항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

이 항원 유도성 대장염 모델의 전반적인 목표는 항원 특이적 대장염 과정에서 CX3, CR1 양성 단핵 구상세포가 CD4 양성 T 세포와 상호작용하여 이를 활성화하는지, 그리고 이러한 단핵 구상세포 의존적 작동 T 세포 확장이 장 고유층 내에서 발생하는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 대장 고유층의 항원 제시 세포와 작동 T 세포 사이에서 어떤 유형의 상호작용이 일어나는지와 같은 염증성 장질환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 면역 세포의 상호작용 및 염증성 장질환의 병원성을 유발하는 요인들을 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 적색 형광 항원 특이적 나이브 CD4 T 세포를 단핵구에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 면역 결핍 숙주로 이식하는 T 세포 전이성 결장염 모델을 이용합니다. 세포 전이 후에는 청색 형광 항원 발현 박테리아를 경구 투여합니다. 이를 통해 숙주의 장 고유층에서 발생하는 면역 반응을 질병 진행의 다양한 단계에서 모니터링할 수 있습니다.

해부 가위를 사용하여 결장을 세로로 절개하고, 25 milliliters의 PBS가 담긴 페트리 접시에서 조직을 세척하여 잔해물과 점액을 제거합니다. 결장을 5~8 millimeter 크기로 자른 후, 10 millimolar HEPES와 5 millimolar EDTA가 첨가되고 칼슘과 마그네슘이 없는 20 milliliters의 신선한 DPBS에 조각들을 넣습니다. 샘플이 든 튜브를 최대 속도로 30초 동안 볼텍싱합니다.

그 다음, 상피세포를 제거하기 위해 37 °C에서 10분 동안 부드럽게 흔들어주며 배양합니다. 배양이 끝나면 다시 30초 동안 Vortex 합니다. 그런 다음, 상피세포가 포함된 상층액을 제거합니다.

조직 조각들을 20 milliliters의 신선한 PBS, HEPES 및 EDTA 완충액이 들어 있는 새 튜브로 옮기고, 전후로 볼텍싱 단계를 포함하여 배양 과정을 반복합니다. 세 번째 반복 후에는 모든 상피 세포가 제거되어 상층액이 투명해집니다. 잔류 상피 세포를 제거하기 위해 PBS로 조직 조각들을 가볍게 세척합니다.

조직 조각을 2x2 mm 크기로 자른 후, 0.5 mg/mL의 collagenase type VIII과 10 U/mL의 DNAse I이 첨가된 10 mL의 RPI 배지로 옮겨 소화를 진행합니다. 샘플을 30초 동안 Vortex 합니다. 그 다음, 조직 조각을 37 °C에서 30~35분 동안 흔들어주며 배양하고, 배양하는 동안 5분마다 튜브를 Vortex 합니다.

조직의 소화가 완료되면, 생성된 슬러리를 70 micron 셀 스트레이너를 통해 50 milliliter 원심분리관에 거릅니다. 셀 스트레이너를 한 번 세척하고, 원심분리를 통해 단일 세포 현탁액을 침전시킵니다. 마지막으로, 세포를 PBS로 한 번 세척한 후 원심분리합니다.

그 후, trypan blue 배제법을 통해 생존 세포 수를 측정합니다. Cyan fluorescent protein ovalbumin 단백질을 생성하는 e. coli는 e. coli와 대조적으로 인 비트로(in vitro)에서 OT-II 세포의 interferon gamma 생성을 활성화합니다.

CFP만 발현하는 coli입니다. e. coli PCFP ova를 섭취한 형광 녹색 단백질 발현 형질전환 생쥐의 결장 조직을 ex vivo 3D 공초점 영상으로 촬영한 결과, 장 상피 세포 근처의 결장 은와 내에 형광 단백질 발현 박테리아가 존재하며 숙주의 장 내 포식세포와 공국소화되어 있음을 보여줍니다.

OT-II red 동물에서 CD4 양성 T 세포는 적색 형광 단백질과 V beta 5.1을 공동 발현하는 것이 특징입니다. e. coli PCFP ova로 자극했을 때, OT-II red CD4 양성 CD62 ligand 양성 T 세포를 입양 이식한 BNT 림프구 결핍 녹색 형광 단백질 발현 형질전환 마우스는 체중이 빠르게 감소하며 결장염의 임상 증상을 나타냅니다.

세포 전이 7일 후, 소수의 숙주 식세포만이 e. coli PCFP ova를 샘플링했으며 OT-II red 양성 세포는 검출되지 않았습니다. 세포 전이 14일 후, e.를 샘플링한 숙주 식세포는

coli PCFP ova는 입양 전이된 OT-II red 양성 세포와 매우 인접하게 위치해 있습니다. 세포 전이 후 21일이 되면 다수의 숙주 세포가 e. coli PCFP ova를 섭취하며, 결장 고유층 전체에 분산되어 있는 공여자 OT-II red 양성 세포들이 숙주 장 phagocyte들과 밀접하게 접촉하고 있는 것을 확인할 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에 장 림프구 염색 및 혈청 사이토카인 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 CD4 T 세포의 활성화 상태에 관한 추가적인 의문에 답하고 결장염의 중증도를 확인할 수 있습니다. 각 단계의 발전을 통해, 이 기술은 마우스 모델에서 염증성 장질환을 유발하는 미세한 사건들을 탐구하기 위한 면역학 분야 연구의 토대를 마련합니다.

이 영상을 시청한 후에는 후속 ex vivo 분석을 위해 결장 고유층 면역 세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.