이 포식을 선별하는 도구로 애벌레 시체의 존재 활용합니다. 두 분석은 관찰 및 P. 같은 선충 종에서 약탈 행위를 측정하기위한 간단하고 매우 반복적 인 방법을 제공 pacificus.

<table><tbody><tr><td>나일론 네트 필터(20 &#181; m)</td> <td>Merck Millipore Ltd</td><td>NY2004700</td><td>먹이로 사용하기 위해 유충을 남겨두고 벌레를 걸러내는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>필터용 PP 깔때기(54mm)</td><td>Duran</td><td>292215003</td><td>먹이로 사용하기 위해 유충을 남겨두는 벌레를 걸러내는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>작은 페트리 접시 (35/10 mm)</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>627102</td><td>고속 카메라 Zeiss</td></tr><tr><td>SteREO Discovery V12</td><td></td><td></td><td>입 형태 식별</td></tr><tr><td>Axio-Imager A1</td><td></td><td></td><td>입 형태 식별</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Roth</td><td>H869</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Roth</td><td>657</td><td></td></tr><tr><td>모션 스코프 M3 고속 카메라</td><td>IDT</td><td></td><td>고속 카메라</td></tr><tr><td>비디오 줌 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X</td><td>Zeis</td><td>452984-0000-000</td><td>고속 카메라 줌</td></tr><tr><td>선충 성장 매체(NGM) 성분:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.2</td><td>CAS-Nr. 9002-18-0</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD</td><td>211699</td><td>Lot 4316614</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물 (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>라놀린의 콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 26732 00050</td><td>CAS-Nr. 57-88-5</td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>CAS-Nr. 10034-99-8</td></tr><tr><td>인산이수소칼륨(KH2PO4)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>6cm 페트리 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>3.5cm 페트리 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>M9 성분 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>인산 이수소 칼륨 (KH2PO4)</td> <td>ACROS 유기물</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>인산수소나트륨 헵타하이드레이트(NaHPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390-500G-D</td><td>CAS-Nr. 7782-85-6</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr></tbody></table>

에서 약탈 먹이 행동을 분석<em&gt; pristionchus</em&gt; 및 기타 선충

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

이 프로토콜은 선충의 포식성 섭식 행동을 분석하고 정량화하기 위한 여러 방법을 제공합니다. Pristionchus pacificus를 포함한 많은 선충 종은 복잡한 행동을 보이며, 그 중 가장 두드러진 것은 다른 선충 유충의 포식입니다. 그러나 모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에는 이러한 행동이 없기 때문에 신뢰할 수 있는 행동 분석법의 개발과 함께 최근에야 자세히 설명되었습니다 1. 이러한 포식적 행동은 표현형적으로 가소성이지만 고정된 입 형태에 의존하므로 이러한 동물의 올바른 식별과 분류가 필수적입니다. P. pacificus에는 stenostomatous와 eurystomus morphs 2의 두 가지 입 유형이 있으며, 입이 넓은 eurystomatous만이 여분의 이빨을 포함하고 다른 선충 유충을 죽일 수 있습니다. 크기와 일치하는 풍부한 먹이 유충을 분리하고 포식성 선충에 대한 후속 노출을 통해 올바르게 식별된 구강 모프 선충에 대한 "시체 분석" 및 "물린 분석"을 모두 포함하는 분석이 가능합니다. 이러한 분석은 포식 성공률을 신속하게 정량화하고 포식적 섭식 활동에 종사하는 개별 선충에 대한 자세한 행동 분석을 제공하는 수단을 제공합니다. 또한 고속 카메라를 사용하여 치아 및 펌핑 역학을 포함한 인두 활동의 변화를 시각화할 수도 있습니다.

<html> P.에서 적절한 입 모프를 성공적으로 식별 다음 pacificus, eurystomatous과 stenostomatous 동물 사이에 명확한 차이는 동작을 죽이고에 참여 만 eurystomatous 동물 (그림 3)를 검출 할 수있다. stenostomatous 동물에서이 문제를 완전히 억제 할 것으로 보인다. 또한, 박테리아와 먹이에 eurystomatous 동물의 치아 활동과 인두 펌프의 차이 (그림 4 및 동영상 2, 3) 또한 분명하다. 육 공급하면서, 펌핑 속도는 박테리아 공급 및 치아 이동은 인두 펌핑 한 비율로 한 검출시 관찰 이하로 감소된다. 이 다이어트를 다른에 대한 행동 반응을 조절 키 규제 메커니즘의 가능성을 나타낸다. S / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. P. pacificus 문제를 먹이에 영향을주는 입 이형 태성이 있습니다. (A)에 eurystomatous 입 형태 포식 할 수 있고, 큰 발톱 모양의 등쪽 티스 (FALSE 컬러 레드) 및 (B)가 큰 대향 훅 형상 부 복부 티스 (거짓 색 청색)와 넓은 입구 개구를 갖는다. (다) stenostomatous 입 양식이 박테리아에 먹이에만 수 있으며, 부싯돌 모양의 지느러미 치아 (거짓 색 빨간색)와 (D)없이 서브 복부 치아 (*)와 좁은 입 구멍이 있습니다. Normaski 이미지는 63X하고 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig2.jpg" /> <str옹&gt; 그림 2. 포식 분석 실험. (A) P. pacificus는 물린 및 C. 다른 선충의 유충을 죽인다 팅 분석 용 간스. (B) bitesby 포식 (*)의 수는 광 입체 성공적인 살해하여도 기록 된 이벤트를 공급 관찰 될 수있다. 시체가 명확하게 또한 볼 (원)입니다. (C) 시체 분석의 경우, 애벌레 시체 (화살표)을 쉽게 유충 생활에 비해 식별 할 수 있습니다. 스케일 바는 1 B에서 mm와 C에서 150 μm의 표현 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig3.jpg" /> C.에 이빨과 시체 분석 실험 3. 결과 그림 엘레 먹이. (A) 물기 동작은 분명<html> 이 문제와 eurystomatous 입 형태로 stenostomatous 동물에 표시되지 않습니다. 오류 바 10 복제의 표준 편차를 나타냅니다. (B) stenostomatous 동물의 알 수없는 무는 행동과 일치, 시체 분석도 만 eurystomatous 동물의 분석 접시에 시체를 알 수있다. 오류 바 5 복제의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig4.jpg" /> eurystomatous 동물 약탈 공급에 종사하는 동안 그림 4. 약탈 수유하는 동안 속도와 치아 운동 펌핑 Eurystomatous. 치아의 움직임 만 관찰된다. 이것은 또한 인두 펌프의 감소와 일치한다. 오류 바는 10 복제의 표준 편차를 나타냅니다.<html> = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_1_Killing_behaviour.mp4">영화 가벼운 실체 현미경을 사용하여 물린 분석을위한 행동을 죽이는 1. 관측. (오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">P.의 영화 2. 고속 카메라 동영상 pacificus는 C. 사망 elegans의 애벌레. (오른쪽 다운로드 클릭).</a> 광고 / 54404 / 54404movie3.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_3_HS_pumping_and_tooth.mp4">영화 3. 포식하는 동안 치아 이동의 고속 카메라에 확대. (오른쪽 다운로드 클릭).</a>

행동 분석은 뉴런 기능을 이해하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기에서는 모델 선충 Pristionchus pacificus와 그 친척에서 발견되는 포식적 섭식 행동을 정량화하기 위한 몇 가지 프로토콜을 제시합니다. 또한 입 구조와 치아를 포함한 포식적 섭식 적응을 분석하는 방법을 제공합니다.

에서 약탈 먹이 행동을 분석<em&gt; Pristionchus</em&gt; 및 기타 선충

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

이 절차들의 전반적인 목표는 몇 가지 새로운 분석법을 사용하여 포식성 선충의 복잡한 섭식 행동을 신뢰성 있게 분석하는 것입니다. 이러한 방법들은 새로운 복잡한 행동의 조절 및 진화와 같은 행동 신경생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 위성 모델 생물인 Pristionchus pacificus를 포함하여 선충의 포식성 섭식 행동을 관찰하고 정량화할 수 있는 신속하고 쉽게 반복 가능한 방법을 제공한다는 점입니다.선충의 입 형태를 시각화하기 위해, 먼저 새로 만든 2% agarose 패드 위에서 가벼운 마취 처리를 통해 벌레를 고정합니다. 패드를 만들려면, 녹인 agarose 3 mL에 10% sodium azide 용액 10 µL를 조심스럽게 첨가하고 충분히 섞어줍니다. Sodium azide는 반응성이 높고 독성이 있으므로 적절한 예방 조치를 취하십시오.그 다음, 혼합물을 표준 유리 현미경 슬라이드 중앙에 최소 300 µL 떨어뜨리고 다른 슬라이드를 사용하여 아가로스를 평평하게 폅니다. 패드를 사용하기 직전까지 상단 슬라이드를 그대로 둡니다. 사용을 위해 패드를 준비하려면 상단 슬라이드를 제거하고 M9 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 벌레 2~3마리를 골라 방울 속에 넣고 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다.63배 Nomarski 광학계를 통해 벌레를 관찰하여 형태학적 정체성을 분류합니다. 확대된 등측 치아, 추가적인 복측 치아 또는 확대된 넓은 입 개구부는 모두 eurystomatous 동물의 특징입니다. 반면, 단일 등측 치아와 더 좁은 입 개구부는 stenostomatous 동물을 나타냅니다.5분 이내에 마취 패드에서 선충을 제거하십시오. 커버슬립을 조심스럽게 밀어 제거하고 선충을 새로운 MGM 플레이트로 옮깁니다. 추가 분석을 진행하기 전, 선충이 운동성을 보일 때까지 기다리십시오.숙련도가 높아지면 마취 처리 없이 형태를 분석할 수 있습니다. 고배율 실체 현미경을 사용하여 입 형태를 빠르게 표현형 분석하기 위해, 표준 배양 플레이트에서 OP50 박테리아 잔디가 도포된 새 플레이트로 10~20마리의 선충을 옮깁니다. 그 다음 입의 크기와 너비의 차이를 검출합니다.이 배율에서는 치아와 같은 구조를 관찰할 수 없으므로, 입의 너비를 기준으로 입 형태(mouth morphs)를 식별하십시오. 이를 통해 넓은 입과 좁은 입을 구분합니다. C.elegans 유충 단계의 유충이나 생태학적으로 적절한 먹이 생물을 포함하여, 선택된 먹이 선충 유충을 대량으로 배양하여 분석 플레이트를 제작하십시오.L1 유충을 수집하기 위해 먹이 생종의 플레이트를 4개 이상 굶깁니다. 이후 M9으로 플레이트를 세척하고 수집물을 20 micron 필터 두 개로 여과합니다. 용액에는 작은 유충만 남아 있어야 합니다.유충을 377 g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. M9 상층액을 폐비커로 제거하고, 순수한 벌레 펠릿 3 µL를 취합니다. E.coli가 없는 6 cm MGM 플레이트 중앙에 벌레를 배치하고 약 30분 동안 퍼지게 둡니다.나중에, 이 유충들을 물기 분석(bite assay)에 사용하십시오. OP50 박테리아를 최대한 적게 포함하여 포식자들을 분석 플레이트로 옮깁니다. P.pacificus의 경우, 플레이트에 포식자 5마리를 추가합니다.이동된 동물들이 스트레스로부터 회복될 수 있도록 15분 동안 기다립니다. 15분 후, 벌레들이 정상적으로 움직여야 하며, 그렇지 않은 경우 손상되었을 가능성이 있습니다. 이제 10분 동안 포식자 중 한 마리가 일으키는 뚜렷한 사건들을 관찰하고 기록합니다.물어뜯기는 포식자가 먹이의 움직임을 제한하는 것이 특징입니다. 먹이의 큐티클이 열릴 때 살상이 일어납니다. 섭식은 먹이의 내부 기관을 소비하는 것이 관찰되는 것이 특징입니다.정확성을 확보하기 위해 최소 10마리의 개별 포식성 선충을 관찰하십시오. 인두 펌핑과 치아의 움직임은 40~63배 확대의 Nomarski 광학 장치 하에서 관찰할 수 있으며, 50Hz의 고속 카메라로 기록할 수 있습니다. 최소 20마리의 동물에 대해 15초 분량의 클립을 기록한 후, 해당 비디오를 신뢰성 있게 분석할 수 있습니다.인두 중앙에 위치한 체부에서 펌핑 현상이 관찰됩니다. 치아의 움직임은 입이 열릴 때 감지되며, 배측 치아에서만 관찰됩니다. 포식 후 2시간이 지나면 플레이트에서 빈 사체를 선별하십시오.운동성이 없고 내장이 유출되었거나 벌레 조각이 소실된 것과 같은 명백한 형태학적 결함이 있는 개체를 사체로 식별하십시오. P.pacificus에서 적절한 입 형태를 성공적으로 식별한 후, 광구형(eurystomatous) 동물과 협구형(stenostomatous) 동물 사이에 뚜렷한 차이가 관찰되었습니다. 광구형 동물만이 살상 행동을 보였습니다.또한, 박테리아를 섭취할 때와 먹이를 섭취할 때의 eurystamatous 동물의 치아 활동 및 인두 펌핑의 차이 또한 분명하게 나타납니다. 포식성 섭식 과정에서는 펌핑 속도가 박테리아 섭식 시 관찰되는 속도보다 낮아지며, 치아의 움직임이 인두 펌핑과 일치하게 됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 위성 모델 생물인 Pristionchus pacificus를 포함하여 선충의 복잡한 포식성 섭식 행동을 특성화하기 위해 이러한 서로 다른 분석법들을 결합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 비디오는 선충 C. elegans의 화학주성을 소개하고 황산구리에 대한 화학주성 혐오를 테스트하는 샘플 프로토콜을 보여줍니다.

C. 예쁜꼬마선충 Chemotaxis Assay: 웜에서 Chemosensation을 테스트하는 방법

이 비디오는 형질전환 웜 모델에서 화학 회피 거동을 조사하기 위한 삼투압 회피 분석에 대해 설명합니다. 회피 행동은 고삼투압 장벽과 화학유인물질이 있는 플레이트에서 테스트됩니다. 뉴런의 기능적 상실을 가진 기생충은 화학유인물질에 끌려, 고삼투압 장벽을 넘어, 마취액 때문에 트랩 영역에서 마비된다.

삼투압 회피 분석을 사용한 형질전환 벌레의 화학회피 거동 조사

곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. B. xylophilus의 행동 특징은 짝짓기 과정에 설명되어 있습니다.

파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화, 소나무 재선충

여기에서 우리는 구리 혐오 행동의 변화와 일반적인 음식 공급원을 찾아내는 능력을 평가하기 위해 고안된 Caenorhabditis elegans 특이 적 검정법을 제시합니다. 유기체가 잘 먹는 것에서 굶주린 영양 상태로 진행되기 때문입니다.

에이<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 영양 상태 기반 구리 혐오 검정

우리는 인구 기반 분석에서 가용성 화합물에 대한 선충류 인 Caenorhabditis elegans 의 선호도를 자동 분석 할 수있는 행동 기록 설정 및 프로토콜을 제시합니다. 이 기사에서는 비헤이비어 챔버의 구성, 동작 분석 프로토콜 및 비디오 분석 소프트웨어 사용에 대해 설명합니다.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

이 프로토콜은 필드의 천연 기판에서 살아있는 선충을 효율적으로 추출하는 방법을 간략하게 설명합니다.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

이 프로토콜은 자아 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 자연에서 수집 된 선충류와 관련된 생태 및 분자 데이터의 효율적인 조직 및 분석입니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

여기에서는 개 사료 한천 배지를 사용하여 선충을 대량으로 배양하여 선충의 집단 행동을 연구하는 시스템이보고되었습니다. 이 시스템을 통해 연구자들은 많은 수의 다우어 웜을 번식시킬 수 있으며 Caenorhabditis elegans 및 기타 관련 종에 적용할 수 있습니다.

선충의 집단 행동을 연구하기 위한 대규모 재배

이 연구는 작은 반추 동물의 위장관 선충류에 미치는 영향을 평가하기 위해 라디칼 기반 방법과 시험관 내 알 부화 분석(EHA)을 사용하여 Tithonia diversifolia 추출물의 생물학적 활성을 평가했습니다. 방법론과 주요 결과를 설명하고 기생충 방제를 위한 이러한 추출물의 잠재력을 강조합니다.

체외 분석을 이용한 위장관 선충 알에 대한 Tithonia diversifolia 추출물의 항산화 및 구충제 특성 평가

학습하세요 Pristionchus pacificus를 이용한 약탈 먹이 행동 분석 방법을. 고속 카메라와 현미경 관찰로 구강 형태와 포식 행동을 정량화하여 행동 신경생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

에서 약탈 먹이 행동을 분석

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