포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

이 실험 절차의 전반적인 목표는 포도 품종인 Corvina의 베리 대사체 및 전사체에서 서로 다른 테루아(terroir) 특성을 관찰하는 것입니다. 여기서 설명하는 사례 연구에는 3개의 성장 시즌 동안 3개의 거시 구역에 있는 7개 포도원에서 세 가지 성숙 단계의 샘플을 수집하고 분석하는 과정이 포함되었습니다. 설명된 기술들은 베리 대사체에 미치는 빈티지 효과에 따른 지배적인 성숙 과정을 밝혀냅니다.

잘 익은 베리에서도 세 가지 거시 구역을 나타내는 뚜렷한 특정 화학적 시그니처가 확인되었습니다. 거시 구역 수준의 테루아 시그니처는 전사체 및 대사체 데이터 행렬을 모두 분석하기 위해 주성분 분석인 PCA와 양방향 직교 투영 잠재 구조 판별 분석인 auto BLSDA와 같은 적절한 통계 기법을 사용하여 밝혀졌습니다. 반면, 개별 포도원 간의 차이는 더 미묘하며, 더욱 정교하고 민감한 통계적 접근 방식이 필요합니다.

적절한 샘플링 계획을 수립하여 실험을 시작하십시오. 샘플링 계획에는 샘플링 장소, 시간 및 정확한 샘플링 절차가 명시되어야 합니다. 두 포도나무 열을 따라 서로 다른 위치에서 30개의 송이를 수확한 후, 각 송이에서 가시적인 손상이나 감염 징후가 없는 베리 3개를 무작위로 선택하십시오.

이 과정을 반복하여 각 성숙 단계별로 세 개의 독립된 풀(pool)을 확보합니다. 베리에서 씨앗을 제거하고, 과피를 즉시 액체 질소에 넣어 급속 동결시킵니다. 각 풀의 동결된 베리를 자동 밀 그라인더(automatic mill grinder)로 분쇄합니다.

각 분말 시료를 전사체 분석용과 대사체 분석용으로 두 등분으로 나눕니다. 그 다음, 듀어(duer)를 닫고 제거한 후 분말을 -80 °C에서 보관합니다. 베리 시료의 대사 추출물은 0.1% formic acid로 산성화한 3배 부피의 methanol을 사용하여, 40 kHz 초음파 세척기에서 15분 동안 상온에서 준비합니다.

추출물을 4 °C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 탈이온수 2배 부피로 희석한 후 0.2 µm 필터로 여과합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 전기분무 이온화원(electrospray ionization source)이 결합된 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(HPLC-ESI-MS) 시스템을 설정합니다.

용매 A와 B의 선형 기울기를 사용하여 0.2 milliliters per minute의 일정 유속으로 HPLC 분리를 수행하며, 시료 주입 부피는 30 microliters로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 기재된 파라미터를 사용하여 음이온 및 양이온 모드를 교대로 적용해 질량 분석 스펙트럼을 획득합니다. LCMS 데이터를 처리하기 위해, 오픈 소스 소프트웨어인 M Zeta Mine 버전 2.14와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 피크 검출 정렬, 갭 채우기 및 피크 필터링 절차를 수행합니다.

결과 텍스트 파일을 스프레드시트로 가져옵니다. 이를 통해 식별 번호, 질량 대 전하비 값 및 유지 시간으로 인식된 모든 검출 대사물질이 각 샘플의 피크 면적 값으로 정량화된 데이터 매트릭스가 생성됩니다. 41.8 µL의 탈이온 RNAse-free water 최종 부피에 1.65 µg의 시아닌 표지 상보적 RNA를 넣어 4-팩 포맷 사양에 따라 하이브리드화 어셈블리를 준비합니다.

10X 블로킹제 11 µL와 25X 단편화 완충액 2.2 µL를 추가합니다. RNA를 단편화하기 위해 항온수조에서 60 °C로 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 즉시 얼음 위에서 1분 동안 냉각합니다.

마지막으로 2X 하이브리다이제이션 버퍼 55 µL를 추가하고 피펫팅하여 잘 섞습니다. 실온에서 15,500 ×g로 1분간 원심 분리한 후, 즉시 마이크로 원심분리 튜브를 얼음에 둡니다. 커스텀 마이크로어레이를 장착하려면, 라벨이 위를 향하도록 가스켓 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버 바닥에 넣습니다.

기포가 생기지 않도록 피펫 팁으로 액체를 분주하며, 각 가스켓 웰에 하이브리다이제이션 샘플 100 µL를 천천히 로딩합니다. 숫자 바코드가 위를 향하도록 하여 맞춤형 마이크로어레이를 아래를 향하게 천천히 배치합니다. 샌드위치 쌍이 제대로 정렬되었는지 확인하십시오.

마지막으로, 샌드위치 형태로 겹쳐진 슬라이드 위에 하이브리다이제이션 챔버의 덮개를 덮고, 챔버의 클램프를 손으로 조입니다. 조립된 챔버를 회전시켜 기포의 이동성을 확인합니다. 조립된 슬라이드 챔버를 65 °C로 설정된 하이브리다이제이션 오븐 내의 균형 잡힌 로티세리에 넣습니다.

로테이터를 10 RPM으로 회전하도록 설정합니다. 하이브리드화가 17시간 동안 진행되도록 둡니다. 마이크로어레이 슬라이드 세척을 진행하기 위해, 슬라이드 염색 용기 3개를 준비하고 각각에 적절한 세척 완충액을 채웁니다.

두 개의 디쉬에 상온의 세척 버퍼 1을 채우고, 또 다른 한 개의 디쉬에 미리 데워둔 세척 버퍼 2를 채웁니다. 하이브리다이제이션 챔버를 분해하고 샌드위치를 제거합니다. 마이크로어레이 슬라이드의 숫자 바코드가 위를 향하게 하여, 상온의 세척 버퍼 1이 채워진 첫 번째 슬라이드 염색 디쉬에 샌드위치를 담그고, 깨끗한 포셉을 사용하여 가스켓을 마이크로어레이 슬라이드에서 분리합니다.

마이크로어레이 슬라이드를 슬라이드 랙으로 빠르게 옮긴 후, 상온의 세척 버퍼 1이 채워진 두 번째 슬라이드 염색 용기에 넣습니다. 슬라이드 염색 용기를 마그네틱 교반기 위에 놓고, 적절한 속도로 교반하며 1분 동안 세척합니다. 슬라이드 랙을 미리 가온된 세척 버퍼 2가 채워진 세 번째 슬라이드 염색 용기로 빠르게 옮기고, 적절한 속도로 교반하며 1분 동안 세척합니다.

슬라이드 염색 용기에서 랙을 천천히 꺼내고, 액방울이 튀지 않도록 주의하며 랙에서 슬라이드를 조심스럽게 분리합니다. 마이크로어레이 슬라이드를 적절한 스캐너에 넣고, 마이크로어레이 제조사의 사용 설명서에 권장된 파라미터 설정을 사용하여 각 어레이를 스캔합니다. 통계 분석 소프트웨어를 준비하기 위해, 먼저 대사체학 및 전사체학 데이터를 가져옵니다.

파일(File), 새 일반 프로젝트(New Regular Project), 새 일반 프로젝트(New Regular Project)를 차례로 선택하여 획득한 데이터 행렬을 가져옵니다. 그런 다음 편집(Edit)을 클릭하십시오. 전체 행렬을 전치(Transpose)하고, 홈(home)에서 적절한 기본 ID 및 보조 ID를 할당한 후 완료합니다.

다변량 통계 분석을 수행하려면, Workset 창으로 이동하여 모델 유형으로 PCAX를 선택하고 AutoFit을 클릭하십시오. Scores를 선택한 다음 Scatter를 선택하여 샘플의 가능한 그룹화를 보여주는 도표를 확인합니다. PCA score plot을 검토하십시오.

적절한 모델이 구축되었다면, 동일한 샘플 클래스를 사용하여 O2PLS 판별 분석 모델을 구축하십시오. MacroZone에 의해 분류된 샘플을 사용하여 두 개의 O2PLS 판별 분석 모델을 구축하려면, Home 창에서 New As, M1, Observations로 이동하여 클래스를 할당하십시오. 원하는 클래스를 설정하십시오.

그 다음, 모델 유형을 PCAX에서 O2PLS 판별 분석으로 변경합니다. Autofit을 누릅니다. Project 창에서 M2를 선택한 후, Scores를 클릭하고 Scatter를 클릭하여 도표와 시료 클래스의 위치를 확인합니다.

데이터 유형 선택(Select Data Type)으로 이동하여 관측치 및 로딩(Observations and Loadings)을 선택하십시오. 그런 다음 시리즈 추가(Add Series)를 클릭하고 PQ correlation one, PQ correlation two 항목 또는 추가 구성 요소가 있는 경우 이를 선택하십시오. 플롯 위에서 마우스 오른쪽 버튼을 누른 상태로 속성(Property)으로 이동하여 색상(Color)을 선택한 다음, 분자와 클래스별로 플롯 기호를 구분하기 위해 용어별(By Terms)을 선택하십시오.

원하는 특성으로 플롯을 수정하려면 Layout, Format Plot, Access 또는 Styles로 이동하십시오. 하나 이상의 특정 클래스를 특징짓는 대사산물을 관찰하려면 Plot List로 이동한 다음 Scatter를 선택하십시오. PCA를 통한 전체 데이터 행렬의 탐색적 분석 결과, 샘플들이 제1 및 제2 주성분을 따라 veraison, 중기 숙성, 완숙을 포함한 숙성 단계에 따라 군집을 형성하는 것으로 나타났습니다.

샘플들은 세 번째 주성분을 따라 성장 계절에 맞게 군집화되었습니다. 성숙한 베리에 대한 O2PLS 판별 분석을 통해 Valpolicella, Garda Lake, Soave의 세 가지 거시 구역을 나타내는 특정 테루아 시그니처를 식별할 수 있습니다. 이 모델들의 로딩 플롯은 샘플 클래스인 P와 대사체인 Q 사이의 상관관계인 PQ 상관관계로 표시됩니다.

로딩 플롯에서 빨간색 사각형은 샘플 또는 매크로존(macrozones)의 클래스를 나타내며, 색상이 있는 삼각형은 개별 대사물을 나타냅니다. 대사물은 화학적 클래스에 따라 색상으로 구분되었으며, 대사물과 샘플 사이의 거리는 이들 간의 관계를 반영합니다. Lake Garda 매크로존은 스틸벤(stilbenes)이 특징적이었던 반면, Soave와 Valpolicella는 플라보노이드(flavonoids)가 두드러졌습니다.

안토시아닌 중에서 페오니딘과 그 유도체는 가르다 호수(Lake Garda) 거대구역에서 더 많이 나타난 반면, 다른 안토시아닌들은 발폴리첼라(Valpolicella) 거대구역에서 더 많이 나타났습니다. 또한, 안토시아닌 3-O-글루코시드는 발폴리첼라 거대구역에서 더 우세했으며, 아실화 및 쿠메르화 유도체는 소아베(Soave) 거대구역에서 더 우세하게 나타났습니다. 전사체학, RA 및 RNA sig 방법들을 통해 수천 개의 포도나무 전사체를 동시에 모니터링할 수 있습니다.

최근 더 많은 수의 프로브를 포함하여 추가로 새롭게 발견된 포도속을 나타내는 새로운 맞춤형 마이크로어레이가 설계되었습니다. 전사체 플랫폼의 빠른 노후화를 고려하여, 우리는 기존 플랫폼보다 더 많은 프로브를 포함하는 새로운 플랫폼을 이용한 대안적 절차를 설명하였습니다. 여기에는 1392개의 새로 식별된 peno 유전자좌에 대한 249개의 추가적인 peno 예측 전사체와 179개의 corvina prava 유전자가 포함됩니다. HPLC-ESI-MS를 이용한 대사체 분석은 다수의 대사물을 동시에 검출할 수 있을 만큼 충분한 민감도를 갖추고 있습니다.

샘플링 평면을 구축하는 능력은 매우 중요합니다. 유전적 차이를 최소화하기 위해 단일 클론을 선택하고 샘플링 기간을 다각화함으로써, 테루아 간의 실제적인 차이를 식별할 수 있었습니다. 덜 최적화된 지역에서 재배된 동일한 품종을 비교하는 것도 흥미롭겠으나, 안타깝게도 해당 포도원들을 이용할 수 없었습니다.