Name: 타액 항체 멀티 플렉스 면역을 개발하는 것은 환경 병원체의 인체 노출을 측정하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 배우세요 타액 항체 비드 기반 멀티플렉스 면역분석법을 활용하여 환경 병원체에 대한 인체 노출을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 여러 병원체에 대한 IgG 항체 반응을 동시에 분석하여 노출 과학 연구의 효율성과 정확성을 높입니다.

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Clarissa Curioso는 미국 에너지부와 미국 EPA 간의 기관 간 협정을 통해 Oak Ridge Institute for Science and Education이 관리하는 미국 환경 보호국의 연구 참여 프로그램에 임명되어 지원을 받았습니다.

승인 (IRB # 08-1844, 노스 캐롤라이나, 채플 힐, 노스 캐롤라이나, 미국의 대학) 케론 비치, 푸에르토 리코,에서 beachgoers에서 자극 열구 타액 샘플의 수집에 대한 미국의 일환으로 임상 시험 심사위원회로부터 얻은 것 환경 보호청 (USEPA) 국립 역학 및 레크리에이션 (NEEAR) 물 연구 (23)의 환경 평가 수영 관련된 노출과 질병을 평가합니다. 연구 주제는 동의를 제공하고 훈련 USEPA 계약에 의해 타액 수집 장치의 사용에 지시했다. 타액 샘플을 수신하면, 그들이 원심 분리 4 바와 같이 -80 ° C에 저장된 얼음에 제공 하였다. 1. 구슬 활성화 <ol><li> 텍싱 20 초 동안 초음파 처리 및 마이크로 원심 튜브에 주식 비드 (400 μL)의 전송 약 5.0 × 10 (6)에 의해 재현 탁 비드 세트 주식. 참고 : T를그는 12.5 × 106 비즈 / ml의 농도로 공급된다 구슬. </li><li> 2 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여 주식 비드 펠렛. </li><li> 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 증류수 (DH 2 O)를 뜨는을 제거하고 100 μL의 펠렛 비드를 재현 탁. 단계를 반복 1.2. </li><li> 상층 액을 제거하고 20 초 동안 소용돌이와 초음파 100 mM의 인산 나트륨 염기, 산도 6.2의 80 μL에 세척 된 비드를 재현 탁. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 10 mg의 설포 NHS의 나누어지는 200 μL의 DH 2 O를 추가하여 50 ㎎ / ㎖ N -hydroxysulfosuccinimide (설포 NHS) 솔루션을합니다. 소용돌이로 섞는다. </li><li> 구슬에 50 ㎎ / ㎖ 설포 NHS의 10 μl를 추가합니다. 소용돌이로 섞는다. </li><li> 사용 직전에, 10 mg을 EDC 분취 200 μL를 증류수 (DH 2 O)을 첨가하여 50 ㎎ / ㎖ -1- 에틸 [3dimethylaminopropyl] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 용액을 만든다. 소용돌이로 섞는다. </li><li> 50의 10 μl를 추가구슬로 ㎎ / ㎖ EDC 솔루션입니다. 소용돌이로 섞는다. 10 분 간격으로 와류에 의해 혼합하여, 어두운 곳에서 실온에서 20 분 동안 비드 부화. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation에 의해 활성화 된 구슬 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 50 mM의 2- [N -Morpholino] 에탄 설 폰산 (MES), 산도 5.0의 250 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation에 의해 활성화 된 구슬 펠렛. </li><li> 반복 1.9 및 1.10 단계를 반복합니다. 참고 :이 50 MM의 MES, pH가 5.0이 세척의 총을 제공합니다. </li><li> 20 초 동안 소용돌이와 초음파 50 MM의 MES, pH 5.0으로 100 ㎕의 구슬을 재현 탁. </li></ol> 2. 구슬 커플 링 <ol><li> 몇 표 1에 도시 된 농도를 사용하여 비드 세트 항원. </li><li> 활성화 된 구슬 각 항원을 추가하고 50 MM의 MES, pH 5.0으로 500 μL에 총 볼륨을 가지고. 항원을 혼합소용돌이로 D 구슬. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 회전 (~ 15 RPM)로 혼합하여 2 시간 동안 항원과 구슬을 품어. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation에 의해 결합 된 구슬 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 인산염 완충 생리 식염수 500 μL에 구슬을 재현 탁 (PBS) -bovine 혈청 알부민 (BSA) -polyoxyethylenesorbitan 모노 라우 레이트 (트윈 20) 소디움 아 지드 (PBS-TBN) 와류 및 초음파에 의해 pH가 7.4. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 주의 : 아 지드 화 나트륨은 급성 독성 화학 물질이다. 섭취 또는 피부에 접촉에 들어갔을 경우는 치명적이다. 먼지 / 연기 / 가스 / 안개 / 증기 나 분무를 흡입하지 말 것. 적절한 개인 보호 장비 (PPE의) 처리 할 때 착용하고 적절한 법률에 따라 폐기. </li><li> 20 초 동안 소용돌이 및 초음파에 의해 PBS-TBN 1 ㎖의 구슬을 재현 탁. </li><li> 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 펠렛. </li><li>반복 2.5 및 2.6 단계를 반복합니다. 참고 :이 PBS-TBN 두 세척 총을 제공합니다. </li><li> PBS 1 ml의 1 % BSA, 0.05 % 아 지드, pH 7.4의 결합에 세정 비드를 재현 탁. 어둠 속에서 2-8 ° C 형 냉장고에 결합 된 구슬을 저장합니다. </li></ol> 3. 구슬 개수 <ol><li> 물 또는 PBS 버퍼에 결합 된 구슬의 1:10 희석을 준비합니다. </li><li> 로드 샘플 도입 지점에서 혈구 상 비드 희석액 10 μL. </li><li> 4 × 4 코너 그리드 중 하나에서 볼 구슬을 계산합니다. 카운트 (4 × 4 격자의 모서리 1) × (1 × 104) × (희석 배수) 용액에 재현 탁 X 용적은 다음 식을 이용하여 비드에 결합의 총 수를 계산한다. </li></ol> 항원 커플 링 4. 확인 <ol><li> 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 관심의 항원에 결합 된 구슬의 주식 혼합물을 재현 탁. </li><li> 마지막으로 결합 된 비드 주식을 희석하여 작업 비드 혼합물을 제조PBS-1 % BSA 완충액 (PBS-1 % BSA, pH 7.4의)에서 설정 한 각 고유 비드 / 100 ㎕의 농도 비드. </li><li> 최소 7 PBS-1 % BSA 버퍼 96 웰 둥근 바닥 플레이트 제조업체의 권장 사항에 따라 IgG의 일차 항체 방지 종의 연속 희석을 두 배 준비합니다. </li><li> 세척 완충액 100 ㎕ 각 항원 결합 확인 시험 96 웰 필터 바닥 판의 별도의 8 잘 칼럼 (8 행) 사전 습식 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 사전 젖은 우물에 비드 혼합물 (항원 - 결합 구슬) 작업의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 배경 우물 역할을 희석 ​​항체 대신에 팔을 행하기 위해 96 웰 필터 플레이트의 각 컬럼의 행 1-7과 PBS-1 % BSA 버퍼의 50 μL에 항체 희석의 50 μl를 추가합니다. 로 pipetting하여 5 회 다운 멀티 채널 피펫으로 혼합한다. 모든 항원 - 결합 된 비드 세트에 대해 동일한 절차를 수행하는 확인한다. </li><li> 덮고 실온에서 어둠 속에서 부화 할 수 있도록500 rpm에서 마이크로 통에 1 시간 동안 erature. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 1 배를 반복합니다. 멀티 채널 피펫에 PBS-1 % BSA 50 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> PBS-1 % BSA에서 16 μg의 / ㎖ 비 오티 닐화 항에 종에게 특정 IgG를 이차 항체 검출을 희석. </li><li> 아래로 5 회를 피펫 팅에 의해 각 웰에 희석 차 항체의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 필터 판을 포함하고, 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫에 PBS-1 % BSA 50 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> PBS-1 % BSA 24 μg의 / ㎖로 스트렙 타비 딘-R-피코 에리 트린 기자 (SAPE)를 희석. </li><li> 각 기자의 50 μl를 잘 추가로 pipetting에 의해 5 배 아래로 섞는다. </li><li> 기음필터 플레이트 위에 것은 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다. </li><li> 재현 탁의 PBS-1 % BSA 100 ㎕ 구슬 및 분석기 (29)를 사용하여 50 μl를 분석합니다. 참고 : 비드 기반 멀티 플렉스 면역의 결과는 중간 형광 강도 (MFI)로 측정된다. 오류를 방지하기 위해 가능한 경우 항상 소프트웨어 설명서의 최신 버전을 참조하십시오. </li></ol> 5. 타액 멀티 플렉스 면역 <ol><li> -80 ° C 냉장고에서 침을 제거하고 실온에서 해동 할 수 있습니다. </li><li> 재현 탁 항원은 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 비드 주식을 결합. </li><li> PBS-1 % BSA 버퍼 내의 각각의 고유 한 세트의 비드 / 100 μl의 비드의 최종 농도로 결합 된 비드 주식 희석 작업 비드 혼합물을 제조한다. </li><li> 타액의 4 희석 w : 1 준비PBS-1 % BSA의 96에서 버퍼 아니라, 깊은 우물 판 번째. </li><li> 사전 젖은 필터 세척 버퍼 100 ㎕와 함께 접시 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 8 최종 희석 작업 비드 혼합물 1의 96 웰 필터 플레이트의 95 우물에 희석 타액의 같은 부피의 50 μl를 추가합니다. 멀티 채널 피펫으로 반응을 섞는다. 물론 하나의 제어에 50 μl의 항원 결합 비즈 플러스 (타액의 대체 등) PBS-1 % BSA 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 커버 500 rpm에서 마이크로 플레이트 진탕 기에서 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 터로 PBS-1 % BSA 50 μL에 재현 탁 구슬. </li><li> PBS-1 % BSA에서 16 μg의 / ml의 바이오틴 화 된 염소 항 - 인간 IgG 이차 항체 검출을 희석. </li><li> 각 웰에 차 항체를 희석하여 50 μl를 추가로 내용을 혼합멀티 채널 피펫. </li><li> 필터 판을 포함하고, 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 터로 PBS-1 % BSA 50 μL에 재현 탁 구슬. </li><li> PBS-1 % BSA 24 μg의 / ㎖로 스트렙 타비 딘-R-피코 에리 트린 기자 (SAPE)를 희석. </li><li> 각 50 μL 기자를 잘 추가하고 멀티 채널 피펫과 함께 섞는다. </li><li> 필터 판을 포함하고, 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다. </li><li> 재현 탁의 PBS-1 % BSA 100 ㎕ 구슬 및 분석기 (29)를 사용하여 50 μl를 분석합니다. 참고 : 다중 면역의 결과는 중간 형광 강도 (MFI) 단위로 측정된다. 항상 참조소프트웨어 설명서의 최신 버전은, 가능하면하는 오류를 방지 할 수 있습니다. </li></ol>

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연구 개발의 오피스를 통해 미국 환경 보호국 (EPA)이 자금을 지원하고 여기에 설명 된 연구 관리. 이 기관의 관리 검토를 실시하고 게시 승인되었습니다. 상품명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용 승인 또는 추천을 구성하지 않습니다.

이러한 결과는 멀티 플렉스 면역 방법은 면역 양성 또는 immunonegative 있습니다 타액 샘플을 구별하는 데 유용 있음을 나타냅니다. 의 면역 반응을 결정하기 위해, 하나의 차단 점 평균 플러스 타액 샘플 모두에서 테스트 제어 비결 비드 로그 변환 MFI 응답의 세 개의 표준 편차를 계산하여 개발되었다. 컷 - 오프 포인트는 단일 또는 다수의 병원체에 노출 immunoprevalence을 평가하는 능력을 수득 하였다. 이 차별적 전력은 환경과 다른 병원균에 대한 노출과 관련된 건강 위험을 조사 인구 연구에 유용 할 수있다. 상기 MFI의 분포, 비 결합 제어 어떤 연구가 응답하도록 설계 문제에 따라 컷오프 포인트를 결정하는데 사용될 수있는 몇 가지 다른 방법이있다. 컷 - 오프를 결정하기위한 몇 가지 예는, 유한 혼합 모델링 24-26을 포함 뜻 플러스 3컨트롤에 대한 응답의 표준 편차는 컨트롤에 대한 응답의 2 표준 편차 및 컨트롤 27,...

설사 관련 질병의 88 %가 전 세계적으로 약 150 만 명이 사망 원인이 오염 된 물에 대한 인체 노출 안전하지 않은 음식, 그리고 가난한 위생 / 위생과 연관되어, 대부분의 어린이 1입니다. 이는 공중 보건 관리 및 정책 결정자에 대한 관심의 주요 원인이다. 수성 및 기타 환경과 관련된 병원체 노출과 질병을 조사하기 위해, 우리는 사람의 샘플 2-4에 대한 항체를 측정하는 다중 면역 분석을 개발 하였다. 이 방법은 이러한 병원체의 인체 노출을 결정하기 위해 더 나은 immunoprevalence 및 사고 감염을 정의하는 역학 연구에 적용 할 수 있습니다. 침은 인간의 바이오 마커 연구를위한 혈청의 대안으로 상당한 약속을 보유하고있다. 타액의 장점 중에서는 비 침입 및 샘플 수집, 저비용의 용이성, 그리고 샘플 아이 쉽게 5-7 &lt;로부터 회수 할 수있다/ SUP&gt;. 혈청 및 타액 샘플 H.에 대한 항체에 대해 광범위하게 연구되어왔다 파이로리 2,3,8, 말라리아 원충 (9), Entamoeba의 아메바 (10),와 포자충 포자충 3,11, 연쇄상 구균 폐렴 (12), 간염 바이러스 A와 C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. 포자충 2-4, 뎅기열 바이러스 16, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) (17), 대장균 O157 : H7 18. 멀티 플렉스 면역 동시에 하나의 샘플 볼륨 내에서 단일주기 또는 실행 내에서 여러 분석의 분석이 가능합니다. C.에서 멀티 플렉스 항원 jejuni와, T. 포자충, H. 파이로리는 A 형 간염 바이러스와 두 noroviruses은을 사용하여 병원체 인간 IgG의 타액 2-4 IgA와 IgG의 3,4- 및 2,3- 플라즈마 항체 반응을 측정하는 데 사용했다비드 기반 다중 면역. 물, 토양 및 식품 미생물에 노출 역학적 연구와 함께 사용될 때, 본 연구에 기재된 분석의 유형은 환경 병원체에 의한 감염에 대한 이해를 향상시키기 위해 중요한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 이러한 연구에서 수득 타액 항체 데이터는 위험 평가 모델 19-22을 향상 시키는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Equipment and Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>75002446</td><td>시료를 원심분리하는 데 사용</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>시료 혼합에 사용</td></tr><tr><td>Sonicator (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td> 비드 Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch를 <td>분리하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. </td><td>Capp</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 (Bright Line)</td> <td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>결합 비드를 계수하는 데 사용</td></tr><tr><td>멀티스크린 진공 매니폴드</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>상등액을 제거하기 위한 세척 단계에 사용</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>배양 중 비드를 교반하는 데 사용</td></tr><tr><td>튜브 랙(1.5ml 및 0.5ml)(모듬)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>계량 저울</td><td>Mettler 또는 기타</td><td></td><td>완충액 제조를 위한 세척 시약을 측정하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>커플링 배양 단계에서 사용됨</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>항체 반응 데이터를 분석하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>항체 반응 데이터를 분석하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>xPonent 3.1 소프트웨어를 사용한</td><td>Luminex Analyzer Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td> assayAntigens<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 Norwalk 바이러스를</td> 실행하는 <td>데 사용되는 기기 및 소프트웨어 Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*신시내티 아동 병원. 최종 conc. 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 노로바이러스 VA387: p-입자</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Cincinnati Childrens' Hospital. 최종 conc. 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>A형 간염 바이러스: 세포 배양에서 2등급 농축</td><td>액 Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>항원 100 &마이크로에서 결합; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: 용해물</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>25 &micro에서 결합된 항원; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>25 &micro에서 결합된 항원; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: 열이 사멸된 전체 세포</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>50 &micro에서 결합된 항원; g</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig anti-Norovirus</td><td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>커플링 확인에 사용</td></tr><tr><td>마우스 anti-Hepatitis A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>커플링 확인에 사용</td></tr><tr><td>마우스 anti-Hepatitis A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>커플링 확인에 사용</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity Helicobacter pyloriKPL에 대한 정제 항체</td><td></td> <td>01-93-94</td><td>Goat</td></tr><tr><td>pAb to Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>결합 확인에 사용</td></tr><tr><td>BacTrace Goat anti-Campylobacter 종</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>결합 확인</td></tr><tr><td>에 사용Secondary&nbsp; 항체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H + L)</td> <td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>커플 확인에 사용</td></tr><tr><td>Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H + L)</td> <td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>커플 확인에 사용</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td> <td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>커플 링 확인</td></tr><tr><td>에 사용Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>176-1506</td><td>커플 링 확인에 사용</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 공중 합체 미세 원심 분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>저 결합 미세 원심 분리기 튜브</td></tr><tr><td>10 &micro로 사용; l 피펫 팁 리필</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l 피펫 팁 리필</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro; l 피펫 팁 리필</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>다양한 공급</td><td></td> 업체 <td>사용 배양 중 어둠 속에 구슬 보관</td></tr><tr><td>딥 웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>타액 샘플 희석에 사용</td></tr><tr><td>멀티 스크린 필터 플레이트</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>분석을 실행하는 데 사용</td></tr><tr><td>Oracol 타액 수집 시스템</td><td>Malvern Medical Developments Limited</td><td></td><td>타액 채취에 사용</td></tr><tr><td><강>시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>카르복실화 미세구(비드)</td><td>Luminex Corporation</td><td>비드 세트에 의존</td><td>항원은 미세구체</td></tr><tr><td>EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염)</td>에 결합됨<td>Pierce</td><td>77149 또는 22980</td><td>비드 활성화</td></tr><tr><td>에 사용Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosoxynimide)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>비드 활성화에 사용</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml)</td><td>Molecular Probes</td><td>S-866</td><td>리포터로 사용</td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)</td><td>Sigma</td> <td>결합에 사용P-9416</td><td>비특이적 결합</td></tr><tr><td>Protein Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-TBN 차단/ 저장 버퍼 (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)를</td> 제거하기 위해 세척 버퍼에 사용됩니다** <td></td><td></td><td>필터는 4°C에서 멸균하고 보관합니다. C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>시그마</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl, 2.7 mM KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A-7888</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>시그마</td><td>P-9416</td><td>0.2% (v/v)</td></tr><tr><td>아지드화나트륨 (0.05% 아지드)**</td><td>시그마</td><td>S-8032</td><td>**<강>주의</강>: 아지드화나트륨은 급성 독성이 있습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 적절한 PPE를 착용하십시오. 관련 법률에 따라 폐기하십시오.</td></tr><tr><td>MES/커플링 버퍼(0.05m MES, pH 5.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>분석 버퍼(PBS, 1% BSA, pH 7.4)&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Filter 4°C에서 살균 및 보관; C</td></tr><tr><td>PBS, 1% BSA, pH 7.4</td><td>시그마</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA</td></tr><tr><td>Activation 버퍼 (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) < / 강력 ></td><td></td><td></td> <td>필터 : 살균 및 4도에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>NaH < 이하 > 2 PO < > 4 (인산 나트륨, 일 염기 무수)</td> <td>시그마</td><td>S-3139</td><td>0.1 M NaH < 2 >< / > < > 4< / ></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr> <tr><td>< 강력 > 세척 버퍼 (PBS, 0.05 % Tween-20, pH 7.4) < / 강력 ></td><td></td><td></td> <td>필터 4 °C에서 살균 및 보관; C</td></tr><tr><td>PBS, 0.05% 트윈-20, pH 7.4</td><td>시그마</td><td>P-3563</td><td>138mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.05% 트윈</td></tr></tbody></table>

타액 항체 멀티 플렉스 면역을 개발하는 것은 환경 병원체의 인체 노출을 측정하는

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

병인 및 환경 병원체의 인체 노출의 영향에 따라서, 노출 및 감염을 사용하여 비용 효과적인, 높은 처리량 접근 방식을 평가하는 능력이 필수 불가결 한 것, 전세계 주요 관심사이고. 이 논문은 다수의 병원체를 동시에 인간 타액 항체의 존재를 측정 할 수있는 비드 기반 다중 면역 개발 및 해석을 설명한다. 그것은, 비 침습적 저렴하고 혈청보다 수집하기 쉽기 때문에 침이 응용 프로그램에서 특히 매력적이다. 환경 병원체로부터 항원 카르 미립자 (비드)에 커플 링 비드 기반 용액 상 분석을 이용하여 인간의 타액 샘플의 매우 작은 양의 항체를 측정하는데 사용 하였다. 구슬은 캄 필로 박터 jejuni와, 헬리코박터 파이로리, 톡소 포자충, noroviruses (G I.1과 G II.4)에서 항원과 A 형 간염 바이러스와 결합되었다. 항원이 충분히에 연결되었는지 확인하려면비드가 결합은 비 오티 닐화 항 - 종 차 검출 항체 및 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트린 R 기자 (SAPE)와 인큐베이션 한 후, 종 특이 동물 유래 기본 캡쳐 항체를 사용하여 확인 하였다. 그것은 임의의 항원에 결합되지 않은 것을 제외하고 비특이적 결합을 측정하기위한 대조군으로서, 하나의 비드 세트는 다른 동일하게 처리 하였다. 항원 - 결합 및 제어 비드는 유동 세포 계측법의 원리에 기초하여 높은 처리량 분석기상에서 측정 전진 수집 된 인간 타액 샘플과 함께 배양하고, 각 항원에 대한 항체의 존재는 중간 형광 세기 단위 (MFI)를 측정했다 . 다중화 면역 적은 샘플 이상의 데이터를 포함하는 장점들을 갖는다; 비용 절감과 노동; 과 능력은 관심이 많은 대상에 분석을 사용자 정의합니다. 결과 침 다중 면역 especia가 될 수있는 이전의 노출과 감염을 식별 할 수있는 것을 나타내는큰 인간 집단을 포함하는 감시 연구 에서야 베드로 유용합니다.

고유 한 비드 세트 다양성을 샘플링 비특이적 결합을 측정하기 위해 제어 및 시료로 하였다. 이러한 비드가 결합 단계에있는 항원과 함께 배양하지 않은 것을 제외하고는 항원 결합 비즈와 동일하게 처리 하였다. 상기 혈청에서 의심 오염으로 인해 분석하고, 나머지 응답은 분산 로그 된 모든 타액 샘플과 함께 배양 제어 비드에서 얻은 MFI 값&gt; (500)는 제거되었다. 잇몸이 수집 장치 나 연구 참가자가 치주 질환이있는 경우 첨부 된 스폰지로 너무 적극적으로 문질러하는 경우 타액은 혈청으로 오염 될 수있다. 로그는 MFI 데이터 평균 플러스 로그 MFI 값의 3 표준 편차에 기초하여 505 MFI의 면역 양성 컷오프 포인트를 계산하기 위해 사용 된 변형. 또한, 항원 - 결합 구슬 DIL 제외한 모든 방식으로 테스트 우물로 처리 된 특정 웰에 첨가 하였다uted 타액은 배경 형광 및 교차 - 반응성을 평가하기 위해 PBS-1 % BSA로 대체 하였다. 이러한 배경 우물에...

자원이 부족한 현재의 환경에서 연구자들이 더 저렴하고 빠르며 정확하게 연구를 수행할 수 있도록 하는 새로운 기술이 등장하고 있습니다. 여기에서는 여러 환경 병원체에 대한 인체 노출을 동시에 측정하기 위한 비드 기반 타액 항체 다중 면역분석법의 개발에 대해 설명합니다.

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

이 타액 항체 비드 기반 다중 면역 분석법의 전반적인 목표는 여러 병원체에 대한 IgG 항체 반응을 동시에 측정함으로써 환경 관련 유증상 및 무증상 질환의 원인이 되는 병원체를 식별하는 것입니다. 이 방법은 노출 과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 인구 집단에서 질병을 일으키는 원인 병원체가 무엇인지 확인하는 것 등이 있습니다.이 기술의 주요 장점은 매우 적은 양의 단순한 부피를 사용하여 여러 분석물을 대상으로 한 항체를 한 번에 빠르고 비용 효율적으로 측정할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 식품 매개, 수인성 및 공기 매개 경로를 포함하여 병원체와 그 노출원에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 절차를 제대로 설정하지 않으면 결과가 부정확할 수 있으므로, 공식적인 시연 과정이 매우 중요합니다.먼저, 균일한 비드 현탁액을 만들기 위해 항원이 결합된 비드 스톡 혼합물을 한 번에 20초씩 볼텍싱하고 초음파 처리합니다. 그런 다음 1% BSA가 첨가된 PBS를 사용하여 각 고유 비드 세트의 최종 농도가 µL당 100개의 비드가 되도록 결합된 비드 스톡을 희석합니다. 이어서, 제조사의 권장 사항에 따라 96웰 라운드 바텀 플레이트에 PBS 및 BSA를 포함한 항-종 IGG 1차 항체의 2배 연속 희석액을 최소 7단계로 준비합니다.항원 결합 확인 테스트별로 96-웰 필터 바닥 플레이트의 별도 8개 12열 웰에 100 µL의 세척 버퍼를 넣어 미리 적신 후, 진공 장치로 상층액을 제거합니다. 그다음, 미리 적신 웰에 항원이 결합된 비드 50 µL를 첨가하고, 96-웰 필터 플레이트의 1행부터 7행까지 단계별로 희석된 항체 50 µL를 첨가하며, 8행에는 희석 항체의 배경 대조군으로 PBS 및 BSA 혼합액 50 µL를 첨가합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 5회 파이펫팅하여 혼합합니다.그 후 플레이트를 덮고, 항체를 항원이 결합된 비즈와 함께 실온의 암소에서 500 rpm의 마이크로플레이트 쉐이커로 반응시킵니다. 1시간 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 100 µL씩 두 번 세척 버퍼로 웰을 세척합니다. 두 번째 세척 후, 버퍼를 50 µL의 BSA 함유 PBS로 교체합니다.이제 비오틴화된 항-종 특이적 IGG 2차 검출 항체를 PBS 및 BSA가 포함된 용액에서 16 µg/mL로 희석하고, 희석된 2차 항체 50 µL를 각 행에 첨가합니다. 플레이트 쉐이커 위에서 실온의 암소 조건으로 비드와 항체를 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 상층액을 흡입하여 제거하고, 100 µL의 세척 완충액을 두 번 분주하여 비드를 세척합니다.두 번째 세척 후, PBS 및 BSA가 포함된 용액 50 µL에 비드를 다시 부유시키고, streptavidin r-phycoerythrin 리포터를 PBS 및 BSA가 포함된 용액에서 24 µg/mL가 되도록 희석합니다. 각 웰에 리포터 50 µL를 넣고 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 쉐이커 위에서 실온, 암소 상태로 30분 동안 배양한 후, 시연된 바와 같이 세척 버퍼 100 µL로 두 번 헹굽니다.그런 다음 비드를 100 µL의 PBS 및 BSA 혼합액에 재현탁하고 분석기에서 항원이 결합된 비드를 평가합니다. 볼텍싱과 20초간의 초음파 처리를 통해 항원 결합 비드 스톡을 재현탁한 후, 각 고유 비드 세트의 최종 농도가 100 beads/µL가 되도록 PBS 및 BSA 혼합액으로 희석합니다. 이어서 96-웰 딥웰 플레이트에 실온의 타액을 PBS 및 BSA 혼합액으로 1:4 비율로 희석하여 준비합니다.세척 완충액 100 µL로 필터 플레이트를 미리 적신 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 96-웰 필터 플레이트의 95개 웰에 항원 결합 비드 50 µL와 동일한 부피의 희석된 타액을 첨가하여 최종 희석 배수를 1~8배로 맞춥니다. 동시에, 대조군 웰에는 항원 결합 비드 50 µL와 PBS 및 BSA 혼합액 50 µL만을 첨가합니다.마이크로플레이트 셰이커를 이용하여 500 rpm에서 실온의 암소 조건으로 비드를 1시간 동안 배양합니다. 그 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 100 µL의 세척 버퍼로 웰을 2회 세척합니다. 2차 세척 후, 50 µL의 BSA가 포함된 PBS에 비드를 재현탁합니다.2차 항체를 희석하여 각 웰에 50 µL씩 첨가합니다. 멀티 채널 피펫으로 웰의 내용물을 혼합한 후, 플레이트를 쉐이커 위에 올려 암실 상태의 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 100 µL의 세척 버퍼로 웰을 2회 세척하고 50 µL의 신선한 PBS plus BSA에 비드를 재현탁합니다. 이제 리포터를 희석하여 각 웰에 50 µL씩 첨가합니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 충분히 혼합합니다. 쉐이커 위 암실의 상온에서 30분간 방치한 후, 시연된 대로 웰을 2회 세척하고, 100 µL의 PBS 및 BSA 혼합액으로 비드를 재부유시킨 다음 분석기에서 샘플을 평가합니다. 항원이 결합된 비드가 분석의 다이내믹 레인지에 도달할 수 있는지 확인하기 위해, 적절한 결합의 기준은 평균 형광 강도가 18,000 이상인 경우로 정의합니다.C.jejuni 및 T.gondii 분석에서 항원의 대표적인 결합 확인 결과로 입증된 바와 같습니다. 설정된 컷오프 지점을 기준으로, 샘플의 면역 유병률은 T.gondii의 약 2%에서 노로바이러스 유전자 그룹 1.1의 거의 50%까지 나타났으며, 이는 노로바이러스의 면역 유병률이 가장 높고, 그 뒤를 이어 A형 간염 및 H.Pylori 순으로 높았음을 나타냅니다. 샘플의 32%는 분석 대상의 모든 병원체에 대해 면역 음성이었으나, 68%는 하나 이상의 병원체에 대해 면역 양성을 보였습니다.이 절차를 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 광퇴색을 방지하기 위해 비드를 암소에 보관하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 ELISA 및 Western Blotting과 같은 다른 방법을 사용하여 민감도와 특이성에 대한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.항체의 교차 반응성을 확인하는 방법 또한 포함됩니다. 이 기술의 개발 이후, 역학, 노출 과학 및 임상 미생물학 분야의 연구자들은 환경 노출로 인한 인체 위험성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 여러 병원체에 대한 항체를 동시에 측정하는 멀티플렉스 면역 분석법의 개발, 분석 및 결과 해석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.체액 및 sodium azide를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 적절한 개인 보호 장구 착용 및 적절한 시약 폐기 처리와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

developing-salivary-antibody-multiplex-immunoassay-to-measure-human

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Luminex Corporation의 xMAP의 microsphere 기술을 사용, 우리는 다양한 실험실 동물 종의 serosurveillance에 대한 다중 Fluorometric 면역 분석법 (MFIA)를 개발했습니다. MFIA는 항원, 조직 제어 또는 면역 글로불린이 covalently 색으로 구분되는 폴리스티렌 마이크로에 연결되어 정지 microarray입니다. MFIA 테스트 방법뿐만 아니라 다양한 문제 해결 항목은 해결됩니다.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

이 동영상은 인간 타액에서 여러 환경 병원체에 대한 항체를 동시에 검출하는 비드 기반 다중 면역분석 기술을 보여줍니다. 형광 구슬은 인간 타액 샘플의 항체를 사용하여 캡처된 다른 병원체의 항원에 결합되었습니다. 형광 리포터를 사용하여 항체를 라벨링한 후, 타액 내 다양한 병원체 특이적 항체의 존재를 평가하기 위해 유세포 분석을 사용하여 비드를 분석했습니다.

타액에서 병원체 특이적 항체를 식별하기 위한 비드 기반 다중 면역 분석

우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.

고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이

이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

이 종이 알레르기 진단에 미세 화학 카트리지 기반 시스템의 유용성 평가와 특정 혈 청 면역 글로불린 E를 탐지 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

검출 하는 혈 청 알레르기 항 원 특정 면역 글로불린 e (sIgE) 바이오 미세 기술의 응용

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

2리포터 판독값을 제공하는 비드계 멀티플렉스 분석분석을 위한 유량 분석 시스템은 SARS-CoV-2에 대한 중화 IgG 및 IgM 항체를 동시에 측정할 수 있는 멀티플렉스 세론및 항체 중화 분석분석의 개발에 사용되었다.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

이 기사에서는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신 접종에 대한 면역 반응으로 인해 발생하는 두 개의 면역글로불린 이소형(IgA, IgM 또는 IgG)에 대한 항체 역가의 동적 변화를 동시에 모니터링하는 편리한 방법을 설명합니다. 이 '다중 분석 물질 Covid-19 면역 반응 패널'은 '이중 채널'기능을 갖춘 흐름 기반 멀티플렉스 리더를 사용하여 판독되는 코딩된 미소 구체를 기반으로 구축된 세 가지 간접 면역 분석법을 사용합니다.

Covid-19에 대한 다중 분석 물질 면역 비드 분석을 사용한 혈청 전환의 동적 모니터링

유럽과 북미에서 라임 보렐리아증을 유발하는 다양한 보렐리아 종의 여러 항원에 대해 유도된 IgG 및 IgM에 대한 혈청 샘플을 동시에 평가하는 비드 기반 다중 면역분석을 개발하기 위해 3채널 이중 리포터 형광 흐름 분석 시스템을 사용했습니다.

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

다중 형광 면역분석법은 혈청학 검사의 참고 자료가 되고 있습니다. 그러나 이들의 적용은 복잡성과 시간이 많이 걸리는 비드-분석물 결합 공정으로 인해 제한됩니다. 이 보고서는 결과 도출 시간을 크게 단축하면서 표준 방법과 비교할 수 있는 반자동 재현 가능한 다중 마이크로스피어 비드 커플링 프로토콜을 제시합니다.

아르보바이러스에 대한 항체 반응 검출을 위한 다중 혈청학적 분석

배우세요 타액 항체 비드 기반 멀티플렉스 면역분석법을 활용하여 환경 병원체에 대한 인체 노출을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 여러 병원체에 대한 IgG 항체 반응을 동시에 분석하여 노출 과학 연구의 효율성과 정확성을 높입니다.

타액 항체 멀티 플렉스 면역을 개발하는 것은 환경 병원체의 인체 노출을 측정하는

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