Name: 이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 학습하세요 이연 성장 억제 분석을 통해 세균 균주 간 경쟁 억제 효과를 정량적·정성적으로 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 미생물 군집 생태학 연구에 필수적인 데이터를 제공합니다.

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JCM은 유니레버 PLC를 (BB / L023040 / 1)와 함께 BBSRC-IPA 수상에 의해 투자된다. 현대차는 고등 교육 박사 과정 재학의 사우디 아라비아 정부에 의해 자금을 지원한다.

다음 방법은 억제제 생산 균주와 경쟁 균주를 테스트하기 위해 7,8 구성된다. 참고 :이 프로토콜은 박테리아 문화와 에어로졸 생성을 포함한다. 이것은 로컬에만 승인 안전 고려 구현과 함께 포함 된 공간에서 실행될 수있다. 레벨이 안전 캐비닛 내에서 한천 플레이트에 문화의 분사하면 한천 플레이트의 오염과 주변 환경을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 또한 스프레이 박테리아의 에어로졸 흡입에서 연구원을 보호 할 것, 이것은 연구자가 봉쇄 레벨이 생물을 사용하는 경우 주요 관심사이다. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다. 페트리 접시 주변 지역은 최고의 일회용 흡수 조직으로 덮여있다. UV 광을 사용 후 스프레이 오염 제거가 좋습니다. 1. 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 마뉘에 따라 뇌 심장 주입 (BHI) 한천을 준비의 facturer의 지시. </li><li> 살균, 121 ° C, 오토 클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 15 ~ 20 분 동안 PSI, 또는에서 BHI 한천을 압력솥. </li><li> 멸균 배양 접시에 멸균 BHI 한천의 15 ml의 분취 액을 붓고하고 설정할 수 있습니다. 주 : 시험 한천 동일한 스톡에서 유래 내의 모든 한천 플레이트를 사용할 수 있는지 확인하고, 각 접시 한천 동일한 양이된다. 이 사용할 수 영양분과 비교를 허용 판 사이 억제제 확산의 변동성을 제한합니다. </li></ol> 2. 멸균 국물을 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 BHI 국물을 준비합니다. </li><li> 28 ㎖의 유리 보편적 인 병에 BHI 10 ml의 분취 량을 추가합니다. </li><li> 소독, 15 psi의 20 분 동안, 또는 오토 클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 121 ° C에서 BHI 국물을 압력솥. 참고 : 국물 AUT 같은 배치에서 유래 분석에 사용 된 모든 국물 확인결과의 변동을 초래할 수 영양소 변화를 제한하는 동시에 oclaved. </li></ol> 3. 준비 멸균 기화기 병 (의) <ol><li> vapourizer 병을 해체. </li><li> 내부 오염 물질을 제거 밤새 5 % 표면 활성 세정제에 vapourizer 병, 뚜껑과 vapourizer을 흡수하기 위해 vapourizer을 통해 5 %의 표면 활성 세정제 스프레이. 참고 : 표면 활성 세정제를 처리 할 때 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용해야합니다. </li><li> 살균 공기 흐름 후드 아래 기화기, 뚜껑과 병을 건조. </li><li> 70 % 에탄올로 병을 채우기 vapourizer를 다시 연결하고 vapourizer을 통해 에탄올의 일부를 스프레이. </li><li> 기화기에 뚜껑을 넣고 사용할 때까지 내부의 에탄올로 저장합니다. </li><li> 무균 사용 멸균 BHI 국물와 병을 세척하고 vapourizer를 통해 국물을 살포하기 직전. 주 :이 에탄올 AFF 방지6.3 절에서 병에 추가 접종을 돌출 한 칼라. </li></ol> 세균 숙박 문화를 준비 4. (들) <ol><li> 킬 선수와 균주 억제제 멸균 BHI 한천 플레이트 상 및 약 18 시간 (야간)에 대한 호기 37 ° C에서 품어. 참고 :이 판은 4 ° C에서 저장 될 때 같은 주 내에서 여러 복제에 사용할 수있는 박테리아의 재고를 생성합니다. </li><li> 28 ㎖의 만능 병 내의 필요한 경쟁자 박테리아 균주의 단일 콜로니로 멸균 BHI 배지 10 ㎖를 접종한다. </li><li> 궤도 통에 250 rpm으로 흔들어 기적 밤새 37 ° C에서의 보편적 인 병을 품어. </li></ol> 억제제 생산 격리 5. 스팟 문화 <ol><li> 제 4 항에 기재된 바와 같이 밤새 배양 (들)을 준비한다. </li><li> 한천 플레이트 뚜껑에 결로와 완전히 건조 확인, 접종 전에 (PLA를 배양하여 예37 ° C에서 60 분)에 대한 테; 이 접종 사이트에서 접시에 걸쳐 확산 접종을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 한천 플레이트의 중심 상에 하룻밤 문화의 25 μL. 완전히 한천 배양에 걸쳐 분무 공기 방울을 방지하기 위해 플런저 피펫 누름 피한다. </li><li> 문화의 확산을 제한하는 문화가 실온에서 건조하도록 허용합니다. 기적 밤새 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어. </li></ol> 6. 준비 시험 경쟁자 스트레인의 스프레이 접종 (들) <ol><li> 약 4 × 106 CFU ml의 -1 산출하기 BHI 국물에 부 (4) 희석에서 하룻밤 문화 10 배 바와 같이, 하룻밤 문화를 준비하고, OD 600 0.3 ± 0.05의 현탁액. 참고 : 10 배 희석은 4 × 106 CFU ml의 -1 모든 박테리아 종을 제공 1 × 10 사이에 시리얼 희석 도금 확산하여 필요한 희석 계수를 계산하지 않습니다 <s&gt; -1 -1 × 10 -6입니다. </li><li> 멸균 플라스틱 향수 기화기 병에 희석 문화를 따르십시오. 참고 : 전체 볼륨 한천 플레이트의 수는 스프레이를 위해 필요 이상으로해야합니다. 약 접시 당 250 μL는 9cm 직경 페트리 접시에 적합합니다. </li></ol> 7. 이연 성장 억제 분석 <ol><li> 문화가 이전 한천에 스프레이로 분무 장치에로드 될 수 있도록 기화기 병의 각을 통해 문화를 스프레이. </li><li> 한천 위 약 15 cm의 거리에서, 전체 한천 표면에 희석 문화의 약 250 μL (일반 50 ㎖ 기화기의 3 스프레이)를 스프레이. 기적 밤새 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어. 스프레이 같은 수의 다른 판을 반복합니다. </li></ol> 8. 이연 성장 저해 분석 결과 해석 <ol><li> 용사 competi의 성장 억제 영역을 측정토르 변형 (그림 1A - C, &quot;X&quot; &quot;X&quot;로) (- C, &quot;Y&quot;를 &quot;Y&quot;그림 1A) 억제제 제작자의 중앙 지점의 직경을 뺀 밀리미터. 참고 : 그림 1E는이 데이터가 제공 될 수있는 방법을 보여줍니다 </li><li> 억제의 영역에 대한 선명도 점수를 기록합니다. 참고 :이 관찰 된 억제의 정도를 나타냅니다. 예는도 1a에 도시되어있다 - D, 표준화에 사용할 수있는 균주는 대표적인 결과 섹션에서 제시된다. 다음 규모는 명확하게 득점에 사용할 수 : 0의 선명도 점수는 경쟁 균주의 성장을 완전히 억제의 영역을 설명하기 위해. 1의 점수는 비운의 영역에 존재하는 개별 식민지로, 성장의 거의 완전한 억제의 영역을 설명합니다. (2)의 점수가 감소 성장의 가시 영역을 설명하기 위해,이 영역 내에서 성장은 사기꾼이다유창한 또는 합류 근처에 있지만,&gt; 50 % 농도 감소. 3의 점수를 최소한의 성장 감소를 설명하기 위해, 성장 합류하고 50 % 이하로 감소되고, 영역이 계속 표시하고 측정한다. 4의 점수는 성장의 가시적 억제을 설명 없습니다. 5의 점수는 경쟁자 균주의 성장은 테스트 억제제 생산 균주의 근방에서 증가되었음을 설명한다. 예를 그림 1을 참조하십시오. 이 점수는 실험자에 주관적이다. </li></ol> 9. 복제합니다 <ol><li> 생물학적 중으로 적어도 반복 분석은 얻은 결과의 재현성을 결정한다. 참고 : 복제는 다른 일을 수행하는 경우, 측정을 4 ℃에서 후, 배양에서 제거 후 즉시 중 저장 판을 판 점수하거나 폐기하기 전에 판의 높은 품질의 사진을 찍을. 저장 또는 판의 사진이 다른 일 사이의 결과를 쉽게 비교할 수 있도록, t자신은 일 / 실험을 통해 재현 점수를 확인하는 특히 중요하다. 판의 저장 결과를 바꿀 수있는 잠재력을 가지고 있음을 유의하십시오. 참고 : 명확한 사진 장소 플레이트를 들어 수직 확산 된 빛의 영역에 무광택 검정색 배경에 자신의 뚜껑없이, 가까운 렌즈 (매크로 모드)에 개체에 초점을 할 수있는 고해상도 카메라 (≥8 MP)를 사용합니다. 대안으로, 백색 광으로 설정 트랜스 일루미네이터 일부 겔 이미 저들은 고품질, 재현성이 높은 화상을 형성 할 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

다른 사람을 구별이 박테리아 종 대회 프로토콜의 중요한 단계는 억제제의 하룻밤 배양은 경쟁 분리를 첨가하기 전에 분리합니다. 억제제의 변형이 억제 화합물을 생산하는이 성장 기간을 필요로한다. 선수 변형이 동일한 매체 위에 중첩 된 바와 같이,이 방법은 모든 가능성을 관찰하는 연구를 할 수 있습니다 억제제 계통의 경쟁 균주의 성장을 방해합니다. 결과적으로, 이러한 분석은 자연 발생하는 반사; 하나의 분리가 완전히 틈새에 설정되고, 다른 성공적 틈새를 침투 할 수있는 억제 변수를 상쇄 할 수 있어야한다. 잘못 수행 한 경우 잘못된 결과가 발생할 가능성이 가장 높은이 프로토콜에 두 부분이 있습니다. 우선, 기화기 병 불완전 멸균 분석에 세균 오염을 도입 할 수있다. 인큐무균 용기의 단계 3.6에서 증발기 병 린스 사용 브로스 bation 완전히 살균 된 병을 확인하는데 사용될 수있다. 추가 살균이 필요한 경우 등 Virkon 같은 소독제 솔루션에 추가 세척은, 단계 3.2에 설명 된 표면 활성 세정제의 세척, 이전에 사용할 수 있습니다. 잘못된 결과가 발생할 수 있습니다 두 번째 단계는 경쟁 변형 (단계 6.1)의 희석이다. 희석이 최적이 아닌 경우, 억제의 명확한 측정은 쉽게 결정되지 않을 수 있습니다. 이 분석은 억제제 생산 S. 대 그람 - 양성 및 그람 - 음성 종의 넓은 범위에 걸쳐 균주 등의 다양한 코 균주를 사용하여 최적화되었다 선수 변형 7,8 등 구균 SH1000. 그것은 이후 경쟁 및 억제제 생산 균주 등 다양한-아굴라 부정적인와 아굴라 양성 포도상 구균을 사용하여 테스트되었습니다. 경쟁자로서 상기 이외의 속을 테스트 할 때변형, 접종에 대한 희석의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. 명확성 점수 반복 사이에서 크게 다를 경우, 특정 광학 밀도로 설정하여 경쟁 균주 접종을 표준화 할 필요가있을 수도있다. 그러나, 이것은 분석이 설정 취하고,이 실험에 따라 처리 할 수​​있다 변형의 수를 감소 할 가능성이있는 시간을 증가시킬 것이다. 시각적 신속한 대안을 제공 할 수있다 맥팔랜드 표준을 사용하여 적절한 OD로 배양을 조정. 이 기술의 한 가지 제한은 단지 박테리아 배양에 적용될 수 있다는 것이있다. 많은 연구 경쟁력 제외 상호 작용 3,4,13을 예측하기 16S rRNA의 염기 서열을 사용하는 이유입니다. 그러나, 유전 및 군 유전체학 기술은 종 수준으로 지역 사회 구성원을 구별 할 수 및 / 또는 특정 종자 간 특성의 변화를 설명하지 않습니다. particul의 연결을 선별 할 수있다박테리아 종 (5)의 유무와 특성을 인코딩 AR 유전자 그러나 이것은 종의 배제와 관련 될 가능성이 유전자의 사전 지식을 필요로한다. 이 기술의 안전 고려 사항은 박테리아의 에어로졸 생성으로 인해, 그것은 단지 레벨 2 안전 캐비닛과 함께 실험실에서 사용 또는 유사한 안전주의 사항과 함께 할 수 있다는 것입니다. 종자 간 특성의 변화를 설명하고 박테리아의 에어로졸을 생성하지 않는 균주 간의 경쟁을 테스트하는 다른 방법이 있습니다. 하나의 이러한 방법은 동시 길항 작용 분석법이있다. 이 방법에서는 하나의 분리의 접종은 한천 판에 확산되어, 제 1 건조되면 두 번째 분리 접종은 상단에 발견이나 칼에 찔린된다. 이 모두 억제 화합물을 생성 및 최초의 영양분을 소기하기 위해 경쟁 균주가 직접적인 경쟁 (동시 길항)에 환경을 생성합니다. advantag동시 길항 작용 분석을 통해 이연 성장 억제 분석의 전자는 억제제의 분리는 항상 완전 경쟁 분리의 침공하기 전에 설립되고의 경쟁 우위를 가지고 있어야한다는 것입니다. 또 다른 변형이 아니라 두 개의 분리가 동시에 8에 추가되지 않고, 추가되기 전에, 하나의 분리가 설립됩니다 대부분의 틈새에서와 같이이 환경에 무슨 일이 일어날 지 더 반사입니다. 또 다른 대안은 부어보다는 억제제의 분리에 분무 할 수있는 최고 한천에서 분리 선수를 추가하는 것입니다 박테리아의 에어로졸 발생을 방지 할 수 있습니다. 그러나, 톱 아가 추가의 체적은 플레이트에도 적용을 위해 약 3 ㎖가 될 필요가있다. 이 볼륨 내에서 경쟁의 분리는 억제제의 분리와 같은 미디어에 성장하지 않을 것이다, 그래서 감소 영양분으로 고생하지 않을 것입니다. 선수는 모든 UNT 억제 화합물과 직접 접촉하지 않을위원장은 상단 한천으로 확산. 이러한 분석은 연기 억제 또는 동시 길항 작용으로 설명 할 수 없습니다. 유사한 방법을 이전 임상 S. 사이 바시 트라 신 내성의 수준을 평가하기 위해 사용되어왔다 구균은 10를 분리합니다. (10)에 의해 기술 된 여기에 설명 된 프로토콜과 그 사이의 가장 큰 차이점은, 같은 민감한 (0 점수 inhibition- 선명도를 완료) 또는 저항 후자 만 분류 경쟁 균주이다 (더 inhibition- 선명도 부분 1-5 점수). 지연된 성장 억제 분석은 따라서 또한 다 약제 내성 병원균에 대해 활성 신규 항생제를 검색하더라도 특정 항균제 또는 생산자에 대한 내성 수준을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 숙주 미생물이 세균 커뮤니티 (9)의 바람직하지 않은 멤버를 제거하기 위해 조작 될 수 있다고 제안되었다. 코리 네형 또는 포도상 구균의 응용 프로그램ylococcus 표피 이미 S.을 제거하는 것으로 나타났다 인구 11, 12의 상당한 부분에서 콧 구멍에 균 집락. 경쟁력있는 등 여기에 설명 된 것과 같은 기술을 통해 호스트 식물의 바람직하지 않은 회원을 제외 할 수 있습니다 특정 균주에 대한 연구는 따라서 미래의 치료제가 발생할 수 있습니다.

군집에 사는 박테리아는 공간과 영양분을 놓고 종간 및 종내 수준에서 경쟁합니다 6. 미생물 간의 경쟁은 종종 군집 내에서 특정 종이나 균주를 배제하는 결과로 이어질 수 있습니다. 배제는 특정 수용체 또는 영양소에 대한 경쟁 또는 군집 구성원에 의한 항균 화합물 생산 6에 기인할 수 있습니다.
경쟁적 배제를 조사하는 연구는 16S rRNA 염기서열분석 3,4,13을 사용하여 종의 존재와 부재를 조사하는 경우가 많습니다. 그러나 항균 펩타이드 생산의 유무와 같은 특이적 내 형질 변이는 한 종이 다른 종을 억제하는 능력에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 1. 16S rRNA 염기서열분석은 동일한 종의 균주를 구별할 수 없기 때문에 특이적 내 형질 변이를 평가할 수 없습니다. 여기에 설명된 기술은 다른 박테리아를 배제할 수 있는 개별 균주의 가능성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 이전에 황색포도상구균 억제성 박테리아의 존재와 비강 군락에서 황색포도상구균의 부재 사이에 긍정적인 상관관계를 보여주기 위해 사용되었다 7.
지연성장억제(경쟁) 분석은 억제제 균주에 의한 항균 화합물의 생산 또는 영양 경쟁을 확인할 수 있습니다. 또한 긍정적인 상호 작용을 감지할 수 있으며, 억제제 균주의 존재가 실제로 경쟁 균주의 성장을 향상시킵니다. 이 분석은 정량적 데이터(clearing size 영역)와 정성적 데이터(억제 정도)를 생성하는 데 사용할 수 있으며, 둘 다 군집 내 종의 존재 또는 부재에 대한 데이터에 오버레이하여 표현형(형질)과 경쟁적 배제 7 사이의 상관 관계를 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>뇌 심장 주입 국물</td><td>Lab M</td><td>lab049</td><td>풍부한 범용 매체</td></tr><tr><td>한천</td><td>Merck Milipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 향수 기화기</td><td>알 수 없음</td> <td>-</td> <td>높이 10cm, 직경 3.5cm, 뚜껑이 있는 투명 플라스틱 스프레이 병, 슈퍼마켓</td></tr> <tr><td>여행 섹션에서 구입더</td> 이상 생산되지 않는 보편적인 병<td></td><td>, 대체 SLS BOT5006</td><td>28 ml 유리 원통형 병 (~280 mm 직경, 높이 850 mm), 플라스틱 나사 캡이 있는 평평한 바닥</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&nbsp;</td><td></td><td>표면 활성 세척제&nbsp;</td></tr></tbody></table>

이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

예를 들어, 억제제를 생산하는 균주가 필수 영양소에 대해 경쟁자를 능가하거나 경쟁자가 내성이 없는 항균 화합물을 생산할 때 미생물 군집에서 경쟁적 배제가 발생할 수 있습니다. 여기에서는 항균 화합물의 생산 또는 영양소 경쟁을 통해 한 박테리아가 다른 박테리아의 성장을 억제하는 능력을 평가하는 방법인 지연 성장 억제 분석법에 대해 설명합니다. 이 기술은 군집에서 특정 종을 배제하는 것과 비강 분리물의 상관 관계를 조사하는 데 사용되었습니다. 이 기술은 또한 항생제 생산자 또는 잠재적으로 새로운 항균제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 먼저 한천 플레이트에서 시험 억제제 생성 균주를 밤새 배양한 다음 시험 경쟁사 균주에 분무하고 다시 배양하여 수행됩니다. 배양 후, 억제 정도는 억제제 생성 균주 주변의 정화 영역의 크기를 통해 정량적으로 측정할 수 있으며, 억제 영역의 투명도를 평가하여 질적으로 측정할 수 있습니다. 여기에서는 지연된 억제 분석에 대한 프로토콜을 제시하고, 실험 간 변동을 최소화하는 방법을 설명하며, 억제 정도를 정성적으로 평가하는 데 사용할 수 있는 투명도 척도를 정의합니다.

분석 결과는 중앙에서 발견 억제제 생산 균주 (그림 1) 근처 오버레이 경쟁 변형의 차이로 관찰해야한다. 이러한 차이는 완전한 억제 (도 1A)의 부분 억제 (도 1B 및 1C)없이 억제 (도 1D) 또는 양의 관계로 해석 될 수있다. 널리 사용 가능한 실험실 S. 종자 표피 Tü3298 및 S. 표피 Rp62A 및 S. 표피 Rp62A 및 S. 구균 뉴먼은 각각도 1B와 1D에 사용되었다. 우리는이 균주는이 프로토콜을 테스트하는 데 사용할 수 있음을 시사한다. 시험 종에 따라, 전체 억제 및 부분 억제 가능성이 가장 높은 항균 펩타이드 항생제 또는 다른 확산 성장 inhibito의 결과억제제 생산 균주에 의해 생산 RS. 부분 억제는 또한 억제제 변형 (6)에 의한 경쟁 흡수하기 때문에 변형 또는 영양소의 금속 이온 봉쇄에 대한 감소 영양 가용성에 연결되어 있습니다. 동일한 경쟁 균주에 대해 테스트 상이한 억제제 생산 균주 사이에 억제 영역의 크기의 비교가 다음 중 어느 하나의 차이를 나타낸다 : 억제제 생산 균주에 의해 생성 된 미생물의 양; 매체를 통해 확산 억제제의 능력; 억제제의 종류 및 제조 억제제 참가자 균주의 저항 레벨이 생성된다. 동일한 억제제 생산 균주에 대해 테스트 다른 균주 사이의 경쟁 저해 영역의 크기를 비교 억제제 생산되기 라이벌 균주의 저항 레벨을 나타낸다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 결과 사용 억제 균주 사용 된 경쟁 변형에 따라 달라질 수 있습니다. 같은 억제와 경쟁 균주를 사용하여 반복이 이상적으로 동일한 선명도 점수 (8.2 절에 설명)을해야한다, 이것은 좋은 기술이 전반에 걸쳐 사용되어왔다 나타냅니다. 박테리아의 일관성 애플리케이션 발생한 경우 플레이트에 사용되어서는 안된다. 예를 들어, 경쟁 시험 배양 너무 경우 저해 영역이 크게 나타나는 전형적 (도 2A) 관찰보다 덜 명확하게 정의 된 에지로 희석한다; 이것은 모든 비교 영역 측정 신뢰성에 영향을 미칠 것이다. 억제제 생산 균주의 자리가 완전히 밤새 배양하기 전에 건조되지 않은 경우, 억제제 변형 확산 일반적으로 영역 측정에 영향을뿐만 아니라 선명도 점수에 영향을 미칠 수있는 명확하게 정의 된 지점 (그림 2B)를 형성 할 것으로 예상된다. 경쟁사의 변형 인 경우하지 균등이 박테리아의 요철 확산 (그림 2C)로 이어질 수 분무. 경쟁사의 변형이 너무 집중되어있는 경우가 경쟁 변형이 억제 변형 (그림 2C) 위에 성장 수있다, 극단적 인 경우에이 경쟁 / 억제제 변형 역할의 일부 반전으로 이어질 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> 그림 1. 성장 저해 지연된 성장 억제 분석으로부터 얻을 수있다 정량적 결과의 범위 결과 (A) 전체 금지 범위 (0의 점수), (B) 부분 억제 (1 점) (D) 없음 억제 (4 점) 내지 (C) 부분 억제 (2 점). 라벨 (Y) 억제제 균주의 성장을 억제 가장자리의 최 외측 에지를 나타내는영역 (X). (A)에 촬영 된 플레이트에 대한 측정을 보여준다 (E)에 도시 된 바와 같이, 0mm에서 10mm 이하로 억제 범위의 영역의 크기는, B, C 및 D. 결과 최근 포도상 구균 균주 (A에 대해 도시 , C) 또는 일반적인 실험실 포도상 구균은 S.는 분리 표피 Tü3298 (억제제)와 S. 표피 Rp62A (경쟁자) (B), 및 S. 표피 Rp62A (억제제)와 S. 구균 뉴먼 (경쟁) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> 그림 2 : 빈약 한 기술에 일치하지 않는 결과의 예 결과 경우 예상보다 다르게 나타날 수 있습니다 (A. </stro선수 변형이 균일하게 분사되지 않았고 너무 집중 경우 NG&gt;) 경쟁 변형이 너무 희석하고, (B) 억제제 균주 배양 / 판 전에 완전히 건조하지 않았다 건조 또는 (C)하지 않았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a>

지연 성장 억제 분석법은 한 박테리아 분리물이 다른 박테리아에 미치는 경쟁 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 억제는 억제제를 생산하는 분리물 주변의 정화 영역을 측정하여 정량화하거나 가시적인 억제 정도를 결정하여 정성적으로 평가합니다.

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 한 박테리아 분리균주가 다른 균주에 미치는 경쟁 영향을 정량적 및 정성적 방식으로 조사하는 것입니다. 이 방법은 박테리아 군집 내의 경쟁적 배제에 관한 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 박테리아 군집에서 실제로 일어나는 현상을 반영한다는 점입니다.침입 분리균이 성공적으로 침입하기 위해서는 기존에 정착한 분리균의 억제 효과를 견뎌낼 수 있어야 합니다. 이 절차의 시연은 병원 생물학 전공 대학원생인 Emma Crank이 맡겠습니다. 먼저, 제조사의 지침에 따라 brain heart infusion 또는 BHI agar를 준비하십시오.멸균을 위해 한천(agar)을 121 °C, 15 psi 조건에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 멸균된 BHI 한천 15 mL씩을 멸균 페트리 접시에 분주하고 한천이 굳을 때까지 둡니다. 제조사의 지침에 따라 BHI 배지를 준비하고, 10 mL씩 28 mL 유리 유니버설 병에 옮깁니다.그 다음 BHI 배지를 20분 동안 오토클레이브합니다. 기화기 병을 준비하려면 먼저 병을 분해하십시오. 기화기 내부의 오염 물질을 제거하기 위해 5% 계면활성 세정제를 기화기에 분사합니다.그 후 기화기 병, 뚜껑, 기화기를 세척제에 넣고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 다음 날, 멸균 공기 흐름 후드 아래에서 기화기, 뚜껑, 병을 건조시킵니다. 그런 다음 70% ethanol로 병을 채웁니다.그 후, 기화기를 다시 부착하고 에탄올을 기화기를 통해 분무합니다. 기화기에 뚜껑을 덮고 사용 전까지 에탄올이 들어있는 상태로 보관합니다. 사용하기 전에 멸균된 BHI broth를 사용하여 병을 무균적으로 헹구고, 해당 배지를 기화기를 통해 분무합니다.박테리아 하룻밤 배양액을 준비하려면, 경쟁균주와 억제균주를 멸균된 BHI agar 플레이트에 스트리킹하고, 37 °C에서 호기성 상태로 약 18시간 동안 배양합니다. 28 mL 유니버설 병에 멸균된 BHI broth 10 mL를 넣고, 필요한 경쟁 박테리아 균주의 단일 콜로니를 접종합니다. 해당 배양액을 유니버설 궤도 쉐이커에서 37 °C, 250 RPM으로 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 접종물이 플레이트 상에서 퍼지는 것을 방지하기 위해 한천 플레이트가 완전히 건조되었으며 뚜껑에 응결수가 없는지 확인하십시오. 배양액이 한천 전체로 튀게 만드는 공기 방울이 생기지 않도록 피펫 플런저를 완전히 누르지 말고, 하룻밤 배양한 배양액 25 µL를 한천 플레이트 중앙에 분주하십시오. 배양액의 확산을 제한하기 위해 실온에서 배양액을 건조시키십시오.그런 다음, 한천 배지를 37 °C에서 호기성 상태로 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 후, 흡수지가 깔린 2단계 안전 캐비닛 내에서 BHI broth를 사용하여 배양액을 10배 희석하여 mL당 약 4 × 10⁶ CFU가 되도록 합니다. 그다음, 희석된 배양액을 멸균된 플라스틱 향수 분무기에 붓습니다.지연 성장 억제 분석을 수행하려면, 배양액을 한천 위에 분무하기 전 분무 장치에 배양액이 충분히 충전될 수 있도록 각 분무용 병을 통해 배양액을 분사하십시오. 한천 표면에서 약 15cm 높이에서 희석된 배양액 약 250 µL를 한천 표면 전체에 분무하십시오. 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 호기성 조건으로 배양하십시오.지연된 성장 억제를 해석하려면, 살포된 경쟁 균주의 성장 억제대 너비를 밀리미터(mm) 단위로 측정하고, 여기서 중심에 접종된 억제제 생산 균주의 직경을 뺍니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 억제대의 투명도 점수를 기록합니다. 이 그림에서 보는 바와 같이, 분석 결과는 중심에 접종된 억제제 생산 균주 주변에 겹쳐진 경쟁 균주의 차이로 관찰되어야 합니다.차이점으로는 완전 억제, 부분 억제, 억제 없음 또는 양성 연관성이 있을 수 있습니다. 이 그래프는 억제제 생성 분리 균주 간의 억제대(zone of inhibition)를 비교하며, 이는 생성된 항균 물질의 양, 억제제가 배지를 통해 확산되는 능력, 생성된 억제제의 종류 또는 억제제에 대한 경쟁 균주의 내성 수준의 결과일 수 있습니다. 이 예시는 테스트 경쟁 배양액이 너무 희석된 경우, 억제대가 평소 관찰되는 것보다 더 크게 나타나고 가장자리가 덜 명확하게 정의됨을 보여줍니다.만약 억제제 생산 균주 스폿이 하룻밤 동안 배양하기 전에 완전히 건조되지 않았다면, 억제 균주가 퍼져나가 완전하게 정의된 스폿을 형성하지 않을 것입니다. 또는, 경쟁 균주가 고르게 분무되지 않으면 박테리아가 불균일하게 퍼지는 결과로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 경쟁 균주의 농도가 너무 높으면 억제 균주 위에서 성장할 수 있으며, 극단적인 경우에는 경쟁 균주와 억제 균주의 역할이 뒤바뀌는 결과가 나타날 수 있습니다.이 기술을 숙달하면, 테스트하는 분리균 쌍당 4일에 걸쳐 총 1시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 어세이 간의 재현성을 확보하기 위해 균일하게 분무하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후의 저해 데이터는 커뮤니티 내 박테리아 종의 존재 여부에 관한 분류학적 데이터와 중첩하여 분석할 수 있습니다.이후 억제 효과가 특정 종의 환경 내 정착 능력에 영향을 미치는지 결정할 수 있습니다. 이 기술이 개발됨에 따라, 커뮤니티 마이크로바이옴 분야의 연구자들은 경쟁적 배제 상황에서 항균 펩타이드 예측과 같은 형질 변이가 커뮤니티 구조에 미치는 영향을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 한 박테리아 분리주가 다른 분리주의 성장을 경쟁적으로 억제하는 능력을 정성적 및 정량적 방식으로 비교하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.에어로졸화된 박테리아를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 2단계 생물안전작업대 내에서 작업하고 적절한 개인보호구(PPE)를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Speare, L., et al. Vibrio fischeri 분리주 간의 경쟁적 상호 작용을 정량화하기 위한 공동 큐베이션 분석. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 박테리아 균주가 공유 환경에서 어떻게 경쟁하는지 연구하는 데 사용되는 공동 배양 분석을 보여줍니다. 이러한 상호 작용을 유도하는 접촉 의존적 또는 접촉 독립적 사멸과 같은 메커니즘을 식별하기 위해 미생물학에 널리 적용됩니다.

박테리아 균주 간의 경쟁적 상호 작용을 연구하기 위한 공동 배양 분석

이 동영상은 단세포 수준에서 박테리아 경쟁을 연구하는 형광 현미경 기반 방법을 보여줍니다. 이 방법은 박테리아 군집의 구조와 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.

Bacterial Co-Incubation Assay: 단일 세포 수준에서 특이성 내 박테리아 경쟁을 시각화하기 위한 형광 현미경 기반 기술

이 비디오는 한 유형의 박테리아에서 생성된 항균 화합물이 다른 경쟁 박테리아 균주에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 사용되는 지연 성장 억제 분석을 보여줍니다.

박테리아 유래 항균 화합물의 효과를 평가하기 위한 지연 성장 억제 분석

이 동영상은 박테리아에 대한 테스트 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 마이크로타이터 플레이트 기반 방법을 보여줍니다. 시험용 항생제의 연속 희석액이 들어 있는 마이크로타이터 플레이트에 세균성 병원균 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 현탁액과 박테리아에 의한 피오멜라닌 생성 억제제를 첨가한 후, 웰의 광학 밀도를 측정하여 항생제의 최소 억제 농도와 피오멜라닌 생산 억제제의 영향이 박테리아의 항생제 감수성에 미치는 영향을 계산합니다.

항생제의 최소 억제 농도를 평가하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법

우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을...

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 다른 박테리아에 대한 억제성 화합물의 생산을 위해 박테리아 배양을 스크리닝하는 간단한 방법을 설명합니다.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

이 원고는 단일 세포 형광 현미경 검사를 사용하여 공동 문화에서 세균 경쟁을 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

학습하세요 이연 성장 억제 분석을 통해 세균 균주 간 경쟁 억제 효과를 정량적·정성적으로 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 미생물 군집 생태학 연구에 필수적인 데이터를 제공합니다.

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