Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

이 절차의 전반적인 목표는 방사성 리간드에 의해 선택된 수용체의 친화성 표지의 선택성과 민감도를 결합하여 제브라피시 배아에서 저농도 성장 인자 수용체를 검출하는 것입니다. 이 방법은 수용체 발현 수준 및 생화학적 특성과 같은 발달 생물학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리가 AFLIP라는 별명을 붙인 이 방법은 잘 정립된 세포 생물학 기술인 친화성 라벨링의 강력한 설명 특성을 제브라피시 발달 연구로 확장합니다.

이 절차를 시작하려면 각 조건에 대해 100-200개의 배아를 수집하고 물고기 물이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 끝이 가는 겸자를 사용하여 배아를 수동으로 탈환하고 표적 수용체를 소화할 수 있으므로 프로토콜 전체에서 프로나제 또는 기타 프로테아제를 사용하지 마십시오. 다음으로, 배아를 1.5ml 마이크로퓨지 튜브에 넣고 1X PBS로 두 번 세척합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 탈노킹 완충액을 추가합니다. 용액에 있는 배아를 약 30-40회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 대부분의 노른자를 방출합니다. 72 HPF 및 48 HPF 배아의 경우 각각 파란색 및 노란색 피펫 팁을 사용합니다.

배아가 파괴되는 것을 방지하기 위해 노란색 끝을 약간 잘라야 할 수도 있습니다. 성공적인 난황 방출은 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다. 난황 제거는 난황 지질 및 단백질이 후속 리간드 또는 항체 결합 단계를 방해할 수 있으므로 가능한 한 완전해야 합니다.

그 후, 600 x g에서 15초 동안 원심분리하여 배아를 수집합니다. 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 폐기합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 세척 버퍼로 배아를 가장 낮은 속도로 부드럽게 와류로 세척하여 배아를 두 번 세척합니다.

그런 다음 15초 동안 600 x g에서 원심분리하여 배아를 수집합니다. 여기서부터 섭씨 4도에서 절차를 계속합니다. 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 폐기하십시오.

그 후, 350마이크로리터의 용해 완충액에 배아를 현탁시키고 플라스틱 절굿공이를 사용하여 균질화합니다. 그런 다음 용해된 배아를 섭씨 4도의 시험관 로커에서 교반하면서 30분 동안 배양을 합니다. 다음으로, 용해된 배아를 11, 000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 불용성 파편을 제거합니다.

그런 다음 세척된 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. Bradford 단백질 분석 및 플롯 검량 곡선을 통해 총 단백질을 측정합니다. 이 단계에서는 400-500 마이크로그램의 총 배아 단백질을 1.5 밀리리터 마이크로분리 튜브에 넣고 버퍼 1을 사용하여 마이크로리터당 1마이크로그램으로 희석합니다.

다음으로, 요오드-125 라벨 TGF-beta II 스톡을 첨가하여 최종 농도인 150피코몰에 도달하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 시험관 로커에서 교반하며 배양합니다. 그 후, 1:100 희석에 도달하기 위해 관심 수용체에 대해 희석되지 않은 항체를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 2시간 또는 하룻밤 동안 배양을 계속합니다.

배양 후, 50 마이크로리터의 적절한 면역글로불린 결합 비드를 첨가하고 섭씨 4도의 시험관 로커에서 교반하면서 50분 동안 배양합니다. 다음 11, 20 초 동안 000 x g에 microcentrifugation에 의하여 구슬을 재기하고 적합한 방사성 쓰레기 콘테이너에 있는 상등액을 버리십시오. 그 후, 11, 000 x g에서 마이크로 원심분리에서 볼텍싱하여 1ml의 IP 세척 버퍼로 IP 비드를 매번 20초 동안 3회 세척합니다.

그런 다음 IP 비드를 250마이크로리터의 IP 세척 버퍼에 다시 현탁합니다. 새로운 DSS 용액을 준비하고 1.5마이크로리터를 샘플에 추가합니다. 그런 다음 교반과 함께 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

가교 반응을 소멸시키기 위해 pH 7.4에서 충분한 트리스트 클로라이드 스톡이 보충된 500마이크로리터의 IP 세척 버퍼를 추가하여 25밀리몰 트리스트 클로라이드에 도달합니다. 다음으로, 11, 00 x g에서 20초 동안 원심분리하여 IP 비드를 수집합니다. 그 후, 상등액을 버리고 IP 비드를 30 마이크로 리터의 환원 laemmli buffer에 다시 현탁시킵니다.

다음으로, SDS-PAGE 젤 전기 이동법 전에 5 분 동안 94 섭씨 온도에 표본을 비등시키고 그 후에 인광계에 있는 또는 전통적인 autoradiography에 의하여 건조된 젤을 분석합니다. 이 그림은 AFLIP로 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 72 hpf 및 48 hpf의 배아에서 추출한 총 단백질을 Iodine-125 TGF-beta II 친화성 표지에 적용한 후 토끼 항제브라피시 BG 또는 토끼 항쥐 BG를 대조군으로 IP를 적용했습니다.

자가방사선 촬영에서 BG는 GAG 없이 또는 글리코사미노글리칸 변형 BG로 검출할 수 있습니다. 이 그림은 실험적 조작(이 경우 모르폴리노 주입에 대한 베타글리칸의 감소)을 받은 배아에서 주어진 수용체의 발현 수준을 측정하기 위해 AFLIP를 사용하는 방법을 보여줍니다. 1열은 72 hpf 야생형 배아에서 TGF 베타 수용체 III의 수준을 보여주고, 2열은 ZFPG 1차 전사체의 엑손 2-인트론 2 경계로 향하는 7나노그램의 모르폴리노를 투여하는 효과를 보여줍니다. 이 morpholino로 얻은 BG 하향 조절은 일치하지 않는 대조군에 의해 재현되지 않습니다.

이러한 결과는 이 morpholino로 얻은 표현형이 앞서 설명한 바와 같이 TGF 베타 수용체 III의 녹다운에 특이적임을 확인했습니다. 성장 인자 또는 사이토카인 수용체를 검출하기 위한 AFLIP의 성공 여부는 수용체에 결합하고 가교 결합할 수 있는 방사성 표지 리간드의 가용성에 달려 있습니다. 면역침전을 위한 좋은 항체도 필요합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. AFLIP는 웨스턴 블롯(western blot)의 전달 단계를 피하기 때문에 당화(glycosylated receptor)를 강화할 수 있습니다. 그리고 우리는 여기에서 웨스턴 블롯에서 매우 비효율적으로 전달되는 프로테오글리칸 베타글리칸(proteoglycan betaglycan)을 보았습니다.이 절차에 따라 전기영동 기술에 의해 밝혀지는 한 추가적인 번역 후 변형을 설명하기 위해 효소 분해와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 AFLIP가 면역침전과 관련된 친화성 표지를 통해 여러 어류 배아에서 풍부하고 낮은 수용체를 감지하는 데 어떻게 도움이 되는지 잘 이해하게 될 것입니다. 마지막으로, 요오드-125로 작업하는 것은 주의와 적절한 보호가 있어야 한다는 것을 잊지 마십시오. 실험에 행운을 빕니다.