Name: 터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 터치 유발 대응 및 수영 분석을 사용하여 Danio rerio의 근육 기능을 평가하는 방법을. 이 기법은 신경근육 질환 모델에서 근육 성능을 자동화된 고속 처리로 분석하여 연구자들이 질병 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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1. 터치 유발 응답 분석 <ol><li> 터치 유발 응답 분석을위한 배아 DPF (2)의 제조 <ol><li> 활동이 하루 (17, 18)를 통해 극적으로 변화 할 수 있기 때문에 테스트가 실시되는 날의 시간이 실험 사이의 일관성이 있음을 확인합니다. 주 : 실험을 수행 맹검 시험 순서는 실험적 인공물을 최소화하기 위해 랜덤 화되어야한다. </li><li> 생선을 할당하는 실험을 수행하는 개인에게 알려지지 않은 참조 균주. 자유롭게 사용할 수 온라인 도구 테스트의 순서를 지시 임의의 목록을 생성하여,이에 따라. </li><li> 적어도 1 시간 전에 테스트하기 위해, 융모막에 구멍을 찢어 부드럽게 미세 핀셋을 이용하여 이격 융모막 당기는 dechorionate 배아. 28 ° C 배양기에 반환하기 전에 배양 접시에서 이물질을 제거합니다. </li></ol></li><li> 터치 유발 응답 분석을 수행 <ol><li> 열 역GE는 28 ° C에서 적어도 15 분에 테스트를 시작하기 전에. 이 단계는 온도가 제어되고 28에서 유지됩니다 : 주 &#160; 테스트 기간 동안 C를 °. 온도 활동에 영향을 미칠 것이며, 그 온도를 일정하게 유지하는 것이 중요하다. 가열 단계가없는 경우는 물의 온도가 모니터링되어야하고 모든 실험은 동일한 온도에서 수행되어야한다. </li><li> 배아 매체 (5 mM의 염화나트륨, 0.17의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘이 물에 0.33 mM의 황산 4) 조명 스테이지로 가득 배양 접시를 놓고 페트리 접시 위에 고속 카메라를 탑재합니다. </li><li> 물고기의 빠른 수영 활동 기록을 보장하기 위해 캡처 속도와 같은 초 (1,000 FPS) 당 1,000 프레임을 선택합니다 (예 : 여기에 설명 스트림 픽스 5, 등)와 &quot;작업 공간&quot;탭에서 비디오 카메라 레코딩 소프트웨어를 실행합니다. </li><li> 한 번에 하나의 배아 작업의 MIDD에서 배아를 배치보기의 분야에서 눈에 잘 제브라 피쉬와 함께 배양 접시의 제작. 참고 : 배아 실험의 시작 탈환과 태아의 위치가 일부 질병 모델에서 근육 약화를 촉진 할 수있다 자극과 반복 버스트 반응에 둔감되는 것을 초래할 수 있으므로, 다른로 교체 멀리 전에 수영합니다. </li><li> 은 &quot;기록&quot;버튼을 클릭하여 녹음을 시작하고, 머리의 상단에 무딘 바늘로 가볍게 터치하여 배아에 mechanosensory 자극을 제공합니다. </li><li> 배아가 시야에서 수영 할 또는 휴식에 돌아온 후에 녹화를 중지합니다. 주 : 기계적 자극 다음 버스트 이탈 반응의 첫 0.2 초 이내에 가속도 피크. 따라서, 생선 시야에 기록 이탈 반응의 제 0.2 초간 이상이되도록. 단계 1.2.3에 설명 된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 자동 저장 될.AVI 비디오 파일로. 이러한 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다 둘 다 무료 비디오 캡처 또는 Softonic, 같은 대체 비디오 캡처 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. </li><li> 새로운 배양 접시에 배아를 반환 및 테스트를위한 또 다른 배아를 선택합니다. (15) 물고기의 최소한의 테스트를 수행합니다. </li></ol></li><li> 수영 동작의 정량화 <ol><li> 수영 동작을 정량화하기 위해 소프트웨어를 실행하고 .AVI 저장된 동영상 파일을 엽니 다 &quot;배경 차감없이 단일 애벌레 로코&quot;모듈을 선택하십시오. </li><li> 은 &quot;자유&quot;또는 동영상의 메뉴 바의 일부 지역에서 &quot;다각형&quot;툴을 사용하는 분석에 사용된다. 이 지역은 물고기의 원래 위치와 물고기에 수영을 할 것이라는 영역을 모두 포함하고 있는지 확인합니다. 프로브 분석 할 수있는 영역에서 제외되어 있는지 확인합니다. 소프트웨어는 자동적으로 원하는 영역 내 어류의 궤적을 추적한다. </li><li> t을 수행하려면그는 분석, 메뉴 바에서 &quot;실험&quot;을 클릭하고 &quot;실행&quot;을 선택합니다. 원하는 위치에 원 데이터 분석 파일 (.phr 포맷)을 저장 메시지가 나타나면. 저장 한 후 분석을 시작하려면 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. 은 &quot;실험&quot;에서 &quot;중지&quot;를 클릭하여 분석을 종료 드롭 다운 메뉴. 결과를 포함하는 윈도우가 표시됩니다. </li><li> &quot;최대 가속도&quot;값을 얻기 위해 오른쪽으로 스크롤. 원하는 경우, 결과 창을 닫고 &quot;결과&quot;에서 &quot;수출 순간적인 결과&quot;버튼을 클릭하여이 데이터를 내보낼 드롭 다운 메뉴. 해당 원시 데이터 분석 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 스프레드 시트 프로그램에서 열 수있는 텍스트 파일을 대상 폴더에 저장됩니다. </li><li> 각각의 물고기, 각 균주에 대한 평균 최대 가속도를 얻기 위해 평균에 대해이 과정을 반복하여 (도 1 참조). 참고 : 다른 방법으로저기서하기g 여기에 설명 된 소프트웨어 등 자유롭게 사용할 ImageJ에 소프트웨어와 유사한 패키지 관련 움직임 데이터를 추출하는데 사용될 수있다. 3 차원 입자 추적기 플러그인은 수영의 궤적을 추적하는 데 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 로코 분석 - 10 분 수영 테스트 <ol><li> 수영 분석을위한 배아 DPF (6)의 제조 <ol><li> 필요한 경우, 정렬 배아 필요한 유전자형에 대한 별도의 배양 접시 (접시 당 25 ~ 30 배아)에 형광 단백질 또는 표현형으로 발현을 조사하고, 배치에 의해, 예를 들면. 대안 적으로, 유전자형은 운동 분석 종료 후 결정될 수있다. </li><li> 3 DPF에서 배양 접시를 다시 검토하고 깐 배아 및 이물질을 제거합니다. 6 DPF 때까지 28 ° C 배양기에 배양 접시를 돌려줍니다. </li><li> 제브라 피쉬 애벌레가 가장 활성화되어있는 시간입니다 오전 9시에서 정오 사이의 모든 균주의 테스트를 수행합니다. 상기 p-에서 테스트 및 위치의 순서를 무작위야생형 및 돌연변이 늦은 샘플은 주기성의 차이 및 다른 실험 바이어스의 영향을 최소화한다. 주 : 활성 하루 동안 극적으로 변할 수 있기 때문에, 테스트 시간이 실험과 일치하는 것이 중요하다. </li><li> 적어도 30 분은 물론 당 하나의 애벌레와 48 웰 플레이트에 시험 장소 유충 전에. 물 표면 그냥 잘의 맨 아래에 있도록 전송 한 후, 기포가없는 보장 우물을 입력합니다. 28 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 타고 시험을하기 전에 5 분 동안 빛에 순응. </li></ol></li><li> 로코의 분석을 수행 <ol><li> 이 유충이 어둠 검출 할 수 있도록, 60 프레임 / 초까지 포착 적외선 디지털 카메라가 장착되는 기록 챔버로 48- 웰 플레이트를 놓는다. 우물 모두가 운동 소프트웨어에 원형 격자 내부에 배치되어 있는지 확인하고 모든 애벌레는 CLE 있음아 흘리 검출. </li><li> 소프트웨어를 실행하고 &quot;추적&quot;모듈을 선택합니다. &quot;파일&quot;에서 &quot;생성 새로운 프로토콜&quot;을 클릭하고 실험에 사용되는 우물의 수를 편집 할 수 있습니다. 실험 기간과 &quot;매개 변수&quot;를 클릭하여 10 분에 통합 기간을 모두 설정 드롭 다운 메뉴와 &quot;프로토콜 매개 변수&quot;및 이후에 &quot;시간&quot;탭을 선택. 동일한 &quot;프로토콜 매개 변수&quot;대화 상자에서 &quot;옵션&quot;탭을 클릭하고 &quot;Numeriscope&quot;체크 상자는 &quot;프로토콜 매개 변수&quot;대화 상자를 닫을 수 있습니다, 다음을 클릭 확인합니다. </li><li> 기록 영역이 우물 하나에 전체 그리드 더블 클릭을 강조 설정합니다. 은 &quot;그리기 영역&quot;버튼을 클릭하고 왼쪽, 오른쪽 및 왼쪽 아래 우물 주위에 그릴 및 소프트웨어가 자동으로 잘 각각의 위치를 ​​확인할 수 있습니다 &quot;빌드&quot;를 클릭합니다. 또한 규모에 무승부바 및 &quot;그룹에 적용&quot;을 클릭합니다. 완료되면, &quot;영역을 그립니다&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 시각적으로 만 물고기의 움직임이없는 배경 신호를 강조하는 수준으로 &quot;감지 임계 값&quot;막대를 밀어 검출 임계 값을 결정합니다. 주 : 검출 임계 값은 균주 따라서 임계 값은 새로운 변형을 테스트 할 때마다 결정해야 할 사이에 다를 수 있습니다. 대표 데이터는 25mm의 검출 한계를 제시 / 초를 사용 하였다. </li><li> 테스트를 시작하기 전에 활동의 탐지 및 크고 작은 운동을위한 운동 임계 값을 입력합니다. 주 : 대표 데이터가 6mm / 초 비활성 임계치와 30mm의 활성 버스트 액 제시 / 초를 사용 하였다. 임계 값은 최소 이동 활성 간주 결정하고 요구 수준은 버스트 활성을 고려 (소 활성으로하지만 버스트 activi 이하 활동 분류를 허용 할타이 임계 값)과 버스트 활동 임계 값보다 큰 (대) 운동. 임계 값 분석은 특정 물고기 균주의 활동에 따라 변경 될 수 있습니다. 주 : 분석은 어느 밝거나 어두운 조건에서 수행 될 수 있지만, 제브라 유충 암 (18)에보다 적극적으로 도시되어있다. </li><li> &quot;매개 변수&quot;에서 &quot;빛 운전 설정&quot;버튼을 클릭하여 0 %에있을 챔버 내부의 빛의 강도를 설정 드롭 다운 메뉴. 결과 대화 상자에서 필요한 조명 설정을 추가합니다. 참고 : 챔버 내부의 빛의 강도는 유충의 활동을 자극하는 테스트 시간 동안 ON과 OFF 설정하는 트리거 될 수 있습니다 </li><li> 녹화 실의 문을 닫고 비디오 녹화를 시작합니다. </li></ol></li><li> 수영 동작의 정량화 <ol><li> 실험이 완료되면 &quot;실험&quot;에서 &quot;중지&quot;를 클릭 드롭 다운 메뉴. 대화 보모든 결과에 X가 표시됩니다. </li><li> &quot;를 포함하는 폴더 열기&quot;에 엑셀 클릭으로 이러한 결과에 액세스하고, 생성 된 폴더에 표시되는 엑셀 파일을 엽니 다. 중요한 매개 변수 &quot;smlct&quot;(작은 운동 횟수), &quot;larct&quot;(대형 이동 카운트), &quot;smldist&quot;(작은 움직임에 물고기에 의해 덮여 총 거리)와 &quot;lardist&quot;큰 움직임의 물고기에 포함 (총 거리입니다 ). 주 : 기록 다음은, 소프트웨어는 또한 10- 동안 운동의 시각적 표현을 포함하고 .PNG 이미지 파일 ((10 분의 기록 화상을 포함)을 아비 파일의 형태로 두 개의 추가 출력 파일을 리턴 분 실험도 2 참조). </li><li> 운동 값이 계산되면 정확하게 계산 된 운동 값이 물고기의 수영의 움직임을 묘사 여부, (그림 참조 검토 할 .AVI 및 .PNG 파일을 재생3). 주 : 여기에 기술 된 소프트웨어를 사용하는 대신, 이러한 자유롭게 사용할 ImageJ에 소프트웨어와 같은 패키지가 locomotory 행동을 추적하기 위해 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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쥐, 개, 제브라 피쉬, 파리와 벌레 등 다양한 동물 모델은 근육 질환의 유전 및 분자 기초에 대한 우리의 이해를 향해 기여하고 대처하기 위해 치료 방법의 개발을 지원하고있다. 제브라 피쉬 근육 질환 연구를위한 몇 가지 장점을 자랑합니다. 제브라 피쉬는 시험 관내 배양 시스템에서 불가능 적합한 생리 환경에서 복잡한 근육 패턴을 평가하기 위해 유전자 조작 가능한 시스템을 제공한다. 다른 척추 동물 모델과 달리, 서로 광학적 투명도로 제조 물고기의 다수의 생체 내 화학적 및 유전자 선별 빠르고 높은 처리량을 용이하게한다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아시 근육의 성능을 평가하기 위해 높은 처리량 및 자동화 된 방법을 제공하는 제브라 이동 분석법의 개발을 기술한다. 모두 분석 것은 인정해야하는 일주기 리듬과외부 환경의 자극이 크게 zebrafish의 수영 동작 (17, 18)에 영향을 미칠 것입니다. 같은 제브라 피쉬의 반복 시험은 23 자극 촉감에 반응 감소의 원인이 습관화으로 이어질 것입니다. 따라서, 실험 간 재현성있는 결과를 각 지브라 피쉬 배아를 달성하기 위해 단지 일 및 조명 조건의 시간을 표준화해야 한번 검사 및 수온 조절 단단해야한다. 우리가 직접 근력에 비례 버스트 수영 작용하는 최대 가속도를 측정 할 수있는 DPF 터치를 사용하여이 분석에서 유발. 제브라 피쉬의 이전 기술 측정 전계 및 근육 (14)의 힘 - 생성 능력을 사용하여 자극 근육 수축 실험 장비 다음과 배아의 양단 매로 근력을 조사했다. 이 방법은 t의 용량을 생성하는 힘을 측정하는 동안그는 애벌레 근육이 수영하는 동안 애벌레 근육에 의해 생성 된 실제 힘을 측정하지 않습니다. 따라서 우리는 간접적 근육 상태의 전체 측정 값을 제공하기 위해 통상의 유충 수영 동작 중에 발생하는 힘을 평가하기위한 방법을 개발 하였다. 1000 프레임들의 프레임 레이트로 개별 지브라 피쉬의 움직임을 기록 할 수있는 고속 비디오 시스템은 / 초 눈하여 구별 할 수없는 근육 기능 작지만 상당한 차이를 식별하는 데 사용될 수있다. 그것은 전기 자극 힘 세대의 변화 수영 성능의 변화와 상관 관계를보고하는 방법 이전에보고 관심이 될 것입니다. 또한 터치 응답 분석도 locomotory 동작의 정량적 측정을 제공하기 위해, 예를 들면 수영장 모션 24시 본체 파의 형상 및 속도와 같은 수영 역학을 평가하는데 사용될 수있다 유발. 때문에 zebraf의 자발적인 운동틱 유충 3 DPF 후에는 근육 기능을 측정하는 터치 연상 분석을 수행 할 수 없었다. 반대로, 우리는 6 DPF에 제브라 유충 swum과의 거리를 결정함으로써, 장기간에 걸쳐 근육의 성능을 측정 하였다. 이 시험은, 근육 기능을 간접적으로 측정되지만, 생선 손상된 근육 퇴행 성능 8 25,26 표시를 식별 할 수있다. 이 테스트는 6 분 도보 테스트 유사한 측정을 제공뿐만 아니라 생체 내 약물이나 돌연변이 화면에 자동으로 높은 처리량에 적합뿐만 아닙니다.

지난 십년 동안 점점 제브라 근육 세포 생물학 및 질병을 연구하는데 사용되었다. 광학적 선명도와 결합 된 제브라 피쉬 배아의 급속한 외부 개발, 근육 형성, 성장, 그리고 기능의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 근육 발달의 과정은 매우 제브라에서 보존되고,이 근육 이영양증 근육 병증 선천성 1-8 포함한 근육 질환의 범위의 성공적인 모델링을 허용했다. 제브라 피쉬 모델의 상세한 검사는 이러한 조건의 병리 생물학에 새로운 통찰력을 제공뿐만 아니라 적절한 치료 6,9-13의 테스트를위한 플랫폼을 제공 한 사실이 없습니다. 근육 질환 제브라 모델의 분석은 근육의 성능을 측정하는 신뢰성 있고 재현 가능한 분석에 의존한다. 이전의 연구에 의해 성공적으로 DPF (3,7) 사이 물고기 제브라 피쉬 트렁크 근육 힘 생성 능력을 측정했다전기적 힘 전달 시스템 (14)에 부착 된 고정 물고기의 수축을 자극. 이 힘의 상세한 측정을 제공 할 수 있지만 이상적으로 높은 처리량 실험에 적합하지 않은 수영시 근육의 성능을 측정하는 장점이있다. 제브라 피쉬의 근육 DPF 2에서 완벽하게 작동하고 물고기는 자극에 반응 버스트 수영의 움직임을 유도 할 수 있습니다. 터치 연상 이탈 반응 분석법 수축력의 척도로 사용될 수 버스트 수영 운동시 가속을 측정하는 데 사용된다. 근육 병증 환자에서 근육 기능의 대부분의 활용 방법 중 하나는 총 거리가 하드 평평한 표면 (15, 16)에 걸어 기록 6 분 도보 테스트입니다. 우리는 전체 거리 swum과 모니터링함으로써, 제브라 유충 DPF 6 근육 기능을 측정하기 위해 비교 테스트를 적용하고 10 분 동안 각각의 유충에 의해 움직임의 총 수있다. 이 수행근육의 성능과 신뢰성이 높은 처리율 측정을 제공하는 자동화 추적 시스템을 사용. 두 근육 검사 재현성 있고 제브라 근병증 모델 팔 근육의 성능 차이를 정량화하는 데 사용되어왔다.

<table><tbody><tr><td>21 G x 1' 무딘 바늘</td><td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td><td>TE2125</td><td></td></tr><tr><td>48-웰 플레이트</td><td>Sigma</td><td>M8937</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 페트리 접시</td><td>Pacific Laboratory Products PT</td><td>S90001</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>Baumer</td><td>HXC20</td><td></td></tr><tr><td>http://www.randomization.com</td><td>N/A</td><td></td><td>단계 1.1.2, 2.1.3</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TEI-43L</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫</td><td>VWR</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>StreamPix5</td><td>NorPix</td><td></td><td>단계 1.2.3</td></tr><tr><td>온도 제어 장치</td><td>관점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋, 스타일 8</td><td>ProSciTech</td><td>T04-821</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox 시스템</td><td>관점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>뷰포인트</td><td></td><td>단계 1.3.1, 2.2.1</td></tr></tbody></table>

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish의 근육 발달은 매우 그들에게 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델을 만드는 포유류 시스템에 보존되어있다. 골격근의 기능에 영향을 미치는 많은 근육 병증 쉽고 빠르게 배아의 처음 며칠 제브라에서 평가 될 수있다. 24 시간 후 수정 (HPF)으로 야생형 제브라 피쉬는 자발적으로 자신의 꼬리 근육을 수축, 48 HPF, 제브라 피쉬 전시 제어 수영 행동으로. 주파수 감소, 또는 다른 변형이 이러한 운동은 골격근 기능 장애를 나타낼 수있다. 수영 동작을 분석하고 초기 제브라 피쉬 개발에 근육의 성능을 평가하기 위해, 우리는 모두 터치 유발 탈출 응답 및 운동 분석을 사용한다. 터치 유발 이탈 반응 분석은 고속 트 위치 근육 섬유의 수축으로 인한 짧은 버스트 동작시 근육의 성능을 평가하는데 사용될 수있다. 이 경우에는 수돗물이 외부 자극에 응답하여머리, 포스트 수정 (DPF) 2 일째 야생형 제브라 피쉬는 일반적으로 날카로운 회전과 함께 강력한 버스트 수영을 나타낸다. 우리의 방법은 가속도 근육 수축에 의해 생성 된 힘에 직접 비례하는, 버스트 수영 동작시의 최대 가속도를 측정함으로써 골격근 기능을 정량화한다. 반대로, 초기 제브라 유충 발달 동안 운동 분석은 근육 활동의 지속 기간 동안 근육의 성능을 평가하기 위해 사용된다. 수영 동작을 모니터링하는 추적 시스템을 이용하여, 자신의 골격근 기능의 반사 6 일된 제브라 활동 거리와 주파수의 자동 산출을 행한다. 수영 성능 측정은 질병 모델과 골격 근육 기능에 영향을 미치는 돌연변이 또는 화학 처리의 높은 처리량 검사의 표현형 평가 가치가있다.

터치 반응 분석이 근력의 비례 측정 속도 및 수영 운동의 가속도를 결정하는데 사용될 수있다 유발. 기계적인 자극에 대한 응답으로 같은 야생형 제브라 피쉬 전시 빠른 수영 동작 DPF 머리 2에 작은 탭있다. 비디오 캡처 개의 상이한 피쉬 근육 병증 모델을 분석 하였다 : (TG ACTA1 D286G-EGFP), 심각한 근육 약화를 갖도록 도시 된 네 말린 근병증의 모델, 중증 근육 결함 설명되었다 된 뒤 시엔 느 근이영양증의 모델 19, 20 DPF 5에서. 일반적인 터치의 영상의 이미지는 그림 1A에 표시됩니다 분석을 불러 일으켰다. 제브라 피쉬의 가속 시험 및 버스트 수영 탈출 응답 (그림 1B)의 첫 번째 0.2 초 이내에 피크에 발견되었다. 이 피크의 최대 가속 g 힘에 비례하는 측정 값을 제공한다골격 근육의 능력을 enerating. Tg는 (ACTA1의 D286G-EGFP) : 평균 276.0 ± 28.8 m / 초 2, N = 3 독립된 복제 실험으로서 = 최대 가속도 값은 각 균주에 대한 평균 최대 가속 값 (평균의 ± 표준 오차)을 얻었다 평균화 (15) 개별 물고기; 야생형 제어 : 평균 = 500.8 ± 50.28 m / 초 2, N = 15 개별 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD의 PC2 - / - 돌연변이 : 평균 = 249.9 ± 19.1 m / 초 2, N = 12-19 개별 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD의 PC2 +/- 이형 : 평균 = 235.9 ± 8.7 m / 초 2, N = 16-27 개별 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD PC2 + / + 야생형의 동형 접합체 : 평균 = 230.9 ± 8.7 m / 초 2, N = 8-27 개별 물고기 (그림 1C)를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험. 예상대로의 Tg (ACTA1의 D286G-EGFP) 물고기 마우스 모델 및 환자 데이터와 일치 8,21,22 감소 근육 기능을 나타내는 최대 가속도의 상당한 감소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 의 DMD PC2 - / - 돌연변이 물고기 그러나, 20 (도 1D), DPF (3)로부터 근육 결함의 검출과 일치,이 DPF에서의 최대 가속도에 차이를 보이지 않았다. 운동 분석은 근육의 성능의 지표로서 제브라 균주에 의한 활동 swum과 거리를 결정하기 위해 DPF (6)에서 수행 하였다. 테스트 후, 10 분 테스트 기간 동안 수영 운동의 도식적 표현은 각각 느리고 빠른 움직임의 기간을 나타내는 빨간색과 녹색 라인과 비 활동 기간 (그림 2)를 나타내는 검은 선으로, 생성되었습니다. oppos 같은 활동의 상대적으로 더 기간이 개인 야생형 제브라 피쉬 쇼 높은 활동에드 테스트 기간 (그림 2B)를 통해 저 활동의 Tg (ACTA1의 D286G의-EGFP) 물고기에. 수영 동작은 각 물고기 (도 3)로 이동 횟수와 거리 swum과의 각각의 값을 평균하여 정량 하였다. 모두의 Tg (ACTA1 D286G-EGFP) 물고기 (도 3a 및도 3b)와 DMD PC2 - / - 돌연변이 물고기 (도 3C 및 3D)는 각 비교 의하여 수영 이동 거리의 평균 수의 유의 한 감소가 나타났다 컨트롤 : Tg는 (ACTA1 D286G-EGFP) 물고기 : 운동의 의미 수 = 94.3 ± 13.6, 평균 거리 swum과 = 112.9 ± 18.4 mm, N = 45 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; 야생형 컨트롤 : 움직임의 수 = 177.4 ± 14.0 뜻을 의미 거리 swum과 = 300.2 ± 22.8 mm, n은 3 독립적 인 연구(45) 물고기를 포함 eplicate 실험; DMD의 PC2는 - / - 돌연변이가 : 거리 swum과 의미, 움직임의 수 = 163.3 ± 30.0 평균 : 298.4 ± 60.37 mm를, N = 12-20 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험; DMD의 PC2 +/- 이형 : 움직임의 평균 수 = ± 38.8 362.3, 거리 swum과 평균 : 660.3 ± 86.1mm N = 17-27 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험을; DMD PC2 + / + 야생형의 동형 접합자는 : 움직임의 수 = 341.9 ± 91.6 의미 = 574.3 ± 170.9mm n은 8-25 물고기를 포함하는 3 독립적 인 복제 실험 거리 swum과를 의미한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> 그림 1 :. 정량 제브라 피쉬 배아 DPF 2 응답 분석을 터치-연상 제어 제브라 피쉬의 (A) 스냅 샷 이미지를하는 동안 2 DPF에서 분석을 터치 보여주고 있습니다. (B) (A)의 제 0.2 초 동안 가속 프로파일하나의 Tg (ACTA1 D286G-EGFP) (빨간색)와 터치 자극의 응용 프로그램에 다음과 같은 단일 제어 (파란색) 제브라 피쉬. 최대 가속도는 점선으로 표시됩니다. (C, D) (C)의 Tg (ACTA1 D286G-EGFP) 제브라 피쉬의 터치 유발 응답 분석에서 기록 된 최대 가속도 (m / 초 2)의 정량 및 (D) DMD PC2 - / - 돌연변이 생선이 DPF에 제브라 대조군에 비해. 오차 막대는 3 복제 실험 ± SEM을 나타냅니다 * P &lt;0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> 그림 2 :. 제브라 피쉬 배아에 대한 운동 분석의 표현 (A) Zebrafish의 배아를 48 웰 플레이트에 배치되고, 운동은 적외선 디지털 카메라를 사용하여 상기에서 기록된다. 레드 라인은 느린 움직임 (소프트웨어에 입력 검출 임계 값에 의해 결정되는) 활동을 묘사 한 검은 선을 묘사 빠른 움직임, 녹색 라인을 묘사와 함께 테스트 기간 동안 제브라 피쉬 운동의 (B) 도식은. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> 그림 3 :. 제브라 피쉬 애벌레 DPF 6 운동 분석의 정량화 운동의 (A) 숫자의 정량화와 (B)의 Tg는에 의해 6 DPF에 제브라 피쉬를 제어 할 수 비교 (ACTA1 D286G-EGFP) 제브라 피쉬를 여행 거리.- / - 6 DPF에 제브라 피쉬 대조군에 비해 돌연변이 물고기의 움직임 (C) 수와 (D)의 정량은 DMD의 PC2에 의해 이동 거리. 오차 막대는 3 복제 실험 ± SEM을 나타냅니다 * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

얼룩말은 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 초기 배발생 동안 제브라피쉬는 규칙적인 근육 수축을 시작하여 리드미컬한 수영 행동을 일으키며, 이는 근육이 파괴될 때 변경됩니다. 여기에서는 근육 기능의 척도로서 수영 성능을 조사하기 위해 촉각 유발 반응 및 운동 분석에 대해 설명합니다.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

이 절차의 전반적인 목표는 촉각 유발 반응 및 수영 분석을 사용하여 제브라피시의 근육 성능과 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 제브라피시 질병 모델에서 손상된 근육 성능 또는 신경 퇴행성 결함을 식별하는 것과 같은 신경 근육 연구 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피시 병에 걸린 모델에서 근육 성능을 평가하기 위한 자동화된 고처리량 방법을 제공한다는 것입니다.분석을 수행하려면 약 25ml의 배아 배지로 채워진 페트리 접시를 약 섭씨 28도로 설정된 조명이 있는 온도 제어 스테이지에 놓습니다. 접시 위에 고속 카메라를 장착합니다. 비디오 녹화 소프트웨어를 실행하고 캡처 속도를 1, 초당 000 프레임으로 설정하여 빠른 수영 속도를 캡처 할 수 있도록합니다.배아를 field of view에서 명확하게 볼 수 있는 페트리 접시의 중앙에 배치합니다. Record(기록)를 누른 다음 머리 위에 뭉툭한 바늘로 배아를 부드럽게 터치하여 기계 감각 자극을 전달합니다. 배아가 시야 밖으로 헤엄쳐 나오거나 휴식으로 돌아오면 기록을 중지합니다.주로 동일한 유충에 대한 테스트를 반복하여 습관화하거나 일부 질병 모델에서 근육 약화를 촉진하여 촉각 자극에 대한 반응을 감소시키므로 각 배아는 한 번만 테스트해야 합니다. 수영 행동을 정량화하려면 소프트웨어를 실행하고 배경 빼기 모듈로 단일 유충 이동을 선택하여 AVI 비디오 파일을 엽니다. 메뉴 바에서 자유형 또는 폴리곤 도구를 선택하고 기계 감각 자극을 전달하는 데 사용되는 프로브를 제외하고 물고기의 원래 위치와 물고기가 헤엄치는 영역을 모두 포함하는 동영상 영역을 선택합니다.메뉴 표시줄에서 Experiment를 클릭하고 Execute를 선택합니다. 프롬프트에서 원시 데이터 분석 파일을 PHR 형식으로 원하는 위치에 저장합니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 분석을 시작합니다.물고기가 시야에서 헤엄쳐 나오거나 비디오 클립이 끝나면 실험 메뉴에서 중지를 클릭하여 분석을 마치면 결과를 표시하는 창이 나타납니다. 창 오른쪽으로 스크롤하여 최대 가속 값을 얻습니다. Results 드롭다운 메뉴에서 Export Instantaneous Results 버튼을 클릭하여 데이터를 내보냅니다.적절한 원시 데이터 분석 파일을 선택하고 클릭하여 엽니다. 이렇게 하면 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있는 대상 폴더에 텍스트 파일이 저장됩니다. 테스트 유충을 우물당 하나씩 48웰 플레이트에 넣습니다.다음으로, 거품이 없는지 확인하기 위해 우물 상단 바로 아래까지 우물에 물을 채웁니다. 접시를 섭씨 28도에서 1시간 동안 보관하십시오. 어둠 속에서 유충을 감지할 수 있는 적외선 디지털 카메라가 장착된 기록실에 플레이트를 놓습니다.일주기 리듬과 외부 환경 자극은 제브라피시 수영 행동에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 하루 중 시간과 조명 조건을 표준화해야 하고 수온을 엄격하게 조절해야 합니다. 소프트웨어를 실행하고 추적 모듈을 선택합니다.File(파일)에서 Generate New Protocol(새 프로토콜 생성)을 클릭하고 실험에 사용된 웰 수(이 예에서는 48개)를 편집합니다. 그런 다음 Parameters를 클릭하고 Protocol Parameters를 선택한 다음 Time을 선택하여 실험 기간과 통합 기간을 10분으로 설정합니다. 또한 Protocol Parameters(프로토콜 매개변수)에서 Options(옵션)를 클릭하고 numeroscope 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다.기록 영역을 설정하려면 전체 그리드를 강조 표시하고 웰 중 하나를 두 번 클릭합니다. Draw Areas 버튼을 클릭하고 왼쪽 상단, 오른쪽 상단 및 왼쪽 하단 우물 주위를 그리고 Build를 클릭합니다. 그런 다음 소프트웨어는 각 우물의 위치를 결정합니다.이 시점에서 스케일 바도 그리고 Apply to Group을 클릭합니다. 완료되면 Draw Areas 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 이 경우 검은색인 물고기의 색상을 선택하고 감지 임계값 표시줄을 배경 없이 물고기의 움직임만 강조 표시되는 수준으로 밉니다.Movement Thresholds(움직임 임계값)를 입력하여 비활성 및 작고 확대된 움직임을 감지합니다. 이 예에서는 초당 6mm의 비활성 임계값과 초당 30mm의 활동 버스트 임계값이 사용되었습니다. Parameters Menu(매개변수 메뉴)를 클릭한 다음 Light Driving(라이트 드라이빙) 설정을 클릭하고 챔버의 광도를 0%로 설정하고 레코딩 챔버 도어를 닫고 비디오 녹화를 시작합니다.실험은 화면의 타이머에 표시된 대로 10분 안에 완료됩니다. 완료되면 실험 드롭다운 메뉴를 클릭하고 중지를 선택합니다. 결과가 포함된 대화 상자가 표시됩니다.Excel을 사용하여 결과를 검사하려면 상위 폴더 열기를 클릭하고 결과 폴더에 나타나는 파일을 엽니다. 마지막으로, 비디오를 재생하여 기록된 운동 값이 물고기의 수영 움직임을 정확하게 묘사하는지 검토할 수 있습니다. 이는 비디오 파일에서 관찰된 움직임을 소프트웨어에서 생성된 이동 프로파일과 비교하여 달성할 수 있습니다.터치 유발 분석 중에 촬영된 제브라피시 배아의 스냅샷 이미지는 자극 적용 후 처음 0.2초 동안 개체의 일반적인 움직임을 보여줍니다. 여기에서 그림은 야생형 대 근병증 개체에서 버스트 수영 탈출 반응의 처음 0.2초 동안의 가속 프로파일을 보여줍니다. 가속도는 이 기간 동안 두 변형 모두에서 최고조에 달하는 것으로 보였으며 최대 가속도는 골격근의 힘 생성 능력에 비례합니다.최대 가속도 값은 야생형 및 근병성 균주에 대해 평균화되었습니다. 근병증 물고기는 최대 가속도가 현저히 감소하여 근육 기능이 감소했음을 나타냅니다. 배아의 10분 이동 분석은 야생형 배아와 근병성 배아의 움직임 패턴과 유형을 기록하고 수영 움직임을 도식화하여 표현했습니다.녹색 선으로 표시되는 느린 이동 기간과 빨간색 선으로 표시되는 빠른 이동 기간뿐만 아니라 검은색 선으로 표시되는 비활성 기간도 매핑되었습니다. 야생형 개인은 테스트 기간 동안 덜 활동적인 근병증 개인과 대조적으로 상대적으로 비활동 기간이 없는 높은 활동 수준을 보였습니다. 이것은 야생형 어류와 근병증 어류의 평균 이동 횟수와 이동 거리의 상당한 차이에 반영되었습니다.마스터가 완료되면 15마리의 물고기에 대해 15분 안에 터치 유발 반응 분석을 수행할 수 있으며 최대 48마리의 물고기에 대해 약 10분 안에 운동 분석을 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아의 활동에 영향을 미칠 수 있으므로 배아를 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 근육 병리학과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 면역 표지 또는 전자 현미경과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 초기 제브라피시 발달에서 근육 성능을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

이 비디오는 터치 자극에 대한 제브라피시 유충의 반응을 측정하는 터치 유발 반응 분석에 대해 설명합니다.

탈출 반응 분석: 접촉 자극에 대한 제브라피시 유충의 반응을 연구하는 방법

이 비디오는 제브라피시 유충의 회피 및 도둑 모타시스 분석을 설명합니다. 이 비디오는 시각적 혐오 자극에 반응하는 제브라피시 유충의 행동을 조사합니다.

제브라피시 회피 및 티그모타시스 분석: 혐오스러운 시각적 자극에 대한 반응으로 유충의 행동을 조사하는 고처리량 방법

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

힘의 측정은 개발, 부상, 질병, 치료 또는 화학 물질의 독성에 의한 근육 기능의 변화를 보여주기 위해 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 최대 수축시 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

제브라피시는 이제 근이영양증, 선천성 근병증 및 관련 신경근 질환을 모델링하기 위한 확립되고 강력한 도구입니다. 복굴절(Birefringence)과 촉각(touch-hoked) 탈출 행동은 초기 발달 과정에서 제브라피시 배아의 근육 무질서 및 기관차 손상 정도를 결정하는 데 사용되는 두 가지 일반적인 비침습적 분석법입니다.

복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

척수 손상 후 기능적 회복이 가능한 성인 제브라피쉬는 신경 재생의 선천적 메커니즘을 밝히는 최고의 모델 시스템입니다. 여기에서는 수영 지구력과 수영 행동 분석을 척수 재생의 기능적 판독으로 설명합니다.

성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

학습하세요 터치 유발 대응 및 수영 분석을 사용하여 Danio rerio의 근육 기능을 평가하는 방법을. 이 기법은 신경근육 질환 모델에서 근육 성능을 자동화된 고속 처리로 분석하여 연구자들이 질병 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

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