Name: 캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 PIPAAm 코팅 마이크로필터를 이용해 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포(CTC)를 포착하고 방출하는 방법을. 이 기술은 전이 연구와 질병 진행 모니터링에 활용됩니다.

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이 작업을 지원하기 위해 혈액 샘플을 기증한 모든 환자에게 감사드립니다. 임상 검체 확보에 도움을 주신 Guiseppe Giaconne 박사, Ritesh Parajuli 박사 및 Marc E. Lippman 박사와 통찰력 있는 토론을 해주신 Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner 박사, Toumy Guettouche, Diana Lopez 박사에게 감사드립니다. Zheng Ao는 실베스터 종합 암 센터(Sylvester Comprehensive Cancer Center)의 Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology의 부분적인 지원과 도움에 감사드립니다.

윤리 정책 : 인체의 권리를 보호하기는 혈액 샘플은 IRB 20,150,020 아래 마이애미 기관 생명 윤리위원회의 대학 승인 프로토콜 아래에 동의 다음 얻었다. 주 : CTC 캡쳐 필터링 혈액 응고를 방지하기 위해 EDTA 튜브에 수집한다. 1. 폴리 (N-이소 프로필 아크릴) (PIPAAm)와 마이크로 필터 코팅 <ol><li> 부탄올 10 % w / V 수용액을 제조 PIPAAm을 단다. 용액이 깨끗해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 컷 플라스틱 현미경은 가위 또는 날카로운 블레이드 한 쌍의 대략 12mm X 12mm 사각형 하나에 슬라이드. 또는 단두대를 사용합니다. 주의 : 이러한 사각형 스핀 코팅 과정 동안 필터 홀더로서 기능한다. </li><li> 직선 가위의 날카로운 쌍을 사용하여, 8mm X 8mm 사각형으로 슬롯 기공 마이크로 웨이퍼를 잘라. </li><li> 플라스틱 SQUA에 컷 필터를 확보 폴리이 미드 필름 테이프를 사용하여입술 이전 단계 1.3에서 잘라. 필터 영역의 최소 7mm X 7mm가되지 않은 덮인 테이프가되도록 단지 가장자리와 필터의 코너로 필름을 적용합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54435/54435fig2.jpg" /> 그림 2 :. PIPAAm 코팅 8mm × 8 밀리 마이크로위한 마이크로 필터 세트 업의 대표적인 그림은 플라스틱 현미경 슬라이드에서 12mm X 12mm 플라스틱 사각 컷에 위치한다. 폴리이 미드 테이프를 참조 (15)의 허가 코트에게 PIPAAm.Reproduced 스핀 장소에서 마이크로을 확보하는 데 사용됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54435/54435fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="5"><li> 스핀 코터의 진공 척에, 플라스틱 광장에 고정 된 마이크로 놓습니다. </li><li> 시작, 10 초 동안 500 rpm으로, 6000 R : 다음 조리법에 스핀 코터 프로그램60 초, 10 초, 정지 500 RPM에 대한시. </li><li> PIPAAm 용액 V 완전히 표준 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 마이크로 표면을 커버하고, 스핀 코터를 시작 (1.1 제조) / w 10 %만큼을 분배. </li><li> 코팅 처리 종료 후, 스핀 코터에서 코팅 PIPAAm 마이크로 제거. 보관시 플라스틱 광장에 부착 된 필터를 둡니다. 주 : 코팅 된 필터는 최대 3 개월 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol> PIPAAm 코팅 마이크로 필터 여과 카세트 2. 총회 <ol><li> 여전히 페트리 접시에 플라스틱 광장에 고정 된 마이크로 필터를 배치하여 실온에서 PIPAAm 코팅 된 마이크로을 재수. 마이크로 필터가 완전히 침수 될 때까지 1X PBS를 추가하고 5 분 동안 서 보자. </li><li> 수화 공정 후에, 가위의 쌍을 사용하여 폴리이 미드 필름 테이프를 절단하여 사각형의 플라스틱 필터를 해제. 참고 :이 필터의 어느 쪽을 기록해 둡니다PIPAAm 코팅. </li><li> 2 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 개는 개스킷 / 밀봉 역할과 함께 상하 아크릴 부재 사이의 마이크로 필터를 개재하여, 여과 카세트에 마이크로 필터를 조립한다. 필터를 확보하고 꽉 밀봉을 제공하는 클립 아크릴 카세트를 클램프. 주의 : 샘플을 통해 여과 될 때, 세포 필터 (도 1)의 표면에 도포 PIPAAm 캡처한다 있도록 PIPAAm 코팅을 위쪽으로 향하게한다. </li></ol> 마이크로 필터에서 캡처 및 CTC의 출시와 혈액 샘플 3. 여과 <ol><li> 각 주사기 펌프 브랜드가 자신의 사용자 인터페이스를 가지므로, 펌프의 사용자 매뉴얼을 참조 75ml / 시간의 속도로 유동하고 20 ㎖의 부피를 설정 주사기 펌프를 프로그래밍. </li><li> 맥코이 (상업적으로 입수 할 수 있음) 세포 배양액의 따뜻한 3 ㎖를 37 ℃까지 (10 % 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신에 첨가하여 제조 됨). <li> 7.5 ml의 혈액 샘플에 시판 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 7.5 ML을 추가하고 25 ML의 주사기에이 희석 된 혈액을 대기음. 1 희석 혈액 10 ml를 사용하는 경우, 하나를 달성하기 위해 10 ㎖의 HBSS의 동량 혼합 HBSS 예 1 :. 주 : 혈액 샘플 (1)의 동일 부피로 희석되도록 HBSS의 볼륨을 조정한다. </li><li> 주사기와 여과 카세트를 참여하고 주사기 펌프에 배치합니다. 을 통해 흐름을 수집하고 펌프를 시작하기 위해 바닥에 50 ML 튜브를 놓습니다. 참고 : 여과 대략 10 - 12 분 소요됩니다. 모든 여과 단계를 수행하여야단계 3.8를 포함하여 상온 (20 ~ 25 °에 C)에서 아웃 </li><li> 여과가 완료되면, 어느 측 PIPAAm 코팅 표면에 잡힌 셀이 상위 인 여과 카세트 촬영 주 분리. 기음 새로운 주사기에 따뜻한 배양 배지 1 ㎖. </li><li> 매체를 포함하는 주사기 여과 카세트를 다시 결합하는 -하지만, 필터의 PIPAAm 도포면이 얻어 주사기에서 향하도록이 때 카세트의 하단부를 결합. 주 :이 완만 역방향 흐름을 적용하여 슬롯 구멍에 삽입 될 수있는 셀을 분리하는 것이다. </li><li> 다시 주사기 펌프 위에 주사기를 놓고 오른쪽 여과 카세트에서 작은 페트리 접시 또는 6 웰 플레이트를 개최합니다. 100 ㎖ / 시간의 유량을 설정하고 펌프를 시작한다. </li><li> 필터를 통해 모든 미디어에 전달하고 플로우를 통해 배양 접시를 수집합니다. 모든 미디어가 통과하는 기다린 후 펌프를 중지하고 주사기 a를 제거펌프에서 차 여과 카세트. </li><li> 주사기에서 여과 카세트를 분리하고 카세트에서 필터를 검색 할 수 엽니 다. PIPAAm 표면이 구멍에서 세포를 해제 할 때 역류를 수집하는 데 사용되는 동일한 배양 접시에 아래를 향 필터를 놓습니다. 따뜻한 매체의 나머지 부분을 추가하고 37 ° C로 설정 문화 인큐베이터로 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 30 분 후 모든 셀 필터에서 발표 될 예정이다. 그러나, 모든 세포는 분리하기 위해 최대 24 시간 동안 배양 접시에 필터를 둡니다. 참고 : 또는 방출 된 세포가 microcentrifuge 관에 수집되는 몇 가지 예를 이름을 같은 PCR, ELISA, 웨스턴 블롯으로 더 하류 분석을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 문화 24 시간 후, 신중하게 집게를 사용하여 마이크로를 제거합니다. 참고 : 필터는이 시점에서 폐기 될 수 세포가 그것에서 출시 된있다. </li><li> 부드럽게과 1000 &amp; #을 사용하여 아래로 배지를 피펫(181), 리터 피펫, 적혈구와 다시 중단에 말초 혈액 단핵 세포 필터에 포착하고 CTC와 함께 접시에 출시 (PBMC). 느슨하게 연결된 암 세포를 분리하지 않도록 신중하고 조심스럽게이 작업을 수행합니다. 조심스럽게 새로운 배지 예열을 37 ° C로 부착 된 암 세포와 대체 남기고 중에 재현 탁 적혈구와 PBMC를 포함하는 모든 매체를 제거한다. 참고 : 과도한 적혈구 하나의 세척 후 존재하는 경우이 단계를 한 번 반복 할 수 있습니다. </li></ol> 4. CTC 생존 능력 평가 <ol><li> 라이브 / 죽은 분석 (8)을 사용하여 배양 CTC의 생존 능력을 평가합니다. 참고 : 다수의 라이브 / 죽은 분석은 시판되고있다. 제조 업체의 프로토콜에 따라하는 것이 매우 좋습니다. 이 실험에 사용 된 상업 분석 키트에 대한 자료 / 시약 목록을 참조하십시오. </li></ol>

<ol><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Response+to+Chemotherapy+in+Metastatic+Breast+Cancer%3A+SWOG+S0500%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500.</a> J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).</li>
<li>Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cellular+sample+preparation+using+a+Centrifuge-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip.</a> Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).</li>
<li>Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (179), 179(2013).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Based+Isolation+of+Circulating+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Microcavity+Array+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System.</a> PLoS ONE. 8 (6), (2013).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinched+flow+coupled+shear-modulated+inertial+microfluidics+for+high-throughput+rare+blood+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation.</a> Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).</li>
<li>Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+label+free+biochip+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients.</a> Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li>
<li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li>
<li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+pathology%22%5BJournal%5D)">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li>
<li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li>
<li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture%2C+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PHT%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li>
<li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+%28CTCs%29+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li>
<li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li>
<li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).</li>
<li>Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+polymeric+surfaces%3B+control+of+attachment+and+detachment+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Makromol.+Chemie%2C+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells.</a> Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).</li>
<li>Deng, Y., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci. Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li>
<li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer%3A+a+retrospective+study+in+107+patients%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403(2015).</li>
</ol>

이 저작물의 일부는 미국 임시 특허 출원 번호 62/219,808에 따라 보호됩니다. Siddarth Rawal은 이 기사에 사용된 필터 및 필터 카세트/카트리지를 상업적으로 생산하는 Circulogix Inc.의 주주입니다.

전혈에서 가능한 CTC 캡처 및 마이크로 그들을 해제 과정은 비교적 간단하다; 그러나 몇 가지 중요한 점은 언급 할 가치가있다. 이 멸균 상태가 전체 프로세스를 통해 유지되는 모든 세포 배양과 마찬가지로 필수적이다. 필터로부터 세포를 해제하는 방법의 기초가 PIPAAm의 온도 감응 계면 성질을 이용을 기반으로 PIPAAm으로 필터를 코팅의 초기 단계는 매우 중요하다. 필터는 효과적으로 피복되어 있도록 코팅 전에 현미경 필터상의 구멍 (슬롯 구멍의 폭과 길이)의 크기를 측정 후, 다시 공경 포스트 코팅을 측정합니다. 기공 크기는 폭과 길이 (도 4)에 모두 1 ㎛로 감소되어야한다. 언급 한 바와 같이, 효율적으로 캡처하면서 CTC 슬롯 필터도 있지만 이들 세포 비 접착 세포 따라서 두리 있으며, 일부 큰 PBMC 세포를 포착NG 단계 3.13는 부착 암 세포의 뒤에 떠나는 문화 (그림 5)에서 제거됩니다. 점도가 매우...

전이성 질환은 대부분의 암 사망에 대한 책임이 있습니다. 전이에 대한 예후 및 동반자 진단 바이오 마커의 개발은 암 관리 및 치료에 매우 중요하다. 순환 성 종양 세포 (CTC)를 보급 종양 및 전이에 중요한 역할을 담당한다. 또한, &#39;액체 생검&#39;바이오 마커로 쉽게 접근 할 수있는, 암 환자에서 CTC 암 바이오 마커 연구를위한 온상 &#39;&#39;말초 혈액은으로 증가하고있다 &#39;. 3 - CTC 잘 유방암, 전립선 암과 대장 암 1 등 다양한 암 설정에서 예후 바이오 마커로 확인되었다. 그러나, CTC 분야에서 최근의 발전은 중재 임상 4에 도시 된 바와 같이, 이러한 희귀 세포의 단순한 열거, 임상 적 유용성을 제한 것을 지시 하였다. 따라서, CTC의 분자 및 기능 특성 수 있도록 기술에 대한 신흥 필요가있다. 현재, 몇 가지 기술은 fo를 허용하는 존재R 비 항원 바이어스, 가능한 캡처 및 CTC의 방출, 강력한 다운 스트림 분자 및 기능 분석 5,6을 가능하게한다. 이러한 미세 소자의 대부분은 마이크로 유체 플랫폼에 결합되고, 따라서 2-4 ml의 7 내지 그 처리 할 수있는 혈액의 양에 제한 요소가있다 - 10. CTC 크게 캡처 관심이 세포 분리의 가능성을 방해하므로 상기 피 처리 수의 양을 줄일 채혈 (7.5 ㎖)의 단일 튜브 희귀 이벤트이다. 우리는 더 큰 종양 세포와 작은 정상 혈구 세포 (11, 12) 사이의 크기 차이를 이용 CTC의 캡처 파릴 렌 C 막 마이크로 디바이스의 두 가지 유형을 개발 하였다. 우리는 이전에 둥근 구멍 열거 필터보고 및 마이크로은 CTC 포착 효율이 우수한 것으로 도시 된 FDA 승인 플랫폼과 비교 한암 환자의 혈액 샘플 13, 14합니다. 다만, 원형 필터의 한계를 여과 전에 포름 알데히드 계 고정 제를 사용할 필요가있다. 이 프로세스는이를 여과 과정 전단 응력 및 압력을 견딜 수 있도록하면서 세포 형태를 보존한다. 열거 분자 연구가 온 - 칩 (13)을 수행 할 수 있지만, 정착액 기능적 특성화를 수행하는 능력을 손상시킨다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여과 전에 셀 (도 1)를 고정 할 필요성을 부정 슬롯 기공 필터를 개발했다. 슬롯 구멍 형상 (6 μm의 폭 × 40 μm의 길이 슬롯 구멍)은 단지 부분적으로 또 다른 혈액 세포 자유로운 통과를 허용하고 세포 손상을 초래할 것이다 압력 상승을 완화 따라서 세공 폐색하면서, 종양 세포를 포착 할 수 있도록 및 최종 버스트 15,16 슬롯 기공 카트리지는 샌드위치 2 아크릴 조각으로 구성된다개스킷 등의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 작용과 상부 및 하부 부분들 사이의 슬롯 기공 필터는 누수 방지 시일 (14, 15) (도 1)를 제공한다. 슬롯 구멍 필터의 포집 효율이 높은 반면, (표 1), 촬상 CTC 대신 접착 15 매개 된 세포 외 기질 (ECM)의 강한 비특이적 정전 기적 상호 작용에 의해 파릴 렌 C 막에 결합된다. 이러한 역류 또는 세포 스크레이퍼를 사용하는 등의 방법 효과적으로 필터에서 세포를 분리, 또는 세포 손상 및 세포 사망을 초래할 실패합니다. 우리는 릴리스 전략 (15)을 수립하는 PIPAAm의 자유로운 사용을 탐험했다. PIPAAm 32 °의 용액 온도 17 C 가역적 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 상전이 중합체이다. 전통적으로, PIPAAm의이 속성을 널리 조직 공학 응용 프로그램에 대해 탐구하고있다. 일반적으로 세포는PIPAAm에서 배양 PIPAAm은 소수성 인 경우 37 ℃에서 표면을 코팅. 배양 온도는 PIPAAm 코팅면 (17, 18)이된다 수화 32 ° C, 아래로 시프트 될 때 세포를 시트로 분리 될 수있다. 우리는 실온 (아래 32 ° C)에서 여과 공정을 수행 한 후 37 ° C로 유지 배지에 필터를 배치하여 세포 분리를 가능하게함으로써 열 특성을 이용. 이 온도에서, PIPAAm 중합체 층함으로써 정전 결합 된 셀 (15) (도 1)를 개방, 소수성이된다. 온도 감응 방법뿐만 아니라 다른 방법들이 성공적 19 생존 CTC 캡처를 달성하고 방출하도록 구현하였으나 -보고 된 이러한 기술이 공유 21 번 키 잠재적 인 결점들은 모두 CTC 캡쳐 항원 - 의존적 원리를 채용한다는 것이다. 항원 기반 CTC 캡처, 그림과 같이 페이지reviously, 바이어스 CTC 분석 11,14 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 선호도 기반 기술은 CTC 캡쳐는 EpCAM 결합 된 항체를 사용한다. 그러나, CTC는 이러한 기술로는 EpCAM 저와는 EpCAM 부정적인 CTC의 누락에지도는 EpCAM의 다양한 수준을 표현하는 것으로 나타났다. 비 상피 기원에서 CTC는 흑색 종 및 육종 설정에서 같은 CTC 같은 관심의 경우 또한 제한이 발생할 수 있습니다. 따라서, 항원 기반 캡처에 의해 도입 된 잠재적 인 편견없이 실행 가능한 CTC 캡처 및 출시 할 수있는 기술은 매우 바람직하다. 중요하게는, 마이크로 캡쳐 디바이스는 순수 기초 크기 및 분리 전략은 특정 표면 마커의 존재에 무관하다. 우리는 PIPAAm 코팅 된 마이크로의 고용 효과적이고 효율적으로 캡처 및 다운 스트림 분석을 위해 CTC를 해제 할 수있는 기능을 제공함으로써, 전이성 과정에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. 강력한이 5 월ially 쉽게 모니터링하고 암 환자 관리에 도움 될 수있는 바이오 마커를 제공하기 때문에 새로운 타겟 전신 치료가 아니라 감독 할 수있는 새로운 분자를 노출합니다.

<table><tbody><tr><td>슬롯 필터</td><td>Circulogix Inc.</td><td>혈액 또는 소변에서 CTC를 여과하기 위해</td> <td>MSF-01</td> 다양한 크기의 필터 사용 가능 (www.circulogixinc.com)</tr><tr><td>폴리(N-iso-프로필아크릴아미드) (PIPAAm)&nbsp;</td><td>Ploysciences Inc.</td><td>21458</td><td>비위험. 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>1- 부탄올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>B7906</td><td>통풍이 잘되는 곳에서 사용</td></tr><tr><td>플라스틱 현미경 슬라이드</td><td>Cole-Parmer</td><td>48510-30</td><td>8mmx8mm 필터 사각형을 담을 수있는 베일 경우 모든 플라스틱 슬라이드 또는 모든 종류의 사각형 (금속, 아크릴 등)을 사용할 수 있습니다.</td></tr> 스핀 <tr><td>코터</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>SCS G3 스핀 코터</td><td>기기</td></tr><tr><td>폴리이 미드 테이프</td><td>Uline</td><td>S-7595</td><td>폴리이미드는 여러 공급업체(Amazon, Kaptontape.com)에서 구입할 수 있는 Kapton 테이프의 일반 이름입니다</td></tr>.<tr><td>HBSS- Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri Dishes 35 x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Microfilter Cassette</td><td>Circulogix Inc.</td><td>FC-01</td><td>맞춤형 카트리지는 혈액 또는 소변에서 CTC를 위한 여과에 기반하여 사용할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>주사기 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>KD 과학&nbsp;</td><td>78-0100V</td><td>25ml 주사기를 담을 수 있는 모든 주사기 펌프를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Cellstar 50ml 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>82050-322</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio One 6 웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>89131-688</td><td>표면이 세포 접착과 호환되고 기피제가 아닌 한 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>SKBR3 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>Live Dead Assay</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>살아있는 세포를 평가하기 위한 합리적인 분석을 제공할 수 있는 모든 분석은</td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>VWR</td><td>98000-368</td><td>세포 배양에 사용할 수 있는 모든 인큐베이터로 충분합니다</td></tr>.</tbody></table>

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

우리는 다운 스트림 분석 및 / 또는 문화 칩에서 이러한 세포의 출시와 함께, 전체 혈액에서 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 크기를 기반으로 캡처하는 방법을 보여줍니다. 전략은 CTC CTC 및 캡처의 thermoresponsive 가능한 릴리스 코팅 폴리 (N--iso 프로필 아크릴) (PIPAAm)를 캡처하는 신규 파릴 렌 C 막 슬롯 마이크로 기공의 사용을 이용한다. 생균의 촬영은 일반적으로 여과 공정과 관련된 전단 응력을 줄이기 위해 특정 치수를 갖는 슬롯이 기공 구조의 설계를 활용하여 사용할 수있다. 마이크로 필터는 높은 포집 효율을 나타내는 반면,이 세포의 방출이 아닌 사소한입니다. 이러한 역류 또는 세포 스크랩과 같은 기술을 사용하는 경우 일반적으로 세포의 작은 비율은 해제된다. 파릴 렌 C 막 이러한 상피 암세포의 강한 접착력 비특이적 정전 기적 상호 작용에 기인한다. 일을 방해하기효과 우리 PIPAAm 코팅의 사용을 사용하여 필터로부터 세포를 분리하는 열적 반응 형 계면 성질을 이용. 혈액 제 실온에서 여과 하였다. 32 ° C 아래 PIPAAm는 친수성이다. 그 후, 필터는 배양 배지 또는 소수성을 회전시키고,이어서 세포 정전기 결합 해제 PIPAAm 결과 37 ° C로 유지 된 버퍼 하나에 배치된다.

건강한 기증자의 혈액을 사용하여 (정보통 동의 다음 마이애미 IRB 20,150,020 대학에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 획득) 배양 된 암세포, 가능한 순환 종양 세포 (CTC), 달성 캡처, 릴리스 및 검색 효율의 릴리스에 대한 thermoresponsive 기술로 아군 94 % ± 9 %, 82 % ± 5 % 및 77 % ± 5 %의 각각 (표 1) 15. 이에 비해, 필터 코팅의 박리 및 회수 효율이 상당히 낮은 (7 % ± 1 %의 분리 효율은 6 % ± 1 %의 검색 효율) (표 1) 15이었다. 필터로부터 방출 CTCS의 실행 가능성을 평가하기 위해서, ~ 1000 SK-브롬-3 세포는 PIPAAm 코팅 슬롯 필터를 통해 여과하고, 전술 한 방법을 이용하여 풀어 건강한 공여자의 혈액 7.5 ㎖ 중에 급증 하였다. 라이브 / 죽은 분석은 혈액에 스파이크 전...

프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

이 기술의 전반적인 목표는 전혈에서 생존 가능한 순환 종양 세포(CTCs)를 효과적으로 포집하는 것입니다. 이렇게 포집된 CTCs는 배양에 이용하거나, 고정되지 않은 샘플이 필요한 하위 분석에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 전이 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.또한 이는 질병의 진행과 치료 반응을 추적하고 재발 위험을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 바이오마커 발현 여부와 관계없이 모든 고형암에서 살아있는 CTC를 무표지(label-free)로 포집할 수 있다는 점입니다. 저희는 필터 상에서 CTC를 직접 배양하는 대신, 후속 RNA 분석과 CTC 배양을 수행하기 위해 필터에서 CTC를 분리해내는 아이디어를 처음으로 구상하게 되었습니다.실험을 시작하려면, 부탄올이 포함된 15 milliliter 튜브에 10% weight per volume 용액을 조제할 수 있을 만큼의 PIPAAm을 정량하여 넣습니다. 용액이 투명해질 때까지 튜브를 볼텍싱합니다. 다음으로, 가위를 사용하여 플라스틱 현미경 슬라이드를 약 12 millimeter x 12 millimeter 크기의 정사각형으로 자릅니다.그런 다음, 날카로운 직선 가위로 슬롯-포어 마이크로필터 웨이퍼를 8 mm x 8 mm 크기의 정사각형으로 자르고, 이 조각들을 플라스틱 정사각형 위에 직접 배치합니다. 폴리이미드 필름 테이프를 사용하여 자른 필터를 플라스틱 정사각형에 고정하되, 최소 7 mm x 7 mm의 필터 면적이 테이프로 덮이지 않도록 필터의 가장자리와 모서리 부분만 고정합니다. 플라스틱 정사각형에 고정된 마이크로필터를 스핀 코터의 진공 척 위에 배치합니다.스핀 코터를 다음 레시피로 설정하십시오. 그런 다음, 표준 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 10% weight per volume PIPAAm 용액이 마이크로필터 표면을 완전히 덮을 수 있도록 분주하고 스핀 코터를 작동시키십시오. 코팅이 완료되면 PIPAAm이 코팅된 마이크로필터를 스핀 코터에서 분리하고, 보관하는 동안 필터를 플라스틱 사각판에 부착된 상태로 두십시오.여과 카세트 조립 단계로 넘어가, 마이크로필터를 페트리 접시에 넣어 실온에서 PIPAAm 코팅된 마이크로필터를 재수화합니다. 마이크로필터가 완전히 잠길 때까지 1X PBS를 추가합니다. 수화 단계 후, 필터에서 폴리이미드 필름 테이프를 벗기거나 잘라내어 플라스틱 사각형에서 필터를 분리합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

순환 종양 세포(CTC)는 종양 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 간세포 암종(HCC) 전이의 syngeneic mouse tumor model의 전혈에서 CTC를 분리 및 증식하는 방법을 설명합니다.

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

CtC를 배양하면 특정 마커 발현을 속이고 약물 내성과 다른 가능성 중 간을 식민지화하는 능력을 평가함으로써 암의 더 깊은 기능적 특성을 허용합니다. 전반적으로 CTC 문화는 환자 결과를 개선하기 위해 개인화 된 의학을위한 유망한 임상 도구가 될 수 있습니다.

순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.

임상 샘플에서 암 관련 물질의 자동 분리 및 수집

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

여기서는 전혈과 폐암 세포가 급증한 인공 샘플에서 희귀 암세포를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 반자동화된 라벨 없는 셀 분리 플랫폼을 사용합니다. 비축된 세포는 이후 드롭렛 디지털 PCR을 사용하여 표피 성장인자 수용체 돌연변이가 있는지 분석합니다.

세포 분리 시스템과 드롭렛 디지털 PCR을 이용한 순환 희귀 세포에서 표피 성장인자 수용체 DNA 돌연변이 프로파일링

배우세요 PIPAAm 코팅 마이크로필터를 이용해 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포(CTC)를 포착하고 방출하는 방법을. 이 기술은 전이 연구와 질병 진행 모니터링에 활용됩니다.

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

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