디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

본 실험의 전반적인 목표는 박테리아의 성장을 지속적으로 모니터링하고 박테리아가 약물 내성을 획득함에 따라 항생제 농도를 동적으로 조절하는 모비도스탯(Morbidostat)을 사용하여 항생제 내성의 진화 경로를 특성화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 전자 부품으로 구성되어 있으며, 특정 목적에 맞게 쉽게 재구성할 수 있다는 점입니다. 실험 절차는 본 연구실의 대학원생인 Po Cheng Liu와 Yi Tai Lee가 시연하겠습니다.

Morbidostat을 조립하려면, 먼저 18 gauge 바늘을 사용하여 배양 바이알 캡에 세 개의 구멍을 뚫으십시오. 약 7 cm 길이의 폴리에틸렌 튜브 세 조각을 잘라 캡의 구멍에 삽입합니다. 테이프를 사용하여 캡의 가장자리를 감싸 Polydimethylsiloxane(PDMS) 혼합물의 틀로 사용하십시오.

그 다음, 150 milliliter 플라스틱 용기에 PDMS의 성분 A 5 g과 성분 B 0.5 g을 넣고 이쑤시개를 사용하여 수동으로 섞어줍니다. 혼합물을 10 milliliter 시린지에 넣습니다. 그런 다음, 시린지를 사용하여 PDMS 혼합물을 캡 위에 주입합니다.

PDMS를 경화시키기 위해 캡 전체를 70 °C에서 8시간 동안 가열합니다. 다음으로, 인하두를 사용하여 LED anode를 24 gauge 와이어에 납땜하고, LED cathode를 탄소 저항기에 납땜합니다. 그런 다음 680 Ohm 탄소 저항기를 24 gauge 와이어에 납땜합니다.

전기 테이프를 사용하여 전선 연결 부위를 절연하십시오. 광검출기의 컬렉터를 24 gauge 전선으로 납땜하고, 광검출기의 이미터를 100 Ohm 탄소 저항기로 납땜하십시오. 그런 다음 전기 테이프를 사용하여 전선 연결 부위를 절연하십시오.

발광 다이오드를 배양 바이알 홀더에 배치합니다. 여기에 표시된 회로도를 따라 발광 다이오드를 연결하고, 5V 전원 공급 장치를 사용하여 전원을 공급합니다. IR을 감지할 수 있는 디지털 카메라를 사용하여 LED가 작동하는지 확인하십시오. 이제 광검출기를 배양 바이알 홀더에 배치합니다.

그런 다음 도표에 따라 광검출기를 연결하고 5 V 전원 공급 장치로 전원을 공급합니다. 전자 제어 보드 양단의 전압을 측정하기 위해 광검출기 저항기의 양쪽에 전선을 연결합니다. 마그네틱 스터러 장치 역할을 하는 냉각 팬의 축에 자석을 접착제로 붙입니다.

자기 교반 장치는 자석과 냉각 팬으로 구성되므로, 팬의 선반을 배양 바이알에 맞춰 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 안정적인 작동을 보장하기 위해 배양 바이알과 자석 사이의 거리가 매우 결정적인 역할을 합니다. 배양 바이알의 각 폴리에틸렌 튜브를 마이크로 펌프, 배지 병 및 폐액 병에 연결되는 해당 실리콘 튜브에 연결하십시오.

펌프를 1시간 동안 작동시킨 후, 배지 병에서 배양 바이알로 펌핑되는 총 부피를 측정하여 펌프 속도를 결정합니다. 일반적인 펌핑 속도는 시간당 약 4 mL이며, 이는 배양 바이알의 작동 부피가 12 mL일 때 희석률 D = 0.33 per hour에 해당합니다. 설치가 완료되면 전체 조립체를 중형 진탕 배양기에 넣습니다.

Morbidostat의 사전 테스트를 위해, 냉각 팬의 전원 공급 전압을 5 V로 설정하여 모터를 가동하고 마그네틱 스터 바를 테스트합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 일련의 E-coli 샘플을 준비하고 검정 곡선을 작성한 후, 내경 1/32인치, 외경 3/32인치인 초화학 내성 Tygon 튜빙 7 cm 길이 3개를 준비하여 장치 유입구로 구성함으로써 배양 바이알을 준비합니다. 0.2% glucose가 포함된 M9 최소 배지와 약물 Trimethoprim(TMP)이 포함된 M9 배지를 준비합니다.

그 다음 배지, 배지 병, 약물 배지 병, 폐액 병 및 배양 바이알을 오토클레이브에서 121 °C로 멸균합니다. 실험 첫째 날에, 냉동된 야생형 E-coli MG1655 세포 1 mL를 상온에서 5분 동안 해동하고, 이 세포 중 120 µL를 약 12 mL의 M9 성장 배지가 들어 있는 배양 바이알로 옮깁니다. 진탕 배양기를 켜고 온도를 30 °C로 설정하며, 진탕은 하지 않습니다.

마이크로 펌프, 자성 교반기 및 광학 밀도 측정 장치를 켜서 Morbidostat 작동을 시작합니다. 약 23시간 후, 공급 전압을 꺼서 마이크로 펌프를 정지시키고 배양 바이알을 꺼냅니다. 배양 바이알에 15% glycerol을 첨가하고, 보관을 위해 샘플을 -80 °C에서 냉동합니다.

비오틴 형성을 방지하기 위해 각 실험을 시작할 때마다 새로운 배양 바이알로 교체하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 2~3일 내에 비오틴 형성이 일어날 수 있습니다. 매일 냉동 보관한 샘플을 실온에서 5분 동안 해동한 후, 신선한 M9 배지가 담긴 새로운 시험관에 접종하십시오.

시료를 37°C의 진탕 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, M9 배지를 사용하여 미생물 시료를 10배 희석하고, 미생물 시료 용기에 5 PSI의 압력을 가하여 미세유체 장치에 주입합니다. 그다지 TMP가 포함된 배지를 5 PSI의 압력으로 M9 및 TMP 용기에서 칩으로 주입합니다.

미세유체 칩 상의 두 챔버 사이에 위치한 미세 기계식 밸브를 작동시켜 15분 동안 미생물과 약물을 혼합합니다. 마지막으로 미세유체 칩을 도립 현미경에 장착된 현미경 인큐베이터에 넣습니다. CCD 카메라를 사용하여 8시간 동안 매시간 배양 챔버 내의 세포 이미지를 획득합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 세포 수 데이터를 계산하십시오. 실험적 진화, 항생제 감수성 테스트 및 세포 형태 확인을 포함한 일반적인 Morbidostat 작동은 항생제 TMP에 노출된 E-coli MG1655 배양물을 사용하여 무효화되었으며, TMP는 dihydrofolate reductase(DHFR) 유전자 주변에 돌연변이가 집중되어 약물 내성이 뚜렷한 단계적 증가를 보이도록 유도합니다. 매일 미생물은 미리 설정된 광학 밀도 임계값 이상으로 성장하여 여기에서 보여주는 것과 같이 약물 주입을 유발할 것으로 예상됩니다.

약물 주입은 성장을 억제하여 결과적으로 광학 밀도를 감소시킬 것으로 예상됩니다. 이 그래프는 IC50를 결정하는 실험에서 항생제 약물 내성의 시간적 증가를 보여줍니다. 약물 내성은 약 12일에 걸쳐 1,000 micrograms per milliliter까지 약 1,500배 증가했습니다.

이전의 결과들과 일치합니다. last day 돌연변이체의 DHFR 점 돌연변이를 Sanger 시퀀싱으로 측정하여 이 표에 기재하였습니다. 다중 돌연변이를 통한 약물 내성 획득은 Morbidostat의 유용성을 입증합니다.

약물이 포함된 한천 배지에서의 선택은 단일 돌연변이만을 부여하는 경향이 있습니다. 이 그림은 다양한 농도의 TMP에서의 칩 상 성장 곡선을 보여줍니다. 돌연변이 샘플은 항생제 내성이 유의미하게 증가했음을 보여줍니다.

이 기술이 개발된 이후, 연구자들은 실제 제어된 실험실 환경에서 항생제 내성의 위치를 연구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 본 절차에 이어, 항생제 약물 노출로 인해 세포 형태가 여전히 변화하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 미세유체 단일 세포 측정과 같은 다른 측정법을 수행할 수 있습니다. 이 장치의 사용법을 숙달하면, 특정 박테리아의 배양이나 박테리아 균주의 내성 수준을 높이는 것과 같은 모든 박테리아 배양 실험에 맞게 쉽게 재구성할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 실제 제어 적응 실험실 진화 실험에서 항생제 내성 획득을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미생물 실습을 위한 생물 안전 수칙에 따라 내성균을 취급하는 것을 잊지 마십시오. 박테리아의 기본 훈련이 포함된 실험의 경우 특별 허가가 필요할 수 있습니다.