캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

이 기술의 전반적인 목표는 전혈에서 생존 가능한 순환 종양 세포 또는 CTC를 효과적으로 포착하는 것입니다. 이러한 CTC는 배양에 넣거나 고정되지 않은 샘플이 필요한 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 질병 진행, 치료에 대한 반응을 추적하고 재발 위험을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 바이오마커 발현과 독립적으로 유지하면서 모든 고형 종양에서 생존 가능한 CTC를 표지 없이 캡처할 수 있다는 것입니다. 우리는 처음에 필터에서 CTC를 방출하는 아이디어를 떠올렸는데, 그 이유는 CTC를 필터에서 현장에서 배양하는 대신 다운스트림 RNA 분석과 CTC 배양을 수행하기를 원했기 때문입니다.

실험을 시작하려면 부탄올이 포함된 15ml 튜브에 부피당 10% 무게의 용액을 준비하기에 충분한 PIPAAm의 무게를 잰다. 용액이 깨끗해질 때까지 튜브를 소용돌이치십시오. 다음으로, 가위로 플라스틱 현미경 슬라이드를 약 12mm x 12mm 정사각형으로 자릅니다.

그런 다음 날카로운 직선 모서리 가위를 사용하여 슬롯 포어 마이크로 필터 웨이퍼를 8mm x 8mm 정사각형으로 자르고 이 조각을 플라스틱 사각형에 직접 놓습니다. 폴리이미드 필름 테이프를 사용하여 절단된 필터를 필터의 가장자리와 모서리에만 플라스틱 사각형에 고정하여 적어도 7mm x 7mm 필터 영역이 테이프로 덮이지 않도록 합니다. 플라스틱 사각형에 고정된 마이크로 필터를 스핀 코터의 진공 척에 놓습니다.

스핀 코터를 다음 레시피로 프로그래밍합니다. 그런 다음 표준 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 마이크로필터 표면을 완전히 덮고 스핀 코팅기를 시작할 수 있도록 부피당 10% 중량의 PIPAAm 용액을 충분히 분배합니다. 코팅이 완료된 후 스핀 코팅기에서 PIPAAm 코팅된 마이크로필터를 제거하고 보관 중에는 필터를 플라스틱 사각형에 부착된 상태로 둡니다.

필트레이션 카세트 어셈블리로 이동하여 마이크로 필터를 페트리 접시에 넣어 PIPAAm 코팅된 마이크로 필터를 실온에서 재수화합니다. 마이크로 필터가 완전히 잠길 때까지 1X PBS를 추가합니다. 수화 단계 후 필터에서 폴리이미드 필름 테이프를 벗겨내거나 절단하여 플라스틱 사각형에서 필터를 분리합니다.

다음으로, 개스킷 역할을 하는 PDMS 조각을 따라 상단 및 하단 아크릴 조각 사이에 마이크로 필터를 끼워 마이크로 필터를 여과 카세트에 조립합니다. 그런 다음 클립으로 아크릴 카세트를 고정하여 필터를 단단히 고정하여 단단히 밀봉합니다. McCoy의 세포 배양 배지 3 밀리리터를 섭씨 37도까지 가열합니다.

7.5ml의 혈액 샘플에 7.5ml의 Hank's balanced salt solution 또는 HBSS를 넣고 이 희석된 혈액을 25ml 주사기에 흡인합니다. 카세트 상단을 확인한 후 여과 카세트를 주사기와 맞물려 주사기 펌프에 놓습니다. 주사기 펌프를 시간당 75밀리리터 유속으로 설정합니다.

바닥에 50ml 튜브를 놓아 흐름을 수집하고 펌프를 시작합니다. 여과가 완료된 후 여과 카세트를 분리하고 어느 쪽이 PIPAAm 코팅 표면에 세포가 걸렸는지 확인합니다. 따뜻한 배양 배지 1ml를 새 주사기에 흡입합니다.

다시 한 번, 카세트의 상단을 결정한 다음 여과 카세트를 매체가 들어 있는 주사기와 다시 맞물리고 필터의 PIPAAm 코팅 표면이 주사기에서 반대쪽을 향하도록 카세트의 하단 끝을 맞물립니다. 그런 다음 주사기를 주사기 펌프에 다시 놓고 여과 카세트 바로 아래에 6개의 웰 플레이트를 잡습니다. 유량을 설정하고 펌프를 시작하십시오.

모든 매체를 필터에 통과시키고 페트리 접시에 흐름을 수집합니다. 모든 매체가 통과할 때까지 기다린 다음 펌프를 중지하고 펌프에서 주사기와 여과 카세트를 제거합니다. 그런 다음 주사기에서 여과 카세트를 분리하고 열어 카세트에서 필터를 회수합니다.

PIPAAm 표면이 아래를 향하도록 필터를 모공에서 세포를 분리할 때 역류를 수집하는 데 사용되는 것과 동일한 페트리 접시에 놓습니다. 나머지 따뜻한 배지를 추가하고 페트리 접시를 섭씨 37도로 설정된 배양 인큐베이터에 넣습니다. 카세트에서 필터를 회수한 후에는 셀이 아래를 향하도록 플레이트에 넣고 필요한 경우 미디어에서 부드럽게 흔들어 셀이 필터에서 분리되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

배양에서 24시간 후 집게를 사용하여 마이크로 필터를 조심스럽게 제거하고 필터를 폐기합니다. 적혈구와 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 1000 마이크로 리터 피펫으로 부드럽게 재현탁합니다. 적혈구와 PBMC를 재현탁할 때 CTC가 피펫팅되지 않도록 매우 부드럽게 하는 것이 중요합니다.

재부유한 적혈구 및 PBMC를 포함하는 전체 배지를 조심스럽게 제거하고 부착된 암세포는 남기고 세포를 섭씨 37도로 예열된 새로운 배지로 대체합니다. CTC 생존 가능성 평가를 진행합니다. 배양된 암세포가 급증한 건강한 기증자의 혈액을 사용하여 생존 가능한 순환 종양 세포 또는 CTC를 방출하는 열 반응 기술은 각각 94%82% 및 77%의 포획, 방출 및 회수 효율을 달성했습니다.

코팅되지 않은 필터의 분리 및 회수 효율은 현저히 낮았습니다. 혈액으로 스파이크가 발생하기 전과 방출 후의 세포 생존력을 평가하기 위해 살아있는 사체 분석이 수행되었습니다. 세포는 방출 후에도 생존 가능한 상태를 유지했으며 배양에서 빠르게 확장되었습니다.

SKBr-3 세포는 PIPAAm 코팅된 슬롯 필터에 의해 혈액에서 추출되어 48웰 플레이트에 도금되었습니다. 배양에서 16시간이 지나면 종양 세포가 플레이트 바닥에 정착한 저장성 적혈구 및 백혈구와 함께 배양 플레이트에 부착됩니다. 세척 후 비부착성 세포는 플레이트에 부착하는 종양 세포만 남기고 제거되었습니다.

동일한 필터를 고정 세포 캡처에 사용할 수 있으며, CTC의 열거 및 분자 특성화를 통해 암의 진행을 추적하고 암 관리를 개선할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 CTC 분야의 연구자들이 이러한 세포의 기능적 특성을 규명하는 동시에 맞춤형 의학을 향한 한 걸음을 내딛는 동시에 미래의 약물 표적을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.