공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

이 절차의 전반적인 목표는 다중 뉴클레오티드 다형성을 시각적으로 검출하기 위한 간단한 방법과 공압 액적 조작 플랫폼을 결합하는 것입니다. DNA 검출 플랫폼은 개방된 표면에 있으며 생화학 연구자가 쉽게 사용할 수 있습니다. 우리는 유전적 돌연변이와 유전적 질병을 반복적으로 검출할 수 있는 간단한 도구를 조사했습니다.

이는 유전적 변이가 어떻게 질병으로 이어지는지를 이해하는 데 도움이 되는 더 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 우리는 두 가지 새롭고 간단한 방법을 결합했습니다. 다중 뉴클레오티드 다형성은 추가 장비 없이 육안으로 공압 액적 조작 플랫폼에서 검출할 수 있습니다.

다중 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 방법은 우리 그룹의 포스트 닥터인 Tzu-Ming Wang에 의해 시연될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 프로브 DNA의 100마이크로몰 용액을 준비합니다. 그런 다음 프로브 DNA를 금 나노 입자의 밀리리터 용액당 1 OD에 추가합니다.

SDS의 최종 농도를 0.01%로, PBS의 최종 농도를 0.01 어금니로 가져옵니다. 용액을 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 2 몰 염화나트륨과 0.01 몰 PBS의 용액을 첨가하여 염화나트륨의 농도를 0.05 몰로 증가시킵니다.

SDS 농도를 0.01%로 유지하고 용액을 20분 동안 배양합니다. 최종 1몰 농도에 도달할 때까지 20분 간격으로 0.1몰씩 염화나트륨 농도를 높입니다. 용액을 섭씨 23도에서 회전체에서 밤새 배양합니다.

DNA 표본 및 금 nanoparticles가 접합된 후에, 7, 30 초 동안 000 시간 g에 해결책을 원심 분리하십시오. 상층액을 제거합니다. 다음으로, 펠릿을 탈이온수에 재현탁하여 25나노몰 금 나노입자 프로브 용액을 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표적 DNA 샘플을 준비합니다. 염화나트륨과 함께 각 DNA 샘플에 6마이크로리터의 금 나노 입자 프로브 용액을 추가합니다. 와류 믹서를 사용하여 각 샘플 용액을 섭씨 23도에서 5분 동안 흔듭니다.

그런 다음 각 DNA 샘플 용액에 6마이크로리터의 400밀리몰 하이드록실 아민과 6마이크로리터의 25.4밀리몰 클로로오우르산을 추가합니다. 다음 시간 동안 꾸준한 착색 변화가 발생할 것이므로 이 샘플을 따로 보관하십시오. nanoparticle의 크기, 모양 의존하는 광학적인 재산, 전형적인 표본 DNA 파편에 있는 mismatch의 수는 눈으로 구별될 수 있습니다.

액적 조작 플랫폼 제작을 시작하려면 0.5mm 드릴 비트가 장착된 컴퓨터 수치 제어 기계를 사용하여 미세 구조가 있는 PMMA 기반 마스터몰드를 생산합니다. 드릴의 경우 초당 7mm의 이송 속도와 26, 000rpm의 회전 속도를 사용하고 드릴링 후 금형을 검사합니다. 송풍기와 탈이온수를 사용하여 마스터몰드 표면을 청소하고 PMMA 스크랩을 제거합니다.

그 후, PDMS 염기와 경화제의 10 대 1 혼합물을 준비합니다. 모든 기포가 제거될 때까지 건조기에서 혼합물의 가스를 제거하십시오. 그런 다음 PDMS 혼합물을 마스터몰드에 붓습니다.

섭씨 60도에서 3시간 동안 굽면 공기 챔버와 공기 채널에서 역 미세 구조를 얻을 수 있습니다. 베이킹이 완료되면 마스터몰드에서 PDMS 층을 제거하고 공기 흡입구에 구멍을 뚫습니다. 산소 플라즈마 처리 시스템을 사용하여 PDMS 멤브레인과 PDMS 층을 청소합니다.

처리 후 PDMS 멤브레인과 PDMS 층을 결합한 다음 이 접합 구조에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 섭씨 90도에서 10분 동안 핫 플레이트를 사용하여 PDMS와 유리 기판을 함께 접착합니다. 레이어가 함께 접착되면 복합 플레이트를 레이저 절단기 PDMS 멤브레인 면이 위로 향하게 놓습니다.

dwg 파일을 가져와서 초소수성 영역을 정의하면 PDMS 멤브레인에 직접 새겨집니다. 새로 새겨진 초소수성 표면을 탈이온수로 청소합니다. 이것은 탄화된 잔류물을 씻어낼 것입니다.

표면을 청소한 후 솔레노이드 밸브를 통해 공기 흡입구와 진공 펌프를 연결합니다. 그런 다음 솔레노이드 밸브를 컴퓨터에 연결하여 디지털 IO USB 모듈로 제어합니다. 공압 액적 조작 플랫폼이 설정되면 초소수성 영역에 10마이크로리터의 0.5마이크로몰 표적 DNA를 추가합니다.

다음으로, 대상 DNA 방울 옆에 갓 혼성화된 25나노몰 금 나노입자 프로브 용액 10마이크로리터를 추가합니다. 간단한 프로그램을 사용하여 솔레노이드 밸브를 통해 플랫폼으로의 공기 흡입을 제어합니다. 압력을 음의 80킬로파스칼로 설정하고 구동 주파수를 5헤르츠로 설정합니다.

액적의 진동 경로를 따라 흡입을 제공하여 액적이 충돌하고 합쳐지도록 합니다. 다음으로, 흡입을 조작하여 합쳐진 액적을 혼합하여 샘플을 3분 동안 굴립니다. 2마이크로리터의 400 milimolar hydroxylamine과 2 μl의 25.4 milimolar chloroauric acid를 공압 액적 조작 플랫폼의 초소수성 영역에 추가합니다.

물방울이 충돌하고 합쳐지도록 흡입을 조작하십시오. 그런 다음 병합된 물방울을 1분 동안 굴려 혼합합니다. 최종 물방울의 색을 육안으로 관찰합니다.

이 연구에서는 금 나노 입자 프로브의 DNA 혼성화 매개 성장을 사용하여 다중 뉴클레오티드 다형성을 비색으로 검출합니다. 여기서 DNA 샘플은 프로브 DNA에 대한 친화력이 다르기 때문에 금 나노 입자의 성장에 차이가 발생하여 색상 변화로 보입니다. 3개의 염기쌍 불일치 DNA 샘플은 완전 보완 DNA보다 혼성화가 적으며, 이는 특히 더 높은 농도에서 색상에서 눈에 띄는 차이로 볼 수 있습니다.

6 개의 염기가 일치하지 않는 DNA는 프로브에 대한 혼성화 친화도가 약하여 금 나노 입자의 성장 크기가 작았습니다. 이 비색 분석은 DNA 불일치 결과를 육안으로 쉽게 관찰할 수 있기 때문에 공압 흡입 플랫폼을 통해 샘플을 조작할 때 반복 가능한 것으로 나타났습니다. 일단 마스터되면 샘플과 시약을 추가한 후 결과를 얻을 때까지 전체 절차가 5분 미만이 소요되며, 이는 기존 방법보다 훨씬 빠릅니다.

각 작업의 총계는 10마이크로리터에 불과하며, 이는 대형 시스템에 필요한 것보다 훨씬 적습니다. 이 절차에 따라 DNA 단편 공간의 염기서열 변이가 특정 질병의 원인이 되는 것으로 확인되면 됩니다. 특별히 설계된 제품은 샘플 DNA의 여러 불일치를 획득하는 데 사용할 수 있습니다.

공압 액적 조작 플랫폼은 광학 가중치, 염료 전기 형광, 전기 가중치 및 shoomoo의 모세관 작동과 같은 다른 방법보다 생체 적합성이 더 높습니다. 제안된 다뉴클레오티드 다형성 검출 방법은 공압 액적 조작 플랫폼에서 수행되었으며, 이는 샘플과 시약을 피펫으로 직접 적재하고 수집할 수 있음을 의미합니다. 개발 후 이 기술은 DNA 스크리닝 및 기타 화학적 및 생물학적 응용 분야에 대한 높은 잠재력을 가지고 있습니다.