Name: 디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 저비용 모비도스탯을 사용하여 항생제 내성 박테리아의 적응 진화를 연구하는 방법을. 실시간 성장 모니터링과 동적 약물 농도 조절로 내성 진화 경로를 특성화할 수 있습니다.

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저자는 이론적 분석과 수치 시뮬레이션에 유용한 토론과 도움을 주신 Sze-Bi Hsu 교수님과 Zhenzhen 씨에게 감사드립니다. Y. T. Y.는 과학기술부(Ministry of Science and Technology)로부터 보조금 번호 MOST 103-2220-E-007-026 및 MOST 104-2220-E-007-011로, 국립 칭화대학교(National Tsing Hua University)로부터 보조금 번호 103N2042E1로 자금 지원을 받았음을 감사드리며, 104N2042E1 및 105N518CE1.

Morbidostat 장치의 1 조립 및 사전 테스트 <ol><li> Morbidostat 조립 <ol><li> 18 G 주사기 바늘 문화 유리 병의 뚜껑에 3 홀 펀치. ~ 길이 7cm를 폴리에틸렌 튜브의 세 가지를 잘라. 캡에 폴리에틸렌 튜브의이 세 가지를 삽입합니다. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 혼합물의 주조로 사용하기 위해 캡의 가장자리를 감싸 테이프를 사용합니다. 이쑤시개 수동으로 교반하여 성분 5 g 및 150 ml의 플라스틱 컨테이너에 PDMS의 B 성분의 0.5 g을 혼합한다. 10 ML의 주사기에 혼합로드합니다. <ol><li> 주사기와 캡의 PDMS 혼합물을 붓고. 70 ° C의 오븐에서 8 시간에 대한 PDMS를 경화 전체 캡을 굽는다. </li></ol></li><li> 납땜 인두와 탄소 저항과 24 게이지 와이어 및 LED 음극과 양극 LED를 납땜. 24 G 와이어와 680 Ω 탄소 저항을 납땜. 전기 테이프를 사용하여 와이어 연결을 절연. </li><li> 그래서24 G 선 및 100 kΩ의 탄소 저항기 검출기의 이미 터와 광 검출기의 콜렉터 lder. 전기 테이프를 사용하여 와이어 연결을 절연. </li><li> 문화 유리 병 홀더에 발광 다이오드를 배치합니다. 부가도 2의 회로도를 수행함으로써, LED는 IR (예를 들어, 이동 전화 카메라)를 검출 할 수있는 디지털 카메라를 사용하여 작동하도록 5 V.의 전원 공급 다이오드와 전원을 발광 연결한다. </li><li> 문화 유리 병 홀더 광 검출기를 배치합니다. 부가도 2의 회로도에 따라, 전자 제어 보드를 가로 지르는 전압을 측정하는 검출기 저항의 양측에 와이어를 연결 5 V.의 전원과 광 검출기 및 전원에 연결. </li><li> 교반기 수단 인 냉각 팬의 축에 자석을 붙인다. alignm합니다배양 병에 팬 및 배양 바이알과 자석 사이의 간격의 축부의 엔트 자기 교반 장치의 적절한 기능에 매우 중요하다. </li><li> 마이크로 펌프, 중간 병, 폐기물 병 실리콘 튜브의 대응 조각으로 배양 병의 폴리에틸렌 튜브의 각 부분을 연결합니다. 1 시간 동안 펌프를 켜고 전체 볼륨이 펌프 속도를 결정하기 위해 문화 유리 병에 매체 병에서 펌핑되는 측정한다. 일반적인 펌핑 속도가 희석 비율 D = 0.33 시간 -1 문화 유리 병의 볼륨을 작동하는 12 ml의 용에 해당 ~ 4 ㎖ / 시간이어야합니다. </li><li> 중간 크기 (34cm X 34cm X 43.5 cm) 진탕 배양기에 전체 어셈블리를 놓습니다. </li></ol></li><li> Morbidostat을 사전 테스트 <ol><li> 5 V로 냉각 팬의 집합 전원 전압은 자기 교반 막대를 테스트하기 위해 그 모터를 시작한다. 교반 작용 육안 검사 할 수 있습니다. 구동 전압냉각 팬 모터는 정확히 펄스 폭 변조 (PWM)에 의해 제어된다 s는. </li><li> 야생형 E. 일련의 준비 600에서 광학 밀도를 갖는 대장균 시료는 일반적으로 0.07에서 교정 0.3 nm의 범위. 테스트 E. 배치 배양 병에 대장균 샘플과 검출기 전압을 기록한다. <ol><li> 장소 ~ 100 플레이트 판독기에서 동일한 샘플 ㎕의 광학 밀도를 기록한다. 검량선을 플롯 광학 밀도 데이터 대 전압 검출기를 사용한다. 일반적으로, 광학 밀도의 1 단위 변화가 여기에 사용되는 바이어스 방식과 광 검출기에서 ~ 7.6 V 변화에 대응합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Morbidostat 실행 <ol><li> 데일리 실험을 시작하기 전에 준비 <ol><li> 입구 부에서와 같이 장치를 형성하기 위해 내경이 1/32 인치 외부 직경 3/32 인치 세 울트라 화학성 타이곤 호스와 배양 병을 준비1.1 및 보충 그림 1인치 </li><li> M9 최소 배지 (0.2 % 포도당) 및 트리 메소 프림 (TMP) 약물 함유 배지를 준비합니다. 121 ℃에서 오토 클레이브 배지, 배지 병, 약물 매체 병, 폐기물 용기 및 배양 병을 소독. 주 : TMP 나중에 표 1의 농도 및 배지를 함유하는 약물 TMP가 멸균되지을 달성하기 위해 사용되는 원액이다. </li></ol></li><li> Morbidostat 실행 <ol><li> 실험 첫날, 냉동 야생형 1 ml의 E. 해동 실온 전송 함유 배양 병에 120 μL 세포에서 5 분간 콜라이 MG1655 ~ M9 세포 성장 배지 12 mL로. 1 일 이후에, 냉동 E. 1 ㎖를 해동 대장균 5 분 및 전송이 포함 된 새로운 문화 유리 병에 세포 120 μL의 전날 셀 ~ M9 성장 배지 12 ml를. </li><li> 진탕 배양기를 켜고 템피을 설정<html> 전혀 흔들림 30 ° C에 rature. </li><li> 마이크로 펌프, 자기 교반 장치 및 광학 밀도 측정 켜서 morbidostat 동작을 시작한다. 주 : 동작 동안, 임계 값 피드백 알고리즘은 약물 주입을 제어하기 위해 사용된다. 측정 된 광학 밀도가 미리 설정된 임계 값을 초과 할 경우, 약물 주입 펌프를 턴온 될 것이고, 매체 펌프가 턴 오프된다. 그렇지 않으면, 약물 주입 펌프는 꺼진 상태로 유지하고, 매체 펌프가 켜져 있습니다. </li><li> 미생물 성장이 있는지 확인하기 위해 수시로 전압을 모니터한다. 참고 : 때문에 동결 및 해동주기, E.의 대장균 세포는 매일의 성장시 ~ 4 시간의 지연을 나타낸다. </li><li> ~ 23 시간 후, 그것의 공급 전압을 해제하여 마이크로 펌프를 중지하고 문화 유리 병을 꺼내. 문화 유리 병에 15 % 글리세롤을 추가하고 저장을 위해 -80 ° C에서 샘플을 동결. </li><li> 반복 2.2.5에 2.2.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol>제작 &quot;&gt; 3. 항생제 감수성 측정 96 음 형식으로 주 : 항생제 내성 수준을 결정하기 위해 96 웰 포맷 플레이트 리더에서 성장 속도 측정을 수행한다. <ol><li> 실온에서 5 분 동안 매일 샘플을 냉동 및 해동 ~ 15ml의 M9 배지를 함유하는 바이알에 배양 세포의 15 μl를 옮긴다. 그들을 ~ 0.1에 도달 내지 600 nm에서의 광학 밀도까지 성장 할 수 있습니다. 1 ㎖의 병에 15 mL로 분할하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 원하는 약물 농도를 얻기 위해,이 단계에서 TMP 약물을 추가한다. </li><li> 플레이트 리더에서 잘 각으로 단계 3.1과 장소에서 샘플 200 μl를 가지고 그들을 12 시간 5 성장할 수 있습니다. 파장 600 nm에서의 광학 밀도를 측정하는 동안 자동으로 기록된다. 주 : 각 데이터 포인트에 대해, 삼중 측정 기록 된 데이터의 일관성을 보장하기 위해 평균화된다. 시간에 대한 광학 밀도의 데이터는 수 bE는 성장 속도를 얻기 위해 사용된다. </li><li> IC (50)를 획득하기 위해 상기 약물 농도 대 성장 속도 데이터를 플롯. IC (50) 성장 속도가 최대 성장 속도 (5)의 50 %가되는 약물 농도로서 정의된다합니다. </li></ol> 미세 유체 장치 4. 단일 세포 형태와 항생제 감수성 측정 <ol><li> 다른 곳에서 15 설명한 바와 같이 PDMS에서 다층 소프트 리소그래피를 통해 미세 유체 장치의 제조를 수행합니다. <ol><li> 제어 및 흐름 층의 포토 레지스트 몰드를 만들기 위해 포토 리소그래피를 사용합니다. 제어 층에 베어 실리콘 웨이퍼 상에 몰드를 생산하는 네가티브 포토 레지스트 (~ 15㎛의 높이) 및 포지티브 레지스트 (~ 8 ㎛의 높이)를 사용할 수 있습니다. </li><li> 각각의 제어 층과 유동 층, 1 : 1 내지 20 : 5의 비율 가교와 PDMS 혼합물을 준비한다. 모든 거품을 제거하기 위해 진공하에 데시 케이 터에 혼합물을 넣어1 시간 동안. </li><li> (TMCS) 증기 트리메틸 위해 실리콘 웨이퍼 상에 포토 레지스트 층 제어 금형 노출. PDMS의 혼합물을 캐스팅하여 ~ 6mm 두께의 제어 층을 (가교 비율 5 : 1) 제어 층의 포토 리지 스트 몰드에 실리콘 웨이퍼. 오븐에서 1 시간 동안 80 ° C에서 40 분 동안 제어 층을 굽는다. </li><li> (1, 회전 속도가 60 초 동안 3,000 RPM 가교 율 20)와 유동 층 포토 리지 스트 몰드에 PDMS 혼합물을 스핀 코팅에 의해 유동 층을 만든다. 오븐에서 1 시간 동안 80 ° C에서 30 분 동안 유동 층을 굽는다. </li><li> 원하는 칩 사이즈로 제어 층 (통상 3cm X 2cm)을 절단 수동 제어 층을 박리 면도날을 사용한다. 유동 층의 상부에 상기 제어 층을 올려 놓고 입체 현미경을 정렬. 오븐 하룻밤에 80 ° C에서 정렬 된 어셈블리를 치료. 그 후, 잔류 TMCS을 용해하는 5 시간 동안 플라스틱 용기에 탈 이온수 250 ㎖에 조립체를 침지. </li><li> 이어서, 20 G 바늘 유입 구멍을 펀치 (PDMS 간 비율이 5 링크 : 회전 속도 2000 rpm으로 30 초를 들면, 1) 빈 PDMS 층으로 코팅 된 유리 슬라이드를 엘라스토머 전체 접합 40 초에서 공기 플라즈마 처리하여 1.2 토르 공기압. </li><li> PDMS의 세포 독성 효과를 감소시키기 위해 80 ℃에서 36 시간 동안 광범위한 베이킹을 수행. 이러한 베이킹 단계는 상기 세균 세포에 독성을 최소화하는 것이 중요합니다. </li></ol></li><li> 칩 성장 실험에 <ol><li> 미세 유체 장치에 넣기 전에 1 시간 동안 1 시간과 M9 매체에 대한 탈 이온수로 세척합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 매일 샘플을 동결 해동 신선한 M9 배지로 새로운 시험관에 접종. 하룻밤 37 ℃에서 진탕 배양기에서 샘플을 놓습니다. </li><li> M9 매체와 미생물 샘플 10 배 희석하고 5 psi에서 미생물 시료 용기를 압박하여 미세 유체 장치에로드합니다. 그런 다음 TMP 약물을로드5 psi에서 약물 매체 컨테이너를 압박하여 칩에 매체. 15 분 동안 마이크로 유체 칩에 두 개의 챔버 사이에 마이크로 기계식 밸브를 작동하여 미생물 및 약물의 혼합을 실행합니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 장착 된 현미경 인큐베이터에있는 마이크로 유체 칩을 놓습니다. CCD 카메라와 8 시간마다 시간이 도립 현미경에 장착 된 성장 챔버 내의 셀 화상을 취득. </li><li> 셀의 영상 데이터 (18)상의 임계 알고리즘을 통하여 세포 수를 계산하기 위해 사용자 정의 프로그램 스크립트를 사용한다. 셀 번호 데이터는 일반적으로 위에 세 미세 유체 챔버 평균을합니다. </li></ol></li></ol>

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저가의 구성 요소에서 낮은 풋 프린트 morbidostat 장치가 설명된다. 장치 등록 약제 내성 수준의 증가는 이전보고 5의 것과 일치한다. 약물 내성의 진화 연구를 위해 설계된 장치는 다른 많은 실험에 잠재적으로 적용 할 수있다. 첫째, 약물 - 유도 된 돌연변이의 광범위한 데이터베이스 임상 적 항생제의 큰 세트에 설정 될 수있다. 예를 들어 다제 내성의 진화 경로 단순히 실험에 사용 된 약물의 수를 증가시킴으로써 조사 될 수있다. 여기에보고 모듈의 주요 장점은 다양한 실험 조건 하에서 대규모 병렬 실험 있도록 유연한 구성 가능성이다. 개념은 마이크로 유체 측정에서 설명되었다하더라도, 조사 파워는 유체 기술은 마이크로 유체 (23)를 결합함으로써 개선 될 수있다. 당 비용측정 (규모의 경제)이 극적으로 감소 시약 소비 감소 노동에 의해 감소된다. 여기서, 하나의 세포 형태 데이터는 미세 유체 플랫폼으로부터 추출 될 수있다. 최근에, ...

최초의 항생제 페니실린의 도입 이후, 미생물의 항생제 내성은 세계적인 건강 문제 (1)로 발전하고있다. 항생제 내성의 획득은 생체 내 향적 연구 할 수 있지만, 이러한 실험의 조건들은 전체에 걸쳐 방출이 제어되지 않는다. 이와 달리, 적응 실험실 진화 항생제 약물 (3)로부터 환경 스트레스 또는 선택 압력 하에서 미생물 종의 분자 적 진화를 공개 할 수있다. 최근 항생제 내성 많은 잘 제어 진화 실험은 항생제 내성 출현을 해명 하였다. 예를 들어, 오스틴의 그룹은 적절하게 설계 미세 유체 복실 환경 4의 급속한 출현을 보여 주었다. 최근에 개발 된 약물 morbidostat 선택 압력 하에서 5,6- 체계적 돌연변이를 유도한다. morbidostat, 미생물 SELEC연속적으로 거의 일정한 집단을 유지하기 위해 항생 물질의 농도를 조절 능 장치는 미생물 7,8에서 사용한 변동 테스트에서 큰 전진한다. 변동 시험에서, 항생제 약물을 고농도로 주입하고, 살아남은 돌연변이 스크리닝하고 계산한다. 대신, morbidostat에서 미생물 끊임없이 도전하고 여러 돌연변이를 획득한다. morbidostat는 chemostat, 미생물 인구 9 희석 동안 지속적으로 영양분을 공급하여 일정한 인구를 유지하고 1950 년 노빅과 Szliard에 의해 발명 문화 장치와 유사하게 작동합니다. 도입 이후, chemostat는 고급 및 개선되었습니다. 현재 마이크로 유체 chemostats은 나노 리터 및 단일 셀 용량에 도달했습니다. 그러나, 이러한 장치는 많은 돌연변이 이벤트 10, 11와 큰 세포 인구를 필요로 적응 진화 실험에 적합하다. 최근, 미니~ 10 ml로 작업 볼륨이 chemostats는 리터 규모의 생물 반응기 및 마이크로 유체 chemostat (12, 13) 사이의 간극을 채우기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 항생제 약물 내성 연구에 대한 설계 및 저가의 사용, 자동 morbidostat을 제시한다. 제안 된 모듈은 최소한의 하드웨어 요구 사항을 가진 미생물 실험실에서 진탕 배양기에서 사용될 수있다. 오픈 소스 펌웨어는 쉽게 대사 공학 3과 적응 진화의 특정 애플리케이션에 맞게 조정된다. 마지막으로, morbidostat 항생제 감수성 검사 (14)에 대한 멀티 플렉스 미세 유체 플랫폼에 통합되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>환경 셰이커 인큐베이터</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo 보드</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 옴 탄소 저항기</td><td>Digikey</td><td></td><td>바이어스 저항기 LED</td></tr><tr><td>용 100k 옴 탄소 저항기</td><td>Digikey</td><td></td><td>바이어스 저항기 광 트랜지스터 용 바이어스 저항기</td></tr><tr><td>940nm 발광 다이오드</td><td>밝은 LED 전자</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>광학 밀도 측정</td></tr><tr><td>940 nm 광 트랜지스터</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>광학 밀도 측정</td></tr><tr><td>Darlington 쌍 IC 토시바</td><td>마우저</td><td>ULN2803APG</td><td>이 IC는 마이크로 펌프와 자기 교반 장치를 구동</td></tr>합니다. <tr><td>5 V DC 브러시리스 팬</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>사양: 5 V 공급 전압 및 80&nbsp; 엄마; 사용 가능한</td></tr><tr><td>www.jameco.com 압전 마이크로 펌프</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>압력 > 3&nbsp; kPa; 흐름률 >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 튜닝</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L:50'&nbsp;</td></tr><tr><td>자석 젓는 막대</td>기 <td>COWIE</td><td></td><td>테이퍼드 모양 희미한: 10&nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>유리 섬광 20 ml 바이알</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex 유리 28 mm (지름) x 61 mm (높이)</td></tr><tr><td>문화 바이알 홀더</td><td></td><td></td><td>폴리포름알데히드로 맞춤 제작&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 바이알 중간 병을 밀봉하는 데 사용되는</td> <td>실리콘</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 최소 소금 5x</td><td>BD</td><td></td><td>중간</td></tr><tr><td>카다미노 산</td><td>BD</td><td></td><td>중간</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>한천 한천 Bateriological</td><td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>미세유체 측정에 사용 40X 대물렌즈 NA = 0.55</td></tr><tr><td>현미경 인큐베이터</td> 사용 미<td>세유체 측정에 사용되는</td><td>라이브 셀 기기</td><td>CU-109</td></tr><tr><td>솔레노이드 밸브</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>평상시 열림 1.3와트 12Vdc</td></tr><tr><td>USB 인터페이스 카드</td><td>취미 엔지니어링</td><td>USBIO24-R 디지털 I/O 모듈&nbsp;</td><td>미세유체 측정용</td></tr><tr><td>공기 압축기</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>미세유체용 압력 소스; 최대 압력 80psi</td></tr><tr><td>미세유체 제어에 사용되는</td><td>1/8" 미늘</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td>에 대한 수 루어락 피팅</tr><tr><td>1/8" 미늘 10-32 나사산 포트</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>미세유체 제어에 사용되는</td></tr><tr><td>10-32 나사산 포트에</td> <td>대한 암 루어락 피팅ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td>은 <td>미세유체 제어에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>NPN darlington 트랜지스터 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>는 미세유체 제어에 사용됩니다</td></tr><tr><td>10 kOhm, 탄소 필름 저항기, 0.25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>는 미세유체 제어</td></tr><tr><td>탄탈륨 커패시터에 사용됩니다, 10&nbsp; &뮤; F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>는 미세유체 제어에 사용되며</td></tr><tr><td>Andor CCD 카메라는</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>가 미세유체 이미징에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>ELISA 플레이트 리더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>두 구성 요소 실리콘&nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>미세유체 칩 제조에 사용</td></tr><tr><td>SU-8 포토레지스트</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>미세유체 칩 제조에 사용</td></tr><tr><td>AZ4620 포토레지스트</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>미세유체 칩 제조에 사용</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>미세유체 칩 제조에 사용</td></tr><tr><td>20 게이지 주사기 바늘</td><td>BD</td><td></td><td>마이크로플루이드 칩 제작에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA 중합효소</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR 증폭</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma Plate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp;</td><td>항생제 레지스테인 측정</td></tr></tbody></table>

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

우리는 항생제 내성의 진화 경로를 특성화 저렴한 비용으로, 구성 morbidostat에 대해 설명합니다. morbidostat 연속적 박테리아 증식을 모니터링하여 동적으로 약물 내성을 획득 진화 항상 세균 도전 약물 농도를 조절하는 세균 배양 장치이다. 이 장치는 ~ 10 ML의 작업 볼륨을 갖추고 있으며, 완전 자동화 및 광학 밀도 측정 및 매체 및 약물 전달 마이크로 펌프가 장착되어 있습니다. 플랫폼의 유효성을 확인하기 위해, 우리는 1655 대장균 MG에서 trimethoprim을 저항의 단계적 취득을 측정하고, 세포 형태 및 항생제 감수성을 조사 할 수있는 멀티 플렉스 미세 유체 플랫폼과 장치를 통합. 접근 방식은 항생제 약물 내성의 실험실 연구를 확장 업 및 대사 공학 및 기타 세균 배양 실험에서 변형 개선을 위해 진화를 적응 적하는 확장 가능한 것입니다 수 있습니다.

상술 morbidostat은도 1에 도식화한다. 실험 진화 항생제 감수성 시험 및 세포 형태 검사를 포함하는 일반적인 동작을 morbidostat, E.에서 검증 된 (TMP) trimethoprim을 노출 대장균 MG1655 문화, 일반적으로 사용되는 항생제 약물 5,6. TMP는 약물 내성이 매우 독특한 단계적 증가를 유도하고, 돌연변이 디 하이드로 리덕 타제 (DHFR) 유전자 클러스터를 해결한다. 따라서, TMP는 morbidostat 동작을 검증하기위한 매우 효과적인 표준 약물이다. 매일, 상기 미생물은 소정의 광학 밀도가 임계치를 초과하여 증가하고도 2a에 도시 된 바와 같이, 약물 주입을 유발하는 것으로 예상된다. 약물 주입 성장을 억제 할 것으로 예상 결과, 광학 밀도가 감소된다. 몇몇 시험 런은 최적의 약물 농도를 결정하기 위해 필요할 수있다...

약물 농도를 동적으로 조정하여 항생제 약물 내성의 특성을 분석할 수 있는 저비용의 구성 가능한 모비드도스타트를 설명합니다. 이 장치는 다중화된 미세유체 플랫폼과 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식은 실험실 항생제 약물 내성 연구를 위해 확장할 수 있습니다.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

본 실험의 전반적인 목표는 박테리아의 성장을 지속적으로 모니터링하고 박테리아가 약물 내성을 획득함에 따라 항생제 농도를 동적으로 조절하는 모비도스탯(Morbidostat)을 사용하여 항생제 내성의 진화 경로를 특성화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 전자 부품으로 구성되어 있으며, 특정 목적에 맞게 쉽게 재구성할 수 있다는 점입니다. 실험 절차는 본 연구실의 대학원생인 Po Cheng Liu와 Yi Tai Lee가 시연하겠습니다.Morbidostat을 조립하려면, 먼저 18 gauge 바늘을 사용하여 배양 바이알 캡에 세 개의 구멍을 뚫으십시오. 약 7 cm 길이의 폴리에틸렌 튜브 세 조각을 잘라 캡의 구멍에 삽입합니다. 테이프를 사용하여 캡의 가장자리를 감싸 Polydimethylsiloxane(PDMS) 혼합물의 틀로 사용하십시오.그 다음, 150 milliliter 플라스틱 용기에 PDMS의 성분 A 5 g과 성분 B 0.5 g을 넣고 이쑤시개를 사용하여 수동으로 섞어줍니다. 혼합물을 10 milliliter 시린지에 넣습니다. 그런 다음, 시린지를 사용하여 PDMS 혼합물을 캡 위에 주입합니다.PDMS를 경화시키기 위해 캡 전체를 70 °C에서 8시간 동안 가열합니다. 다음으로, 인하두를 사용하여 LED anode를 24 gauge 와이어에 납땜하고, LED cathode를 탄소 저항기에 납땜합니다. 그런 다음 680 Ohm 탄소 저항기를 24 gauge 와이어에 납땜합니다.전기 테이프를 사용하여 전선 연결 부위를 절연하십시오. 광검출기의 컬렉터를 24 gauge 전선으로 납땜하고, 광검출기의 이미터를 100 Ohm 탄소 저항기로 납땜하십시오. 그런 다음 전기 테이프를 사용하여 전선 연결 부위를 절연하십시오.발광 다이오드를 배양 바이알 홀더에 배치합니다. 여기에 표시된 회로도를 따라 발광 다이오드를 연결하고, 5V 전원 공급 장치를 사용하여 전원을 공급합니다. IR을 감지할 수 있는 디지털 카메라를 사용하여 LED가 작동하는지 확인하십시오. 이제 광검출기를 배양 바이알 홀더에 배치합니다.그런 다음 도표에 따라 광검출기를 연결하고 5 V 전원 공급 장치로 전원을 공급합니다. 전자 제어 보드 양단의 전압을 측정하기 위해 광검출기 저항기의 양쪽에 전선을 연결합니다. 마그네틱 스터러 장치 역할을 하는 냉각 팬의 축에 자석을 접착제로 붙입니다.자기 교반 장치는 자석과 냉각 팬으로 구성되므로, 팬의 선반을 배양 바이알에 맞춰 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 안정적인 작동을 보장하기 위해 배양 바이알과 자석 사이의 거리가 매우 결정적인 역할을 합니다. 배양 바이알의 각 폴리에틸렌 튜브를 마이크로 펌프, 배지 병 및 폐액 병에 연결되는 해당 실리콘 튜브에 연결하십시오.펌프를 1시간 동안 작동시킨 후, 배지 병에서 배양 바이알로 펌핑되는 총 부피를 측정하여 펌프 속도를 결정합니다. 일반적인 펌핑 속도는 시간당 약 4 mL이며, 이는 배양 바이알의 작동 부피가 12 mL일 때 희석률 D = 0.33 per hour에 해당합니다. 설치가 완료되면 전체 조립체를 중형 진탕 배양기에 넣습니다.Morbidostat의 사전 테스트를 위해, 냉각 팬의 전원 공급 전압을 5 V로 설정하여 모터를 가동하고 마그네틱 스터 바를 테스트합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 일련의 E-coli 샘플을 준비하고 검정 곡선을 작성한 후, 내경 1/32인치, 외경 3/32인치인 초화학 내성 Tygon 튜빙 7 cm 길이 3개를 준비하여 장치 유입구로 구성함으로써 배양 바이알을 준비합니다. 0.2% glucose가 포함된 M9 최소 배지와 약물 Trimethoprim(TMP)이 포함된 M9 배지를 준비합니다.그 다음 배지, 배지 병, 약물 배지 병, 폐액 병 및 배양 바이알을 오토클레이브에서 121 °C로 멸균합니다. 실험 첫째 날에, 냉동된 야생형 E-coli MG1655 세포 1 mL를 상온에서 5분 동안 해동하고, 이 세포 중 120 µL를 약 12 mL의 M9 성장 배지가 들어 있는 배양 바이알로 옮깁니다. 진탕 배양기를 켜고 온도를 30 °C로 설정하며, 진탕은 하지 않습니다.마이크로 펌프, 자성 교반기 및 광학 밀도 측정 장치를 켜서 Morbidostat 작동을 시작합니다. 약 23시간 후, 공급 전압을 꺼서 마이크로 펌프를 정지시키고 배양 바이알을 꺼냅니다. 배양 바이알에 15% glycerol을 첨가하고, 보관을 위해 샘플을 -80 °C에서 냉동합니다.비오틴 형성을 방지하기 위해 각 실험을 시작할 때마다 새로운 배양 바이알로 교체하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 2~3일 내에 비오틴 형성이 일어날 수 있습니다. 매일 냉동 보관한 샘플을 실온에서 5분 동안 해동한 후, 신선한 M9 배지가 담긴 새로운 시험관에 접종하십시오.시료를 37°C의 진탕 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, M9 배지를 사용하여 미생물 시료를 10배 희석하고, 미생물 시료 용기에 5 PSI의 압력을 가하여 미세유체 장치에 주입합니다. 그다지 TMP가 포함된 배지를 5 PSI의 압력으로 M9 및 TMP 용기에서 칩으로 주입합니다.미세유체 칩 상의 두 챔버 사이에 위치한 미세 기계식 밸브를 작동시켜 15분 동안 미생물과 약물을 혼합합니다. 마지막으로 미세유체 칩을 도립 현미경에 장착된 현미경 인큐베이터에 넣습니다. CCD 카메라를 사용하여 8시간 동안 매시간 배양 챔버 내의 세포 이미지를 획득합니다.텍스트 프로토콜에 따라 세포 수 데이터를 계산하십시오. 실험적 진화, 항생제 감수성 테스트 및 세포 형태 확인을 포함한 일반적인 Morbidostat 작동은 항생제 TMP에 노출된 E-coli MG1655 배양물을 사용하여 무효화되었으며, TMP는 dihydrofolate reductase(DHFR) 유전자 주변에 돌연변이가 집중되어 약물 내성이 뚜렷한 단계적 증가를 보이도록 유도합니다. 매일 미생물은 미리 설정된 광학 밀도 임계값 이상으로 성장하여 여기에서 보여주는 것과 같이 약물 주입을 유발할 것으로 예상됩니다.약물 주입은 성장을 억제하여 결과적으로 광학 밀도를 감소시킬 것으로 예상됩니다. 이 그래프는 IC50를 결정하는 실험에서 항생제 약물 내성의 시간적 증가를 보여줍니다. 약물 내성은 약 12일에 걸쳐 1,000 micrograms per milliliter까지 약 1,500배 증가했습니다.이전의 결과들과 일치합니다. last day 돌연변이체의 DHFR 점 돌연변이를 Sanger 시퀀싱으로 측정하여 이 표에 기재하였습니다. 다중 돌연변이를 통한 약물 내성 획득은 Morbidostat의 유용성을 입증합니다.약물이 포함된 한천 배지에서의 선택은 단일 돌연변이만을 부여하는 경향이 있습니다. 이 그림은 다양한 농도의 TMP에서의 칩 상 성장 곡선을 보여줍니다. 돌연변이 샘플은 항생제 내성이 유의미하게 증가했음을 보여줍니다.이 기술이 개발된 이후, 연구자들은 실제 제어된 실험실 환경에서 항생제 내성의 위치를 연구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 본 절차에 이어, 항생제 약물 노출로 인해 세포 형태가 여전히 변화하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 미세유체 단일 세포 측정과 같은 다른 측정법을 수행할 수 있습니다. 이 장치의 사용법을 숙달하면, 특정 박테리아의 배양이나 박테리아 균주의 내성 수준을 높이는 것과 같은 모든 박테리아 배양 실험에 맞게 쉽게 재구성할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 실제 제어 적응 실험실 진화 실험에서 항생제 내성 획득을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미생물 실습을 위한 생물 안전 수칙에 따라 내성균을 취급하는 것을 잊지 마십시오. 박테리아의 기본 훈련이 포함된 실험의 경우 특별 허가가 필요할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

출처: Liu, P. C., et al. 항생제 선택 하에서 박테리아의 적응 진화를 위한 저비용의 자동화된 Morbidostat의 설계 및 사용. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 미세유체 칩을 사용하여 트리메토프림 항생제 스트레스 하에서 야생형 및 트리메토프림 내성 대장균 균주의 성장과 형태를 시각화하고 비교하는 방법을 보여줍니다.

항생제 약물 내성을 연구하기 위한 미세유체 칩의 박테리아 성장

출처: Jian, X., et al., MMC(Microbial Microdroplet Culture System)를 사용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 미생물 미세 액적 배양 시스템을 사용하여 메탄올 내성을 향한 박테리아의 적응 진화를 유도하는 방법을 보여줍니다. 조작된 박테리아 배양액을 높은 메탄올 스트레스 배지와 혼합하고 이를 미세 물방울로 분할함으로써 시스템은 메탄올 스트레스 하에서 향상된 성장을 보이는 돌연변이를 선택합니다. 반복적인 농축 주기와 콜로니 분리를 통해 추가 분석 또는 적용을 위해 메탄올 적응 박테리아 균주를 배양합니다.

미생물 미세액방울 배양 시스템을 이용한 박테리아의 적응 진화

세포의 성장 속도는 규제 과정 및 세포 생리학의 주요 결정 요인이다. chemostats를 이용한 연속 배양은 세포 성장과 이러한 네트워크는 세포 성장을 최적화하기 위해 발전을 제어하는​​ 분자 네트워크의 학습을 용이 영양소 한정하여 세포 성장 속도의 외인성 제어를 가능하게한다.

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

우리는 개발 및 저렴한 비용에 즉시 사용할 수 각지에서 만들어진 작은 chemostats의 소형 풋 프린트 배열을 확인. 생리학 및 실험 진화 결과는 큰 볼륨 chemostats과 비슷했다. ministat 배열은 기존 chemostat 실험, 기능 유전체학, 화학 심사 어플리케이션을위한 컴팩트 저렴하고 접근 할 플랫폼을 제공합니다.

다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

이 더에이 버 프레임 워크는 실험적 파라미터에 대 한 높은 분해능과 동적 제어를 통해 고 처리량의 지속적인 미생물 배양을 가능 하 게 합니다. 이 프로토콜은 복잡 한 피트 니스 실험을 수행 하기 위해 시스템을 적용 하는 방법을 보여 주며, 사용자가 여러 개별 문화권에 대 한 자동화 된 제어를 프로그래밍 하 고, 측정 하 고, 수집 하 고, 실시간으로 실험 데이터와 상호 작용 하는 방법을 안내 합니다.

에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

배우세요 저비용 모비도스탯을 사용하여 항생제 내성 박테리아의 적응 진화를 연구하는 방법을. 실시간 성장 모니터링과 동적 약물 농도 조절로 내성 진화 경로를 특성화할 수 있습니다.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

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