Name: Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 저발현 성장인자 수용체를 검출하는 AFLIP 기법을 Danio rerio 배아에서. 친화력 레이블링과 면역침전을 결합하여 수용체 역학과 발현 수준을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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저자는 물고기 관리 및 유지 관리에 대해 Gilberto Morales에게 감사하고, 토끼 예방 접종에 도움을 준 Claudia Rivera 박사와 Hector Malagòn 박사(IFC-UNAM Animal Facility)에게 감사를 표합니다. 이 작업은 CONACYT 131226와 PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916의 보조금으로 지원되었습니다.

동물에서 수행 모든 실험은 CICUAL 프로토콜 번호로, 실험 동물 관리 및 멕시코의 자치 대학교 (UNAM)의 사용을위한위원회의 승인을했다 : FLC40-14. (CICUAL &quot;Comité Institucional 파라 엘 Cuidado y를 USO 드 로스 짐승 같은 드하기 Laboratorio 델 연구소의 드 Fisiologìa Celular, 대학교 나시 오날 자치시 드 멕시코&quot;). 배아 단백질 추출물 1. 준비 <ol><li> 각 조건은 예를 들어 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 위해, 원하는 단계에서 (morphants 대 야생형)을 비교하기 위해 200 배아 - (100)를 수집합니다. </li><li> 물고기의 물을 함유하는 배양 접시에 장소 배아는 (표 1 참조) 수동 뾰족한 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 이 대상 수용체을 소화 수 있으므로이 단계 (또는 프로토콜을 통해 다른 단백질 분해 효소) 동안 프로 나제​​를 사용하지 마십시오. </li><li> 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 넣어 배아 및 배아 TW 씻어1X 인산 완충 용액 (PBS)와 얼음 (표 1 참조). </li><li> deyolk 버퍼 500 μL를 추가 (표 1 참조). </li><li> (- 40 배 30) 용액에 배아를 부드럽게 아래로 피펫 팅에 의해 노른자의 대부분을 놓습니다. 72 HPF, 48 HPF의 배아를 들어 각각 파란색과 노란색 피펫 팁을 사용합니다. 노란색 끝은 약간 배아를 파괴하지 않도록 절단해야 할 수도 있습니다. 성공적인 노른자 자료는 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 워시 배아 회 500 ㎕의 세척 완충액으로 부드럽게 최저 속도 텍싱하여 (표 1 참조). </li><li> 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다. </li><li> 여기에서 시작, 4 ° C에서 절차를 계속합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 용해 완충액 350 μL에 재현 탁 배아 (표 1 참조)과 플라스틱 유봉을 사용하여 균질화한다. </li><li> 4 ° C에서 테스트 튜브 로커에 용해 배아를 교반하면서 30 분을 품어. </li><li> 원심 분리하여 불용성 잔사를 제거하기 위해 15 분 동안 11,000 XG에서 배아를 용해. </li><li> 전송 신선한 튜브에 피펫을 이용하여 상층 액을 깨끗이 밀어 냈습니다. </li><li> 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석 (4), 또는 다른 적절한 방법에 의해 전체 단백질을 결정한다. 브래드 포드 분석법이 사용되는 경우가 4 표준 단백질의 과소 원인으로, 용해 버퍼에 세제 선물 동등한 농도의 존재 검량선을 수행한다. </li></ol> 2. 감지 내인성 수용체 단백질의 <ol><li> 선호도 라벨링 및 면역 침전 (모든 단계 4 O를 C에서) <ol><li> 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 총 배아 단백질의 500 μg의 버퍼 1 (표 1 참조) 1 μg의 / μL로 희석 - (400)를 배치합니다. 주 : 약 100 배의 총 단백질 500 μg의 획득하기 위해서 - 200 배아 초기 처리되어야한다. 72 HPF 배아는 정기적으로 betaglycan 검출을위한 충분한 총 배아 단백질의 ~ 5 μg의를 얻을. </li><li> 150 오후 최종 농도에 도달하고 4 ° C에서 테스트 튜브 로커 2 시간에 교반 배양 표시 TGF-β2 주식의 충분한 볼륨을 추가합니다. AFLIP이 시작되기 전에 Cheifetz 등. (5)에 의해 설명 된 바와 같이 TGF-β2는 클로라민 T 법에 의해 125 I로 표시해야합니다. 주의 : 내가 리간드 레이블 (125)를 처리하는 동안 노출을 최소화하기 위해 차폐. </li><li> (100) 희석 (배양이 O / N 수있다) 4 ° C에서 또 다른 2 시간 동안 배양을 계속 : 1에 도달하기 위해 관심있는 수용체에 대한 희석 항체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 따라서 본 연구에서 사용하고 다른 3을 설명하지만,의 품질에 따라, 항혈청 번호 (31)의 최적의 희석이고tibody, 큰 또는 작은 희석 최적 일 수있다. </li><li> 적절한 면역 글로불린 결합 구슬의 50 μl를 추가합니다 (예를 들어, 이전에 TNTE에서 평형 1 재현 탁 G 단백질 세 파로스, : TNTE에서 원래 볼륨의 5)를 4 °에서 테스트 튜브 로커에 교반과 함께 50 분 동안 품어 기음. </li><li> 20 초 동안 11,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 적절한 방사성 쓰레기 용기에 상층 액을 버린다. </li><li> 20 초 때마다 11,000 XG에, 텍싱 및 microcentrifugation에 의해 IP 세척 버퍼 (표 1 참조) 1 ㎖로 IP-구슬 세 번 씻으십시오. </li><li> 재현 탁 IP-구슬 IP 세척 버퍼 250 μL있다. </li><li> (10 ㎎ / ㎖에서 DMSO에 용해 DSS) 숙신 이미 딜 수베의 1.5 μl를 추가합니다. 바로이 단계에서의 사용 전에 DSS 솔루션을 준비합니다. </li><li> 교반 4 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 가교 반응을 종결하기 위해, 500 ㎕의 O를 추가충분히 트리스 - CL pH 7.4의 재고 보충 F IP 세척 버퍼는 25 mM 트리스 - (CL)에 도달한다. 트리스의 유리 아미노산 그룹은 미 반응 DSS를 캡처합니다. </li><li> 20 초 동안 11,000 XG에 원심 분리기는 IP-구슬을 수집하고 뜨는을 폐기합니다. </li><li> 재현 탁 IP 비드 램리 완충액 30 μL 감소한다. </li><li> 삶아 샘플 94 ° C에서 5 분. </li><li> 선택적으로, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 감마 계수기에서 샘플을 분석한다. </li></ol></li><li> 샘플 분석 <ol><li> SDS-PAGE를 변성에 따라 샘플. 수용체의 질량에 해당하는 비율로 폴리 아크릴 아미드를 사용하여 표준 절차에 따라 젤을 실행합니다. </li><li> 고정 제 용액에서 겔을 담그고 실온에서 30 분 동안 (표 1 참조). </li><li> 15 분 동안 증류수로 젤을 씻으십시오. </li><li> 이전에 수화 필터 종이에 젤을 놓고 사란 랩 필름 커버. </li><li> 1 시간 동안 80 ° C에서 건조 젤. </li><li> 흰색은 phosphorimager의 scre에 젤을 노출RT O / N에서 엉. </li><li> 제조 업체의 프로토콜을 사용하여은 phosphorimager를 사용하여 노출 된 화면을 검색합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
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</ol>

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관심의 단백질에 대한 특이 항체와 서양 말의 사용은 배아 발생 동안 발현 7을 연구하는 유용한 도구입니다. 그러나, 높은 당화 단백질의 면역 인해 자신의 비효율적 인 전송 및 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 8,9 약한 결합을 매우 성공적으로되지 않았습니다. 프로테오글리칸 때문에 음전하를하고 폴리스티렌 표면 또는 소수성 블로 팅 막 중 하나에 잘 결합하지 않는 자신의 공유 부착 글리코 사 미노 글리 칸 체인 (GAG)으로, 이러한 단점의 좋은 예이다. 또한, GAG 사슬의 크기 이질성 효과적으로 오의 면적당의 양을 감소 겔의 섹터에 걸쳐 단백질을 &quot;확산&quot;. 관심의 단백질 발현 수준이 낮은 경우뿐만 아니라, 정기적 인 웨스턴 블랏에 의해 그 검출은 어려운 작업이다. 수용체 (TGFBR3) 또는 betaglycan β 유형 III 형질 전환 성장 인자(BG), 제브라 피쉬 3 개의 GAG의 부착 포유...

RT-PCR 또는 ISH(in situ hybridization)로 동족 mRNA를 측정하여 얻은 발현 프로파일을 검증하려면 배아 발달 중에 발현된 단백질의 특정 검출이 필요합니다. 이는 일반적으로 배아 추출물의 웨스턴 블롯(western blot)을 주입한 후 특정 항체를 검출함으로써 달성됩니다. 그러나 이 접근법은 함량이 매우 낮거나 블로팅(blotting) 중 정량적 전달을 방해하는 특성을 가진 단백질에는 적용하기 어렵습니다. 제3형 형질전환 성장 인자 β(TGF-β) 수용체(TGFBR3)로도 알려진 베타글리칸이 이러한 어려움의 한 예입니다. TGFBR3는 핵심 단백질1을 통해 TGF-β와 결합하는 시간제 멤브레인 프로테오글리칸으로, 다른 TGF-β 결합 단백질2와 구별되는 특성인 동형 TGF-β2에 대한 친화력이 현저히 높습니다. 제브라피쉬의 TGFBR3는 8 hpf 부터 발현되며, mRNA3의 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같이 최대 72 hpf에 도달합니다. 
그러나 매우 특이적인 항체3을 사용할 수 있음에도 불구하고 웨스턴 블롯으로 번역된 산물을 검출하려는 모든 시도는 성공하지 못했습니다. TGFBR3의 프로테오글리칸 특성과 낮은 함량이 이러한 실패의 원인일 수 있다고 판단하여 TGF-β2에 대한 TGFBR3의 높은 친화도를 활용하는 검출 방법인 AFLIP가 고안되었습니다. 이 방법에서는 풀링된 배아에서 단백질 추출물이 125I-표지된 TGF-β2와 특이적으로 결합할 수 있으며, 수용체-리간드 복합체는 면역침전으로 정제되고 SDS-PAGE에 의한 분리 전에 가교됩니다. 겔의 자가방사선 촬영에 의해 관찰된 이동 패턴은 표지된 수용체 종의 존재와 특성을 보여주었습니다. 이 접근법은 친화성 표지의 리간드 특이성과 특정 항체에 의한 면역침전을 결합하여 검출 범위를 늘리고 TGFBR3의 비효율적인 전달 블로팅을 방지합니다. AFLIP 분석은 고유한 특성으로 인해 정량적 분석은 아니지만 분석된 수용체의 상대적 실험적 차이를 자신 있게 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>디숙시니미딜 수산염 (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G 세파로스 4 빠른 흐름</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>젤 건조기 모델 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II 자동 감마 카운터</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>노출 카세트</td><td>분자 역학</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. 베이커</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. 베이커</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. 베이커</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마-알드리치</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>, 트리톤 X-100</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td></td></tr>, <tr><td>CaCl2</td><td>시그마-알드리치</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>, NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr>, <tr><td>PMSF</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 씨 마린 믹스</td><td>해양 기업 국제</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Labeling과 Immunoprecipitation(AFLIP)의 힘을 결합하여 제브라피시 배아에서 낮은 농도의 수용체를 검출하는 기술이 구현되었습니다. 이 기술은 면역침전의 특이성과 함께 리간드에 의한 주어진 수용체의 친화성 표지에 의해 부여되는 선택성과 민감도를 활용합니다. 우리는 AFLIP를 사용하여 초기 제브라피시 발달 과정에서 베타글리칸으로도 알려진 III형 TGF-β 수용체(TGFBR3)를 검출했습니다. AFLIP는 TGFBR3 morphant 제브라피시 표현형의 효능을 검증하는 데 중요한 역할을 했습니다. 첫 번째 단계에서는 배아 단백질 추출물을 준비하고 사용하여 면역침전으로 정제된 125개의 I-TGF-β2-TGFBR3 복합체를 생성합니다. 나중에, 이러한 복합체는 공유 가교되고 SDS-PAGE 분리 및 자가방사선 촬영 검출을 사용하여 드러납니다. 이 기술은 검출할 수용체에 대해 표지된 리간드와 이에 대한 특정 항체의 가용성을 필요로 하며, 이러한 요구 사항을 충족하는 성장 인자 또는 사이토카인 수용체를 식별하기 위해 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

그림 1은 AFLIP 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 125 I-리간드에서 온 레인 1 신호는 공유 (150 kDa의 마커 아래 BG 코어) 제브라 피쉬 betaglycan 핵심 단백질 또는 글리코 사 미노 글리 칸의 첨부 파일 (GAG, 도말하여 프로테오글리칸 형태로 처리 된 BG 코어 중 하나에 연결된 ) 170 kDa 내지 겔의 상단까지. 마이그레이션이 패턴 날카로운 코어 단백질 플러스 (GAG 때문에 사슬의 길이 이질성)를 도말 프로테오글리칸은 TGFBR3이 특징이다. DSS에 공유 결합 매 리간드 - 수용체 복합체 형성에 연결되지 않기 때문에, 겔 (125 I-TGF-β2)의 이동 앞에 나타나는 125 I-리간드 무연있다. 이 유리 리간드가 수용체에 결합하고, 결합 된 면역 중에 남아 있지만 공유 결합 부착되지 때문에, SDS-PAGE 과정에서 분리....

제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 선택한 수용체의 방사성 리간드를 이용한 친화성 표지(affinity labeling)의 선택성과 민감도를 결합하여, 제브라피쉬 배아 내의 저발현 성장 인자 수용체를 검출하는 것입니다. 이 방법은 수용체 발현 수준 및 생화학적 특성과 같은 발생 생물학 분야의 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희가 AFLIP이라고 명명한 이 방법은 세포 생물학의 잘 확립된 기술인 친화성 표지의 강력한 기술적 특성을 제브라피쉬 발생 연구로 확장한 것입니다.본 절차를 시작하려면, 각 조건당 100~200개의 배아를 수집하여 어류 배양수가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그 후, 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 배아의 난막을 수동으로 제거하며, 프로토콜 전반에 걸쳐 표적 수용체를 분해할 수 있으므로 pronase 또는 기타 프로테아제 사용은 피하십시오. 다음으로, 배아를 1.5mL 마이크로 튜브에 넣고 1X PBS로 두 번 세척합니다.그 다음 deyolking buffer 500 µL를 추가합니다. 용액 내의 배아를 피펫으로 약 30~40회 천천히 위아래로 섞어 난황의 대부분을 제거합니다. 72 HPF 및 48 HPF 배아의 경우, 각각 파란색과 노란색 피펫 팁을 사용하십시오.배아의 손상을 방지하기 위해 노란색 끝부분을 약간 잘라내야 할 수도 있습니다. 난황의 성공적인 제거 여부는 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다. 난황의 지질과 단백질이 이후의 리간드 또는 항체 결합 단계에 방해가 될 수 있으므로, 난황은 가능한 한 완전히 제거해야 합니다.그 후, 600 x g에서 15초 동안 원심분리하여 배아를 수집합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 가장 낮은 속도로 부드럽게 볼텍싱하여 500 µL의 세척 버퍼로 배아를 두 번 세척합니다.그다음 600 x g에서 15초 동안 원심분리하여 배아를 수집합니다. 이때부터는 모든 절차를 4°C에서 진행하십시오. 파이펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.그 후, 배아를 350 µL의 lysis buffer에 현탁하고 플라스틱 페스틀을 사용하여 균질화합니다. 이어서 용해된 배아를 4 °C의 테스트 튜브 록커에서 30분 동안 교반하며 배양합니다. 다음으로, 불용성 잔해물을 제거하기 위해 용해된 배아를 11,000 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.그 후, 맑게 정제된 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. Bradford 단백질 분석법을 통해 총 단백질 양을 측정하고 검정 곡선을 작성합니다. 이 단계에서는 400에서 500 µg의 배아 총 단백질을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, buffer 1을 사용하여 1 µg/µL 농도로 희석합니다.다음으로, 최종 농도가 150 picomolar가 되도록 Iodine-125 label TGF-beta II 스톡을 첨가하고, 테스트 튜브 로커를 사용하여 4 °C에서 2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그 후, 표적 수용체에 대한 항희석 항체를 1:100 희석 비율이 되도록 첨가합니다. 이어서 4 °C에서 2시간 더 또는 하룻밤 동안 배양을 계속합니다.배양 후, 적절한 면역글로불린 결합 비드 50 µL를 첨가하고 4 °C의 튜브 로커에서 50분 동안 흔들어주며 배양합니다. 그런 다음 11,000 x g에서 20초 동안 원심분리하여 비드를 회수하고, 상층액은 적절한 방사성 폐기물 용기에 버립니다. 이어서 IP 세척 완충액 1 mL를 사용하여 IP 비드를 3회 세척하며, 매회 볼텍싱 후 11,000 x g에서 20초 동안 원심분리합니다.그 후 IP 비드를 250 µL의 IP 세척 완충액에 다시 현탁합니다. 신선한 DSS 용액을 준비하고 샘플에 1.5 µL를 첨가합니다. 이어서, 샘플을 4 °C에서 15분 동안 교반하며 배양합니다.가교 반응을 중단시키기 위해, pH 7.4에서 25 millimolar tryst chloride 농도가 되도록 tryst chloride 스톡을 보충한 IP wash buffer 500 µL를 첨가합니다. 다음으로, 11,000 ×g에서 20초 동안 원심분리하여 IP 비드를 회수합니다. 그 후, 상층액을 제거하고 IP 비드를 30 µL의 환원 laemmli buffer에 재현탁합니다.다음으로, SDS-PAGE 젤 전기영동 전 샘플을 94 °C에서 5분 동안 가열한 후, 건조된 젤을 포스포리미터(phosphorimeter) 또는 일반적인 자동방사법(autoradiography)으로 분석합니다. 이 그림은 AFLIP을 통해 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 72 hpf 및 48 hpf 배아에서 추출한 총 단백질을 Iodine-125 TGF-beta II 친화성 표지(affinity labeling) 후, rabbit anti-zebrafish BG 또는 대조군으로 rabbit anti-rat BG를 사용하여 면역침강(IP)을 수행하였습니다.자가방사법에서 BG는 GAG가 없는 상태 또는 glycosaminoglycan-modified BG 형태로 검출될 수 있습니다. 이 그림은 실험적 조작(이 경우, morpholino 주입을 통한 betaglycan 감소)을 거친 배아에서 특정 수용체의 발현 수준을 측정하는 데 AFLIP을 어떻게 활용할 수 있는지 보여줍니다. 1번 레인은 72 hpf 야생형 배아의 TGF beta receptor III 수준을 나타내며, 2번 레인은 ZFPG 일차 전사체의 exon 2-intron 2 경계를 표적으로 하는 morpholino 7 ng을 투여했을 때의 효과를 보여줍니다. 이 morpholino로 인해 유도된 BG의 하향 조절은 mismatch 대조군에서는 재현되지 않음에 유의하십시오.이러한 결과는 이 모르폴리노(morpholino)를 통해 얻은 표현형이 이전에 기술한 바와 같이 TGF beta receptor III의 넉다운(knockdown)에 특이적임을 확인해주었습니다. 성장 인자 또는 사이토카인 수용체를 검출하기 위한 AFLIP의 성공 여부는 수용체에 결합하여 가교 결합(cross-link)될 수 있는 방사성 표지 리간드의 가용성에 달려 있습니다. 또한 면역침강법에 적합한 우수한 항체 또한 필요합니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행할 경우 이틀 만에 완료할 수 있습니다. AFLIP은 웨스턴 블롯의 전이 단계를 거치지 않으므로, 당쇄화가 심하게 일어난 수용체를 더욱 효과적으로 검출할 수 있습니다. 여기서는 웨스턴 블롯에서 전이 효율이 매우 낮은 프로테오글리칸인 betaglycan을 통해 이를 확인했습니다. 이 절차 이후에는 전기영동 기법으로 검출 가능한 한, 추가적인 번역 후 수정을 분석하기 위해 효소 소화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후에는, 어피니티 라벨링 및 면역침전법이 결합된 AFLIP을 통해 여러 어류 배아에서 저발현 수용체를 어떻게 검출할 수 있는지 충분히 이해하시게 될 것입니다. 마지막으로, Iodine-125를 사용할 때는 각별한 주의와 적절한 보호 조치가 필요함을 잊지 마십시오. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

이 프로토콜은 uncaged 플루오레신에서 신호를 증폭하기 위해 immunolabeling 전체 산 뒤에 갇힌 플루오레신의 UV - uncaging를 사용하여 셀 zebrafish의 배아의 작은 그룹의 운명을 라벨 및 추적하는 방법을 delineates.

레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

이 비디오는 제브라피시 방사상 신경교세포에서 Notch/DeltaD 신호를 이미지화하기 위한 항체 흡수 분석을 보여줍니다. 여기에는 아가로스가 박힌 탈이온화된 제브라피시 배아를 장착하고, 망막 신경절 세포에 DeltaD 리간드를 표적으로 하는 염료 용액을 주입하고, 비대칭 세포 분열을 위해 형광 현미경으로 이미징하여 Notch/DeltaD 신호 활성화를 확인하는 작업이 포함됩니다.

제브라피시 방사상 신경교세포(Radial Glia progenitor)에서 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

이 작업은 배아 제브라피쉬 뇌의 방사형 신경교 전구체를 분할할 때 계통 내 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발합니다.

Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

배우세요 저발현 성장인자 수용체를 검출하는 AFLIP 기법을 Danio rerio 배아에서. 친화력 레이블링과 면역침전을 결합하여 수용체 역학과 발현 수준을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

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