Name: 공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 공기 방울 조작 플랫폼에서 시각적 색도계법으로 다중 염기 다형성을 검출하는 간단한 방법을. 복잡한 장비 없이 유전자 변이를 신속하게 탐지하여 질병 연구에 활용할 수 있습니다.

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대만 과학기술부는 MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3 계약에 따라 이 연구에 대한 재정적 지원을 제공했습니다.

MNP을 감지하는 방법으로서 참고 :이 섹션은 금 나노 입자의 하이브리드 매개 성장에 따라 MNP를 감지하는 절차를 설명합니다. <ol><li> 프로브 DNA 농도 100 μM에서 (5&#39;-티올 GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 프로브 DNA 변성 AuNP (AuNP 프로브) 입자를 준비합니다. (21) 참고 : 여기에 사용되는 볼륨이 프로브 DNA 변성 AuNP (AuNP 프로브) 입자의 요구 사항에 따라 달라집니다. 이 실험의 수를 실시 할에 따라서 달라집니다. 우리는 일반적으로 스페어로 초과 AuNP 프로브 입자를 준비합니다. 이 단계에 사용 된 볼륨 조절하고 유연하다. <ol><li> 농도 1 OD / ㎖에서 금 나노 입자 용액 (13 내지 17 ㎚)에 (100 μM, 단계 1.1에서 준비를) 프로브 DNA를 추가합니다. </li><li> 도데 실 황산나트륨의 최종 농도를 가지고 NAC (12 H 25 SO 4, SDS) 및 인산염 완충액 (PBS) 0.01 % 및 0.01 M, respectivel 행와이. </li><li> 20 분 후, 염화나트륨 (2 M)과 PBS (0.01 M) 0.01 % SDS로 유지하면서 용액에 0.05 M의 염화나트륨의 농도를 가지고, 20 분 동안 배양한다. </li><li> 1 M 20 분 간격의 최종 농도 0.1 M의 단위 염화나트륨 농도를 증가시킨다. </li><li> 23 ° C에서 와류 믹서에 진탕 밤새 품어. 진동 속도만큼 DNA 샘플과 AuNP 프로브 혼성 해짐에 따라 실험에 영향을주지 않습니다. </li><li> 30 초 동안 7,000 XG에서 금 나노 입자를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li></ol></li><li> 25 nM의 (AuNP 프로브 용액)의 농도에서 탈 이온수 (DI 수)로 AuNP 프로브 입자를 추가한다. </li><li> 타겟 DNA 샘플을 준비한다 ( &#39;3 개의 염기쌍 미스 매치 : 5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC -3- 완전히 상보 여섯 염기쌍 불일치를 : 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;)의 농도로0.06, 0.11, 0.17, 각각 0.20, 0.30, 0.50 μM. </li><li> 염화나트륨 (14 μM)와 DNA 샘플 (350 μL)에 AuNP 프로브 솔루션 (6 μL, 25 nm의)를 추가합니다. </li><li> DNA 혼성화 5 분 동안 23 ℃에서 와동 혼합기 DNA 샘플과 AuNP 프로브 혼합물을 흔들어. </li><li> AuNP 성장을위한 솔루션 (DNA 샘플과 AuNP 프로브의 혼합물)에 NH 2 OH (6 μL, 400 밀리미터) 및 HAuCl 4 (6 μL, 25.4 mm)를 추가합니다. AuNP의 성장은 종료 약 30 초 소요됩니다. 착색의 꾸준한 변화 이상의 1 시간을 유지합니다. 주의 : HAuCl 4 피부에 접촉했을 때 심각한 독성 효과를 얻을 수 있습니다. 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 장갑을 착용하고 HAuCl 4 사용할 때 연기 찬장을 사용하십시오. </li></ol> 공기 방울 조작 플랫폼 2. 제작 참고 : P 다음 PDMS 기반 방울 조작 플랫폼은 두 개의 구성 요소를 포함수퍼 소수성 표면과 공기 채널 층 (5 ㎜)와 DMS 막 (100 μm의). 멤스 공정없이 일반적인 가공 공정의 제작이 미세 유체 성분의 조형하는 금형 PDMS 주조 및 복제하기 위해 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로 포함 디바이스, 레이저 미세 가공을 제조하는데 사용 하였다 수퍼 소수성 표면 (도 3 참조). <ol><li> 마이크로 구조체와 PMMA 계 마스터 주형 (도 3 참조)를 생성하기 위해 드릴 비트 (0.5 mm)를 구비 한 CNC 기계를 사용한다. 드릴 비트 7mm / sec의 이송 속도와 회전을 26000 rpm의 속도를 사용한다. PMMA를 스크랩을 제거하고 상기 마스터 주형의 표면을 세정하기 위해 송풍기 및 DI 물을 사용한다. </li><li> PDMS의 기반과 비 10 경화제의 혼합물을 준비한다 : 1. 모든 기포가 제거되고 30 분 동안 또는까지 건조기 내부의 혼합물을 탈기. </li><li> 일에 PDMS를 부어즉 마스터 몰드와 공기 챔버의 역 마이크로 구조 (PDMS 막)와 공기 채널 (PDMS 층)을 얻기 위해 오븐에서 60 ℃에서 3 시간에 대한 PDMS 굽는다. </li><li> (손으로) 마스터 금형에서 PDMS 층을 제거합니다. 공기 흡입 입구의 PDMS 층에 구멍을 펀치. </li><li> 산소 플라즈마 처리 시스템의 챔버로 PDMS 막의 상기 PDMS 층 및 유리 기판을 넣어. 산소 플라즈마 처리 후, 10 분 동안 핫 플레이트 (90 ° C)에서 함께 PDMS 막의 상기 PDMS 층과 유리 기판을 접합. </li><li> 레이저 절삭 기계 (PDMS 막면을 위로)에 복합 칩을 넣어. 초 소수성 영역 (15mm × 12mm)를 정의 할 .DWG 파일을 가져옵니다. 그림 3을 참조하십시오. 직접 PDMS 막 (전력 12 W, 스캔 속도 106.68 mm / 초)에 초 소수성 영역을 생성하기 위해 CO 2 - 레이저 기계와 PDMS 멤브레인을 새기다. </li><li> 씻어 DI 물과 초 소수성 표면을 청소표면에서 떨어져 탄화 잔기. </li><li> 솔레노이드 밸브를 통해 공기 흡입구 및 진공 펌프에 연결 (도 4 참조). 디지털 I / O의 USB 모듈과 컴퓨터와 제어 솔레노이드 밸브를 연결합니다. </li></ol> 공압식 플랫폼에 MNP의 검출 3. 운영 주 :이 부분은 공기 방울 조작 플랫폼 비색 및 급속 MNP를 식별하는 동작을 설명한다 (도 5 참조). 모든 단계가 23 ° C (주위 온도)에서 장소와 상대 습도 85 %를 가져 가라. <ol><li> 공기 방울 조작 플랫폼의 초 소수성 영역 (10 μL, 0.5 μM)을 대상 DNA 샘플 방울을 배치합니다. </li><li> 공기 방울 조작 플랫폼의 초 소수성 영역의 AuNP 프로브 방울을 (10 μL, 25 nm의) 배치합니다. </li><li> 솔레노이드 밸브 및 SI로 PDMS 막의 편향을 일으키는 공기 흡입을 제어mple 프로그램 (예를 들어, LabVIEW는). 물방울이 서로 충돌하여 유착되도록 PDMS 막에 (각각 표적 DNA와 프로브 AuNP 함유) 물방울의 이동 경로를 따라 각 공기 실의 공기 흡입을 제공한다. -80 kPa의 (게이지 압력)의 진공 펌프의 작동 압력을 사용합니다. <ol><li> 또한, 수동으로 한 방울 완전히 혼합으로 공기 흡입을 제어 할 수 있습니다. 손으로 연결하거나 시험의 초기 단계에서 튜브 진공 펌프 및 공기 챔버의 입구를 분리합니다. </li></ol></li><li> 솔레노이드 밸브의 제어 시스템을 사용하여 3 분 동안 혼합 효율을 향상시키기 위해 앞뒤로 합체 액적 롤의 공기 흡입을 제어한다. 타겟 DNA와 AuNP 프로브는 잘 혼합하여 3 분 이내에 혼성화된다. 각각의 구동 주파수 및 5 Hz에서 -80 kPa의 (게이지 압력)의 작동 압력을 사용한다. </li><li> NH 2 OH (2 μL, 400 mM)을하고 HAuCl를 함유하는 액 적을 배치공기 방울 조작 플랫폼의 소수성 영역 4 (2 μL, 25.4 mm)이다. </li><li> 방울이 서로 병합 충돌 있도록 공기 흡입구 (-80 kPa의 게이지 압력)을 제어한다. 이어서 전후로 합체 액적 롤 1 분간 혼합 효율을 향상시킬 수 있도록 상기 공기 흡입관 (5 Hz에서 -80 kPa의 게이지 압력)을 제어한다. </li><li> 측정 및 육안 합체 방울의 색을 기록한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서는 간단한 비색 방법은 MNP는 0.11-0.50 μM에서의 microcentrifuge 튜브 범위의 농도에서 구현 될 수 감지. 또한, 제안 된 MNP 검출 방법은 DNA 스크리닝 및 기타 생물 의학 응용에 대한 높은 가능성을 가지고 공기 방울 조작 플랫폼에서 수행된다. 실제로, 샘플 DNA 농도의 검출 범위는 운영 플랫폼의 혼합 효율에 의존한다. 합체 물방울이 완전히 혼합되도록하려면,이 프로토콜의 중요한 단계는 합체 방울의 크기에 따라 공기 흡입 (압력 및 주파수)의 컨트롤입니다. 완전히 상보적인 DNA 샘플과 일치 샘플 DNA 간의 혼성화 친화력의 차이가 긴 DNA 서열 단편에 대해 육안으로 구별하는 것은 곤란하다. 이러한 검출 기술의 한계 때문에, 샘플 DNA 단편의 길이이다. 긴 DN과 샘플시퀀스 크기 또는 성장 AuNP의 형태는 다양 불일치를 포함하는 다양한 DNA 샘플의 것과 유사하다. 프로브에 DNA 샘플의 불일치는이 프로토콜의 중간 부분에 나타납니다. 동일한 길이와 샘플 DNA의 homomeric...

DNA 서열에서 단일 염기쌍 차이 인 단일 염기 다형성 (SNP)는 가장 흔한 유전 적 변이의 하나이다. 현재 연구의 SNP는 질병 위험, 약제의 효능 및 유전자 기능에 영향을주지하여 개인의 부작용과 연관되어 있음을보고한다. 1, 최근의 연구는 2 차원 또는 다중 점 돌연변이 (멀티 염기 다형성) 특정 질환 및 개별 원인 밝혀 질병의 효과의 차이. 3,4- 염기 다형성의 검출은 질환의 사전 선별 때문에 필수적이다. 서열 - 특이 적 올리고 뉴클레오티드의 신속한 검출을위한 간단하고 효율적인 방법은 매우 지난 20 년에 개발되었다. 등 프로브 고정화, 형광 라벨, 겔 전기 영동을 포함한 절차를 일반적으로 DNA 돌연변이를 식별 포함하는 1,5 현재 접근, 6,7 그러나 이러한 방법은 일반적으로 expen 긴 분석 과정을 필요로시브 장비, 잘 훈련 된 기술자, 샘플 및 시약의 중요한 소비. 체적 고유의 물리 화학적 성질에 대한 표면적의 비율이 큰 나노 입자와 특정 바이오 마커에 대한 고감도 저렴 검출 플랫폼으로서 적합한 물질이다. 금 나노 입자 (AuNP)는 널리 올리고 뉴클레오티드 프로브를 수정할 때문에 큰 능력의 DNA의 검출을 위해 사용된다. 8-10 SNP 검출 기술도 AuNP을 사용하여 개발 하였다. 11-13 본 연구에서 우리는을 검출하는 신규 한 측색 방법을 채용 다 염기 다형성 (MNP) AuNP 프로브 DNA 혼성화 - 매개 성장으로. (14)이 간단하고 빠른 프로빙 방법이 이론에 기초하는 접합 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 또는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 가변 길이 AuNP의 성장의 크기 및 형상에 영향을 AuNP (도 1 참조). 15 DNA 검출이 방법을시약의 작은 소비, 작은 분석 기간 (몇 분), 임상 진단 및 국내 의료 검진에 대한 전향 적으로 적용 열 제어없이 간단한 절차를 제공합니다. DNA의 감도, 검출 한계 및 특이성을 개선하기 위하여 실험 프로토콜을 대규모 장치의 적은 부분을 필요 전통적인 실험 프로토콜 진화 16 그러한 마이크로 유체 시스템 및 단순화 된 상기 DNA 서열을 검출하는 방법에는 여러 미세 유체 시스템은 개발되어왔다 바이오 센서. 마이크로 유체 시스템의 DNA 검출 방법은 여전히 이종 SNP를 식별하는 하나의 판독을 위해, 그러나, 신호 증폭 및 형광 판독기 같은 PCR (중합 효소 연쇄 반응)과 같은 후속 처리의 계기 장치를 필요로한다. (17, 18)를 간단한 개발 이후의 처리없이 플랫폼 직접 멀티 염기 다형성의 결과를 판독매우 바람직하다. 비교 잘 사용에, 종래의 미세 유체 시스템을 폐쇄, 미세 유체 장치가 유망 같은 명확한 광경, 샘플에 액세스 할 수있는 쉬운 방법, 직접 환경 접근성과 더 용이하게 형성 캐비테이션 또는 계면 방해의 여러 장점을 제공하는 오픈 표면 채널. 19 우리의 이전 작품은이있는,이 플랫폼, 방울 동시에 수송과 흡입력을 이용하여 구동 에너지로부터 간섭을받지 않고 조작 할 수 있습니다에 오픈 표면의 물방울 조작 (그림 2 참조). (20)에 대한 간단한 공압 플랫폼을 도입 생물 및 화학 분야에서 큰 잠재력. 이 공기 플랫폼 따라서 AuNP 프로브 DNA 혼성화 매개 성장의 개념을 사용하여 비색 방법과 조합 MNP 감지 DNA 샘플의 조작을 수행하는 데에 이용 하였다. 이 논문에 제시된 프로토콜 설명오픈 표면에 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성의 단순한 시각적 감지. 이 작품은 멀티 염기 다형성 (polymorphism)이 육안으로 감지 할 것을 확인; 제안 된 공기 플랫폼은 생물학적, 화학적 응용 프로그램에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>다우 코닝</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 조각사</td><td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td>레이저 절단기</td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 처리 시스템</td><td>펨토 사이언스 주식회사 한국</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>솔레노이드 밸브</td><td></td><td></td><td>가정용</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm AuNP 솔루션</td><td>TAN Bead Inc., 대만</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (5'-말단 라벨링 티올 포함)</td><td>MDBio, Inc., 대만</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>UniRegion&nbsp; 생명 공학,. 대만</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>JT 베이커</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>하이드 록실 아민 용액 (NH 2 OH)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>클로로 오우산 (HAuCl 4)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>G4022</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>와류 믹서</td><td>Digisystem 실험실 기기 Inc.</td><td>VM-2000</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

다 염기 다형성 (MNP)를 검출하는 간단하고 시각적있어서 열린면에 공기 방울 조작 플랫폼에서 행 하였다. 비색 DNA 검출이 접근 방식은 금 나노 입자 프로브 (AuNP 프로브)의 하이브리드 매개 성장을 기반으로했다. AuNP의 성장의 크기와 구성은, 프로브와 하이브리드 DNA 샘플의 수에 의해 지배된다. 나노 입자의 형상 및 크기 - 특정 의존의 광학 특성에 기초하여, 프로브에 샘플 DNA 절편의 미스 매칭 수를 판별 할 수있다. 시험은 각각 시약 및 샘플 DNA를 함유하는 물방울을 통해 수행하고,가요 성 PDMS 계 소수성 멤브레인의 제어 공기 흡입 반송 및 공압 플랫폼에서 혼합 하였다. 물방울은 어떤 측면 EFF와 높은 생체 적합성 인 제안 공압 플랫폼에 오픈 표면에 동시에 정확하게 전달 될 수있다액적 내부 DNA 샘플 요법. 두 방식들을 제안 결합 다중 염기 다형성 공기 방울 조작 플랫폼 시야에서 검출 될 수있다; 추가 장비가 필요하지 않습니다. 최종 결과에 플랫폼에 방울을 설치에서 절차는 기존의 방법보다 훨씬 적은보다 5 분 걸립니다. 또한,이 결합 MNP 검출 방식은 매크로 시스템에 비해 현저하게 작다 각 연산에 ​​10 μL의 샘플 용적이 필요하다.

본 연구에서는 세 개의 DNA 샘플을 AuNP 프로브의 DNA 혼성화 매개 성장을 통해 검출하는 간단하고 신규 한 방법을 사용하여 시험 하였다. 프로브 DNA와 삼가지 DNA 샘플의 순서는, 특히, cDNA를 프로토콜의 1 단계에 나와있는, TMDNA (세 염기쌍 일치하지 않는 DNA) 및 SixMDNA (여섯 기본 쌍 일치하지 않는 DNA)을 (완전히 보완 DNA를 조사하기 위해). 여기서 테스트 DNA 샘플을 프로브에 불일치가 DNA 샘플의 중간 세그먼트 모두이다.도 6은 다양한 농도의 DNA 시료에 대한 성장 AuNP 용액의 색을 나타낸다. 완벽하게 일치하는 DNA (CDNA)의 경우, 솔루션의 색상은 DNA 농도 증가와 함께 투명 한 후 인디고에 분홍색에서 다양합니다. TMDNA 들어, 용액의 색이 진한 보라색 핑크로 진행하고 인디고 및 SixMDNA 들면 색 DNA 농도가 증가함에 따라 짙은 분홍색으...

이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다.

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

본 절차의 전반적인 목표는 다중 뉴클레오타이드 다형성을 시각적으로 검출하는 간단한 방법과 공압식 액적 조작 플랫폼을 결합하는 것입니다. DNA 검출 플랫폼은 개방형 표면에 위치하여 생화학 연구자들이 사용하기 매우 간편합니다. 본 연구에서는 유전자 돌연변이 및 유전 질환을 반복적으로 검출할 수 있는 간단한 도구를 조사하였습니다.이는 유전적 변이가 어떻게 질병으로 이어지는지를 이해하는 데 더 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 당사는 두 가지의 새롭고 간단한 방법을 결합하였습니다. 다중 뉴클레오타이드 다형성은 공압식 액적 조작 플랫폼에서 별도의 추가 기기 없이 육안으로 검출될 수 있습니다.다중 뉴클레오타이드 다형성을 검출하는 방법은 저희 그룹의 박사후 연구원인 Tzu-Ming Wang이 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 100 µM 농도의 프로브 DNA 용액을 준비하십시오. 그 다음, 1 OD/mL 농도의 금 나노입자 용액에 프로브 DNA를 첨가합니다.SDS의 최종 농도를 0.01%로, PBS의 최종 농도를 0.01 M로 맞춥니다. 용액을 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 2 M 염화나트륨과 0.01 M PBS 용액을 첨가하여 염화나트륨의 농도를 0.05 M로 높입니다.SDS 농도를 0.01%로 유지하고 용액을 20분 동안 더 배양합니다. 최종 농도가 1 M이 될 때까지 20분 간격으로 염화나트륨 농도를 0.1 M씩 증가시킵니다. 로테이터를 사용하여 23 °C에서 용액을 하룻밤 동안 배양합니다.DNA 샘플과 금 나노입자가 접합되면, 용액을 7,000 ×g에서 30초 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거합니다. 다음으로, 펠렛을 탈이온수에 다시 현탁하여 25 nM 금 나노입자 프로브 용액을 준비합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표적 DNA 시료를 준비합니다. 염화나트륨이 포함된 각 DNA 시료에 금 나노입자 프로브 용액 6 µL를 첨가합니다. 볼텍스 믹서를 사용하여 각 시료 용액을 23 °C에서 5분 동안 흔들어 섞어줍니다.그 다음, 각 DNA 시료 용액에 400 millimolar 하이드록실아민 6 µL와 25.4 millimolar 클로로금산 6 µL를 첨가합니다. 이후 한 시간 동안 색상이 서서히 변화하므로 이 시료들을 그대로 둡니다. 나노입자의 크기와 형태에 따른 광학적 특성으로 인해, 시료 DNA 단편 내의 전형적인 미스매치 수를 육안으로 식별할 수 있습니다.액적 조작 플랫폼 제작을 시작하려면, 0.5 millimeter 드릴 비트가 장착된 컴퓨터 수치 제어(CNC) 기계를 사용하여 미세 구조가 있는 PMMA 기반 마스터 몰드를 제작하십시오. 드릴링 시 이송 속도는 7 millimeter/s, 회전 속도는 26,000 rpm으로 설정하고, 드릴링 후 몰드를 검사하십시오. 에어 블로워와 탈이온수를 사용하여 마스터 몰드의 표면을 세척하고 PMMA 잔해물을 제거하십시오.그 다음, PDMS 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 준비합니다. 모든 기포가 제거될 때까지 데시케이터에서 혼합물을 탈기합니다. 그런 다음, PDMS 혼합물을 마스터 몰드에 붓습니다.공기실과 공기 채널 내에 역마이크로구조를 형성하기 위해 60°C에서 3시간 동안 굽습니다. 베이킹이 완료되면 마스터몰드에서 PDMS 층을 제거하고, 공기 흡입구를 위한 구멍을 뚫습니다. 산소 플라즈마 처리 시스템을 사용하여 PDMS 막과 PDMS 층을 세척합니다.처리 후 PDMS 막과 PDMS 층을 접합하고, 이 결합된 구조에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 90 °C의 핫플레이트에서 10분 동안 PDMS와 유리 기판을 함께 접합합니다. 층들이 서로 접합되면, 복합 플레이트를 PDMS 막 쪽이 위로 오도록 레이저 커팅기에 넣습니다.초소수성 영역을 정의하기 위해 dwg 파일을 가져오며, 이는 PDMS 막에 직접 각인된다는 점에 유의하십시오. 새로 각인된 초소수성 표면을 탈이온수로 세척하십시오. 이렇게 하면 탄화된 잔류물을 씻어낼 수 있습니다.표면 세척 후, 솔레노이드 밸브를 통해 공기 흡입구와 진공 펌프를 연결합니다. 그 다음, 솔레노이드 밸브를 컴퓨터에 연결하여 디지털 IO USB 모듈로 제어합니다. 공압 액적 조작 플랫폼 설정이 완료되면, 초소수성 영역에 0.5 µM 표적 DNA 10 µL를 첨가합니다.다음으로, 표적 DNA 방울 옆에 갓 하이브리드화시킨 25 nanomolar 금 나노입자 프로브 용액 10 µL를 추가합니다. 솔레노이드 밸브를 통해 플랫폼으로 공기를 흡입하도록 제어하는 간단한 프로그램을 사용하십시오. 압력은 -80 kPa로, 구동 주파수는 5 Hz로 설정합니다.액적의 진동 경로를 따라 흡입력을 가하여 액적들이 충돌하고 융합되도록 합니다. 다음으로, 흡입력을 조절하여 샘플을 3분 동안 회전시켜 융합된 액적을 혼합합니다. 공압 액적 조작 플랫폼의 초소수성 영역에 400 mM 하이드록실아민 2 µL와 25.4 mM 클로로금산 2 µL를 첨가합니다.흡입력을 조절하여 액적들이 충돌하고 병합되도록 합니다. 그다음, 병합된 액적을 1분 동안 굴려 혼합합니다. 최종 액적의 색상을 육안으로 관찰합니다.본 연구에서는 금 나노입자 프로브의 DNA 하이브리다이제이션 매개 성장을 이용하여 다중 뉴클레오타이드 다형성을 비색법으로 검출합니다. 여기서 DNA 시료는 프로브 DNA에 대해 서로 다른 친화력을 가지며, 이는 금 나노입자의 성장 차이를 유발하여 색상 변화로 나타납니다. 3개 염기쌍이 불일치하는 DNA 시료는 완전히 상보적인 DNA보다 하이브리다이제이션 정도가 낮으며, 이는 특히 고농도에서 뚜렷한 색상 차이로 확인할 수 있습니다.6개 염기가 불일치하는 DNA는 프로브와 약한 하이브리드화 친화력을 가지며, 이에 따라 금 나노입자의 성장 크기가 작았습니다. 이러한 비색 분석은 공압 흡입 플랫폼을 통해 샘플을 처리할 때 재현성이 있는 것으로 나타났으며, DNA 불일치 결과는 육안으로 쉽게 관찰할 수 있습니다. 숙련된 후에는 샘플과 시약의 첨가부터 결과 확인까지 전체 과정이 5분 미만으로 소요되며, 이는 기존 방식보다 훨씬 빠른 속도입니다.각 조작의 총량은 단 10 µL이며, 이는 대규모 시스템에서 요구되는 양보다 현저히 적습니다. 이 절차에 따라, 특정 DNA 단편 영역의 서열 변이가 특정 질병의 원인임이 확인되면, 특수하게 설계된 제품을 사용하여 샘플 DNA의 다수 미스매치(mismatch)를 검출할 수 있습니다.공압식 액적 조작 플랫폼은 광학적 젖음성(optical weighting), 염료 전기 형광, 전기 젖음성 및 shoomoo의 모세관 작동과 같은 다른 방법보다 생체 적합성이 더 뛰어납니다. 제안된 다중 뉴클레오타이드 다형성 검출 방법은 공압식 액적 조작 플랫폼 하에서 수행되었으며, 이는 샘플과 시약을 피펫으로 직접 로딩하고 수집할 수 있음을 의미합니다. 개발 후, 이 기술은 DNA 스크리닝 및 기타 화학 및 생물학적 응용 분야에서 높은 잠재력을 가지고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

이 비디오에서는 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)으로 표적 핵산을 검출하기 위해 유화된 나노 액적을 생성하는 단계별 절차를 제시합니다.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

이 동영상은 DNA 샘플에서 indel 돌연변이를 식별하는 데 있어 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응의 역할을 보여줍니다. ddPCR의 높은 정밀도와 감도는 낮은 수준에서도 샘플에 존재하는 희귀 돌연변이를 정확하고 일관되게 검출할 수 있습니다. 게놈의 여러 영역에서 indel 돌연변이를 식별하고 정량화할 수 있으며, 이를 통해 돌연변이의 메커니즘과 이러한 돌연변이의 기능적 결과에 대한 귀중한 통찰력을 얻을  수 있습니다.

타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

이 동영상은 임상 진단 및 예후를 위한 조기 바이오마커로서 서로 다른 백혈구 집단에서 메틸화된 DNA 영역을 동시에 정량화하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응 기술을 보여줍니다.

백혈구에서 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

액적 미세유체역학에서 다색 형광 검출은 일반적으로 부피가 크고 복잡한 에피 형광 현미경 기반 검출 시스템을 포함합니다. 여기에서는 단일 광검출기에서 수집한 다색 데이터를 시간적으로 인코딩하기 위해 광섬유 어레이를 사용하는 소형 모듈식 다색 검출 체계에 대해 설명합니다.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

배우세요 공기 방울 조작 플랫폼에서 시각적 색도계법으로 다중 염기 다형성을 검출하는 간단한 방법을. 복잡한 장비 없이 유전자 변이를 신속하게 탐지하여 질병 연구에 활용할 수 있습니다.

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

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