항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기
September 18th, 2016
이 항원 주도 대장염 모델에서는 적색 형광 단백질을 발현하는 OT-II CD4+ T 세포를 단핵 식세포(MP)에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 RAG-/- 마우스로 채택하여 전달했습니다. 숙주는 청록색 형광 단백질(CFP)에 융합된 오브알부민 단백질(OVA)을 발현하는 대장균(E.coli)에 도전했습니다.
이 항원 주도 대장염 모델의 전반적인 목표는 항원 특이적 대장염 동안 CX3, CR1 양성 단핵 식세포가 CD4 양성 T 세포와 상호 작용하고 활성화하는지 여부와 이 단핵 식구 의존성 효과기 T 세포 확장이 장 판막 프로프리아 내에서 발생하는지 여부를 결정하는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 결장 얇은 판막의 항원 제시 세포와 effector T 세포 내에서 어떤 유형의 상호 작용이 발생하는지 알 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 면역 세포의 상호 작용과 염증성 장 질환의 병원성을 유발하는 요소를 연구 할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 적색 형광 항원 특이적 나이브 CD4 T 세포를 면역결핍 숙주로 전달하여 단핵 세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 T 세포 전달 대장염 모델을 사용합니다. 세포 전달은 청색 형광 항원 발현 박테리아의 구강 위와 함께 진행됩니다. 숙주의 장 판막(intestinal lamina propria)에서 일어나는 면역 반응은 다양한 질병 발달 단계에서 모니터링될 수 있다.
해부 가위를 사용하여 결장을 세로로 열고 25ml의 PBS가 함유된 페트리 접시에 조직을 씻어 파편과 점액을 제거합니다. 결장을 5-8mm 조각으로 자르고 결과 조각을 칼슘과 마그네슘이 없는 20ml의 신선한 DPBS에 넣고 10밀리몰 HEPES와 5밀리몰 EDTA를 보충합니다. 최대 속도로 30초 동안 샘플이 있는 튜브를 소용돌이칩니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 상피를 제거합니다. 배양이 끝나면 다시 30초 동안 Vortex를 사용합니다. 그런 다음 상피 세포를 포함하는 상등액을 버립니다.
조직 조각을 20ml의 새로운 PBS, HEPES 및 EDTA 완충액이 들어 있는 새 튜브로 옮기고 전후에 와류 단계로 배양을 반복합니다. 세 번째 반복 후에는 모든 상피 세포가 제거되고 상층액이 투명해집니다. PBS에서 조직 조각을 부드럽게 세척하여 잔여 상피 세포를 제거합니다.
조직 조각을 2 x 2mm 조각으로 자르고 소화를 위해 조각을 10mm의 RPI 배지로 옮기고 콜라겐 분해 효소 8 형 밀리리터당 0.5 밀리그램과 DNAse 1 밀리리터 당 10 단위로 보충합니다. 30초 동안 샘플을 소용돌이칩니다. 그런 다음 조직 조각을 섭씨 37도에서 30-35분 동안 흔들면서 배양하고 배양 중에 5분마다 튜브를 와류
로 배양합니다.조직이 소화되면 생성된 슬러리를 70미크론 세포 여과기를 통해 50ml 원추형 튜브로 변형시킵니다. Cell Strainer를 한 번 세척하고 원심분리로 단일 세포 현탁액을 스핀다운합니다. 마지막으로 PBS와 원심분리기에서 세포를 한 번 세척합니다.
그런 다음 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)를 통해 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다. 대장균을 생산하는 시안 형광 단백질 오브알부민 단백질은 e와 대조적으로 시험관 내에서 OT-II 세포에서 인터페론 감마 생산을 활성화합니다.
CFP만 발현하는 대장균. 대장균 PCFP 난자를 공급받은 형질전환 녹색 형광 단백질 발현 마우스의 결장 조직에 대한 생체 외 3D 컨포칼 이미징은 장 상피 세포 근처의 결장 소굴 내에 형광 단백질 발현 박테리아의 존재를 보여주고 숙주 장 식세포와 공동 국소화됩니다.
OT-II 적색 동물에서 CD4 양성 T 세포는 적색 형광 단백질과 V 베타 5점 1의 동시 발현을 특징으로 합니다. OT-II 적색 CD4 양성 CD62 리간드 양성 T 세포를 양으로 이식한 BNT 림프구 결핍 녹색 형광 단백질 발현 형질전환 마우스는 대장균 PCFP 난자에 대한 도전을 받았을 때 빠르게 체중이 감소하고 대장염의 임상 징후가 나타납니다.
세포 이식 후 7일이 경과한 숙주 식세포는 소수에 불과하며, 대장균 PCFP 난자 및 OT-II 적색 양성 세포는 검출되지 않습니다.세포 이식 후 14일 후, e를 샘플링한 숙주 식세포는
검출되지 않습니다.대장균 PCFP 난자는 입양으로 이식된 OT-II 적색 양성 세포와 매우 근접하게 위치합니다. 세포 이식 후 21일이 지나면 많은 수의 숙주 세포가 대장균 PCFP 난자를 샘플링하고 대장 얇은 판 프로프리아 전체에 분산되어 있는 공여자 OT-II 적색 양성 세포가 숙주 장 식세포와 밀접하게 접촉합니다.
이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 장 림프구 염색 및 혈청 사이토카인 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 CD4 T 세포의 활성화 상태에 대한 추가 질문에 답하고 대장염의 중증도를 확인할 수 있습니다. 각 개발 후, 이 기술은 마우스 모델에서 염증성 장 질환으로 이어지는 작은 사건을 탐구하기 위해 면역학 분야의 연구를 위한 길을 열었습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 다운스트림 생체 외 분석을 위해 결장 lamina propria 면역 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 항원 주도 대장염 모델을 이용하여 CX3, CR1 양성 단핵 식세포와 CD4 양성 T 세포 간의 상호작용을 조사합니다. 이 모델은 질병 발달 과정에서 장의 점막하층에서 면역 반응을 모니터링할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 염증성 장 질환
- 세포 상호작용
배경
- T 세포 활성화에서 단핵 식세포의 역할 이해.
- 결장 점막하층의 면역 세포 상호작용 탐색.
- 염증성 장 질환의 병원성 메커니즘 조사.
- 형광 단백질을 이용한 면역 반응 추적.
연구 목적
- 단핵 식세포와 CD4 T 세포 간의 상호작용 확인.
- 장의 점막하층에서 효과자 T 세포의 확장 평가.
- 염증성 장 질환 메커니즘에 대한 통찰 제공.
사용된 방법
- OT-II CD4 + T 세포를 RAG -/- 마우스에 접종.
- 면역 세포 표시를 위한 형광 단백질 사용.
- CFP와 융합된 난백 단백을 발현하는 E.coli의 경구 투여.
- 다양한 질병 단계에서 면역 반응 모니터링.
주요 결과
- 단핵 식세포와 T 세포 간의 상호작용 확인.
- 장의 점막하층에서 효과자 T 세포 확장의 증거.
- 염증성 장 질환의 병원성에 대한 통찰.
- T 세포 접종 대장염 모델의 유용성 시연.
결론
- 이 연구는 대장염 중 면역 반응에서 중요한 상호작용을 강조합니다.
- 연구 결과는 염증성 장 질환 메커니즘 이해에 기여합니다.
- 이 모델은 면역학 연구의 향후 연구를 위한 틀을 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This antigen-driven colitis model enables mechanistic interrogation of antigen-presenting cell and T cell interactions in a defined immunological context, supporting target validation in inflammatory bowel disease research. By providing a reproducible system to study pathogenic immune cell crosstalk in the lamina propria, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. The model aligns with early discovery workflows focused on pathway clarification and biological target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antigen-specific T cell activation by mononuclear phagocytes.
- Operational Value: Provides a defined antigen-driven system to clarify biological pathways involved in colitis pathogenesis.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating effector T cell expansion events in intestinal tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with fluorescently labeled immune cells for downstream ex vivo analysis.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of immune cell interactions and cytokine production in response to defined antigen exposure.
- Reproducibility: Standardized cell isolation and tissue processing support consistent immune event monitoring across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-driven intestinal inflammation to study mechanisms relevant to subsets of inflammatory bowel disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase immune interaction data with preclinical validation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates evaluation of target engagement and mechanistic effects prior to lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery biology by enabling hypothesis testing of antigen-presenting cell functions in T cell activation, positioning it before lead identification stages. It generates quantitative immune event data useful for analytics-driven comparison of experimental conditions in immunology screening. The system is designed as a reusable platform for studying immune-mediated pathways across multiple target validation campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification of antigen-specific immune responses in the gut.
- Screening: Delivers reproducible immune cell isolation and stimulation protocols for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts such as interferon gamma production and immune cell localization for condition comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to preclinical continuity through defined antigen-driven disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for studying APC-T cell interactions applicable to multiple immunology targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antigen challenge and cell transfer protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target-mediated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on lamina propria immune event data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow cytometry, and fluorescent microscopy for immune cell isolation and analysis.
- Dependent on access to transgenic mouse models, fluorescent protein-expressing bacteria, and intestinal tissue processing equipment.
- Necessitates cross-team standardization of cell transfer timing, antigen dosing, and tissue harvest schedules.
- Adaptation considerations include model system compatibility with different antigen-specific T cell receptors and phagocyte markers.
- Practical limitations include the technical complexity of lamina propria cell isolation and the need for multi-day disease development monitoring.
