양적 응용 프로그램에 대한 균일 MALDI 시료의 제조

MALDI MS를 위한 이 시료 준비 방법의 전반적인 목표는 MALDI MS 분석 중 이온 신호의 공간적 불균질성을 줄이는 것입니다. 건조 과정 동안 시료 액적 내부의 유체역학적 흐름을 제어함으로써 기존의 건조 액적법(dried-droplet method)을 최적화하기 위해 잘 제어된 건조 환경을 구축하였습니다. 이 기술의 주요 장점은 최적화된 건조 액적법으로 준비된 시료의 이온 신호에 대한 공간적 불균질성을 효과적으로 줄일 수 있다는 점입니다. 또한 이 방법은 THAP Metric System을 위한 균질한 시료를 제공할 수 있습니다.

이는 alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid와 같은 다른 매트릭스 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 건조 조건을 제어하는 것이 쉽지 않아 어려움을 겪었습니다. 이 절차를 시작하려면, 건조 챔버의 문을 열고 즉시 이전에 세척한 샘플 플레이트를 구리 기반 블록 위에 놓으십시오.

그런 다음, 문을 닫습니다. 가스 유량계를 수동으로 조절하여 질소 유량을 시간당 10 standard cubic feet로 설정하십시오. 이후, 습도계로 측정한 건조 챔버 내의 상대 습도가 항상 25% 미만이 되도록 가스 유량계를 미세 조정합니다.

K형 열전대(K Type Thermocouples)를 사용하여 온도를 모니터링하면서, 실험을 위해 샘플 플레이트가 5 °C에 도달할 때까지 워터 서큘레이터(water circulator)의 온도를 수동으로 조절하십시오. 샘플 증착 전에 필요한 온도와 상대 습도에 도달했는지 확인하십시오. 마이크로원심분리기 튜브에 0.25 µL의 0.1 M THAP 용액과 0.25 µL의 대상 분석물을 넣고 혼합하십시오.

샘플을 3초 동안 볼텍싱합니다. 그 후, 샘플을 2초 동안 원심분리하여 마이크로원심분리 튜브 바닥에 용액을 모읍니다. 원심분리가 끝나면 건조 챔버의 문을 열고 피펫을 사용하여 샘플 플레이트에 용액 0.1 µL를 조심스럽게 도포합니다.

즉시 문을 닫고 시료 액적이 완전히 마를 때까지 기다립니다. 시료 플레이트의 온도를 주변 온도보다 낮게 유지하면 액적 내 재순환 흐름의 평균 속도가 크게 증가하여 분자들이 재분배됩니다. 시료 증착은 데이터의 품질과 재현성을 결정하는 가장 중요한 단계입니다.

시료가 제어된 조건에서 결정화되도록 하기 위해, 미리 혼합된 시료 용액을 즉시 시료 플레이트에 도포해야 합니다. 건조가 완료되면 건조 챔버의 문을 엽니다.

그 다음, 워터 서큘레이터의 온도를 25 °C로 설정합니다. 샘플 플레이트의 온도가 25 °C로 돌아오면, 건조 챔버에서 샘플 플레이트를 꺼냅니다. 5배 배율의 실체 현미경으로 샘플의 형태를 관찰하고, 명시야 이미지를 촬영합니다.

이 단계에서 샘플 플레이트를 MALDI 질량 분석기에 삽입합니다. 그런 다음, 이미징 질량 분석을 수행합니다. 결과 창에 표시된 질량 목록에서 특징적인 질량 피크를 선택하고 2D를 클릭하여 2차원 이온 이미지를 도식화합니다.

다음으로, 팝업 창의 조정 버튼을 클릭하여 신호 강도의 상한선과 하한선을 결정함으로써 이미지 해상도를 높이고, 사진 저장(save a picture)을 클릭합니다. 이온 이미지와 이전에 획득한 명시야(brightfield) 이미지를 관찰 및 비교하여 필수적인 시료 영역을 확보하십시오. 이제 결과 창에 표시된 이온 이미지에서 빈 지점(null spots)과 균열된 영역을 클릭하여 분석할 영역을 미세 조정합니다.

'find edge' 버튼을 클릭하여 이온 이미지의 가장 바깥쪽 층을 찾습니다. 그다음 'deduct'를 클릭하여 가장 바깥쪽 층의 이온 풍부도 정보를 데이터베이스에 저장하고, 동시에 이온 이미지에서 해당 층을 제거합니다. 이 과정을 이온 이미지의 중심이 정의될 때까지 반복한 후, 출력 데이터 목록의 모든 체크박스를 선택하고 'export'를 클릭하여 데이터를 내보냅니다.

마지막으로, 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 내보낸 데이터를 열고 모든 층의 평균 이온 강도를 계산하여 이온의 공간적 분포 정보를 얻습니다. 말토트리오스(maltotriose)의 명시야 및 MALDI 이미지에서, 샘플 플레이트 온도를 25 °C로 설정하여 준비했을 때 나트륨 결합 형태의 이온 신호는 주로 샘플 영역의 주변부에 분포합니다. 온도를 5 °C로 낮추면 신호가 전체 샘플 영역에 걸쳐 균일하게 분포하며, 이는 더 낮은 샘플 플레이트 온도에서 샘플을 준비하는 것이 분자를 유의미하게 재분포시키고 불균질성을 줄일 수 있음을 시사합니다.

양성자화된 bradykinin 단편 이온 이미지는 나트륨 부가 maltotriose와 유사한 경향을 보여줍니다. 통계 분석 결과, 시료 플레이트 온도를 5 °C로 유지했을 때 얻은 이온 신호의 불균질성은 25 °C일 때와 비교하여 60~80% 감소하는 것으로 나타났습니다. 나트륨 부가 maltotriose의 경우, 시료 플레이트 온도가 25 °C일 때 중심부의 신호 강도가 5 °C일 때보다 훨씬 낮았습니다.

양성자화된 bradykinin 단편은 샘플 플레이트의 온도를 25°C에서 5°C로 낮추었을 때 변동성이 더 적게 나타납니다. 이 건조 방법을 시도할 때는 건조 챔버 내의 온도와 상대 습도를 주의 깊게 제어하고 모니터링해야 합니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 샘플 준비를 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, MALDI MS 분야의 연구자들은 건조 액적(dried-droplet) 시료에 대한 정량 분석을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, MALDI MS 분석을 위해 균질한 건조 액적 시료를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.