이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기

본 프로토콜의 전반적인 목적은 한 박테리아 분리균주가 다른 균주에 미치는 경쟁 영향을 정량적 및 정성적 방식으로 조사하는 것입니다. 이 방법은 박테리아 군집 내의 경쟁적 배제에 관한 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 박테리아 군집에서 실제로 일어나는 현상을 반영한다는 점입니다.

침입 분리균이 성공적으로 침입하기 위해서는 기존에 정착한 분리균의 억제 효과를 견뎌낼 수 있어야 합니다. 이 절차의 시연은 병원 생물학 전공 대학원생인 Emma Crank이 맡겠습니다. 먼저, 제조사의 지침에 따라 brain heart infusion 또는 BHI agar를 준비하십시오.

멸균을 위해 한천(agar)을 121 °C, 15 psi 조건에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 멸균된 BHI 한천 15 mL씩을 멸균 페트리 접시에 분주하고 한천이 굳을 때까지 둡니다. 제조사의 지침에 따라 BHI 배지를 준비하고, 10 mL씩 28 mL 유리 유니버설 병에 옮깁니다.

그 다음 BHI 배지를 20분 동안 오토클레이브합니다. 기화기 병을 준비하려면 먼저 병을 분해하십시오. 기화기 내부의 오염 물질을 제거하기 위해 5% 계면활성 세정제를 기화기에 분사합니다.

그 후 기화기 병, 뚜껑, 기화기를 세척제에 넣고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 다음 날, 멸균 공기 흐름 후드 아래에서 기화기, 뚜껑, 병을 건조시킵니다. 그런 다음 70% ethanol로 병을 채웁니다.

그 후, 기화기를 다시 부착하고 에탄올을 기화기를 통해 분무합니다. 기화기에 뚜껑을 덮고 사용 전까지 에탄올이 들어있는 상태로 보관합니다. 사용하기 전에 멸균된 BHI broth를 사용하여 병을 무균적으로 헹구고, 해당 배지를 기화기를 통해 분무합니다.

박테리아 하룻밤 배양액을 준비하려면, 경쟁균주와 억제균주를 멸균된 BHI agar 플레이트에 스트리킹하고, 37 °C에서 호기성 상태로 약 18시간 동안 배양합니다. 28 mL 유니버설 병에 멸균된 BHI broth 10 mL를 넣고, 필요한 경쟁 박테리아 균주의 단일 콜로니를 접종합니다. 해당 배양액을 유니버설 궤도 쉐이커에서 37 °C, 250 RPM으로 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 접종물이 플레이트 상에서 퍼지는 것을 방지하기 위해 한천 플레이트가 완전히 건조되었으며 뚜껑에 응결수가 없는지 확인하십시오. 배양액이 한천 전체로 튀게 만드는 공기 방울이 생기지 않도록 피펫 플런저를 완전히 누르지 말고, 하룻밤 배양한 배양액 25 µL를 한천 플레이트 중앙에 분주하십시오. 배양액의 확산을 제한하기 위해 실온에서 배양액을 건조시키십시오.

그런 다음, 한천 배지를 37 °C에서 호기성 상태로 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 후, 흡수지가 깔린 2단계 안전 캐비닛 내에서 BHI broth를 사용하여 배양액을 10배 희석하여 mL당 약 4 × 10⁶ CFU가 되도록 합니다. 그다음, 희석된 배양액을 멸균된 플라스틱 향수 분무기에 붓습니다.

지연 성장 억제 분석을 수행하려면, 배양액을 한천 위에 분무하기 전 분무 장치에 배양액이 충분히 충전될 수 있도록 각 분무용 병을 통해 배양액을 분사하십시오. 한천 표면에서 약 15cm 높이에서 희석된 배양액 약 250 µL를 한천 표면 전체에 분무하십시오. 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 호기성 조건으로 배양하십시오.

지연된 성장 억제를 해석하려면, 살포된 경쟁 균주의 성장 억제대 너비를 밀리미터(mm) 단위로 측정하고, 여기서 중심에 접종된 억제제 생산 균주의 직경을 뺍니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 억제대의 투명도 점수를 기록합니다. 이 그림에서 보는 바와 같이, 분석 결과는 중심에 접종된 억제제 생산 균주 주변에 겹쳐진 경쟁 균주의 차이로 관찰되어야 합니다.

차이점으로는 완전 억제, 부분 억제, 억제 없음 또는 양성 연관성이 있을 수 있습니다. 이 그래프는 억제제 생성 분리 균주 간의 억제대(zone of inhibition)를 비교하며, 이는 생성된 항균 물질의 양, 억제제가 배지를 통해 확산되는 능력, 생성된 억제제의 종류 또는 억제제에 대한 경쟁 균주의 내성 수준의 결과일 수 있습니다. 이 예시는 테스트 경쟁 배양액이 너무 희석된 경우, 억제대가 평소 관찰되는 것보다 더 크게 나타나고 가장자리가 덜 명확하게 정의됨을 보여줍니다.

만약 억제제 생산 균주 스폿이 하룻밤 동안 배양하기 전에 완전히 건조되지 않았다면, 억제 균주가 퍼져나가 완전하게 정의된 스폿을 형성하지 않을 것입니다. 또는, 경쟁 균주가 고르게 분무되지 않으면 박테리아가 불균일하게 퍼지는 결과로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 경쟁 균주의 농도가 너무 높으면 억제 균주 위에서 성장할 수 있으며, 극단적인 경우에는 경쟁 균주와 억제 균주의 역할이 뒤바뀌는 결과가 나타날 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면, 테스트하는 분리균 쌍당 4일에 걸쳐 총 1시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 어세이 간의 재현성을 확보하기 위해 균일하게 분무하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후의 저해 데이터는 커뮤니티 내 박테리아 종의 존재 여부에 관한 분류학적 데이터와 중첩하여 분석할 수 있습니다.

이후 억제 효과가 특정 종의 환경 내 정착 능력에 영향을 미치는지 결정할 수 있습니다. 이 기술이 개발됨에 따라, 커뮤니티 마이크로바이옴 분야의 연구자들은 경쟁적 배제 상황에서 항균 펩타이드 예측과 같은 형질 변이가 커뮤니티 구조에 미치는 영향을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 한 박테리아 분리주가 다른 분리주의 성장을 경쟁적으로 억제하는 능력을 정성적 및 정량적 방식으로 비교하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

에어로졸화된 박테리아를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 2단계 생물안전작업대 내에서 작업하고 적절한 개인보호구(PPE)를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.