Name: 보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 학습하세요 마우스 모델에서 피하 및 비강 BCG 백신 접종의 보호 효능과 폐 면역 반응을 비교하는 방법을. IL17 매개 면역 반응과 특정 면역 매개변수를 식별하여 결핵 백신 개발에 기여합니다.

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이 작업은 "스페인 경제경쟁력부"[보조금 번호 BIO2014-5258P], H2020 프로그램[보조금 번호 TBVAC2020 643381]의 "유럽연합 집행위원회"의 지원을 받았습니다.

모든 마우스는 통제 된 조건 하에서 유지와 질병의 징후가 관찰되었다. 실험 연구는 실험 동물의 보호와 관할 지역 윤리위원회의 승인과 유럽 국가 지침과 일치 하였다. BCG 덴마크어의 정량화 글리세롤 주식 및 결핵균의 H37Rv 1. 준비 주 : 설명 된 모든 프로토콜은 BSL3 조건 하에서 수행 하였다. <ol><li> BCG 덴마크어 또는 H37Rv 균주의 해동 냉동 글리세롤 주식 및 트윈 80 0.05 % (v / v)로 및 ADC (알부민, 포도당, 카탈라제) 10 % (v / v)의 보충 7H9 매체 (10) 10ml에 100 μl를 접종. </li><li> 배양 로그 상에 성장 될 때까지 37 ℃에서 일주일 동안 정적 조건에서 인큐베이션. </li><li> 신선한 배지 200㎖에 10 ml의 문화를 전송하여 세균 배양을 확장 할 수 있습니다. 20 추가 품다정적 조건에서 일. </li><li> g X 2500에서 15 분 동안 50 ml의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 잔류 볼륨에서 세균 펠렛을 재현 탁. (- 튜브 당 15 10) 각각의 튜브 멸균 3 mm 직경의 유리 구슬에 추가합니다. </li><li> 소용돌이 적극적 위해 1 분 동안 세균 덩어리를 떼어 놓다합니다. 트윈 80 0.05 %와 PBS 10 ml의 각 펠렛을 재현 탁 (v / v)로. </li><li> 가장 큰 세균 단위 및 유리 구슬이 정착 할 수 있도록 10 분 동안 튜브를 남겨주세요. </li><li> 하나의 신선한 50 ml의 원심 분리기 튜브 (최종 복구 된 볼륨 38 ㎖)에 작은 덩어​​리와 하나의 박테리아 및 전송 볼륨을 포함하는 4 튜브의 각에서 상층 액 9.5 mL로 복구 할 수 있습니다. 400 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 15 %의 최종 글리세롤 농도를 수득 한 신선한 50 mL의 원심 분리 튜브 (주로 단일 박테리아를 함유 함) 상등액 35 mL를 복구 및 글리세롤로 50 % (V / V) PBS 15 mL로 추가 (V / V). </li><li> 부드럽게 믹스냉동에 적합한 튜브에 1 ㎖의 분량 씩 배포 할 수 있습니다. -80 ° C에서 보관 (한 많은 약 50 분취 글리세롤 주식을 제공합니다). </li><li> 글리세롤 주식을 정량화하기 위해, 동결 후 글리세롤에게 일을 해동하고 PBS 900 μl를 포함하는 별도의 1.5 ml의 튜브에 일곱 10 배 연속 희석을 수행합니다. </li><li> 플레이트 55 mm 직경 배양 접시에서 제조 된 ADC 10 % (v / v)의 보충 7H10 고체 한천 배지 (10)의 각 희석액 100 ㎕. </li><li> 조심스럽게 3mm 직경의 유리 구슬 (접시 당 약. 10)를 추가하고 부드럽게 동등하게 한천 접시 위에 볼륨을 배포 판을 흔들어. 구슬을 취소하고 파라 필름으로 한천 플레이트를 밀봉. </li><li> 37 ° C 21 일 동안 품어 단일 콜로니를 정확하게 구별 할 수있는 희석에 집락 형성 단위를 (CFU)를 계산하여 세균 농도를 결정한다. </li></ol> 2. 마우스 예방 접종 <ol><li> 사전 정량 BCG 글리세롤을 해동하고 사전에 PBS에 희석이 현탁액이다. 동물 당 투여 량을 고려하여 최종 부피를 계산하는 것은 피하 투여 100 μL (피하 접종 ml의 당 107 CFU) 및 비강 내 투여 (비강 예방 접종에 대해 2.5 × 10 7 CFU) 40 μL이다. </li><li> 이소 플루 란과 산소의 혼합물로 쥐를 마취하는 설치류에 대한 전문 마취 워크 스테이션을 사용합니다. 마취 챔버 내에 마우스를 유지하는 마취 2 % 이소 플루 란을 유도하는 5 %를 사용한다. (기타 수락 마취 방법이 사용될 수있다). </li><li> 피하 백신 투여에 세균 현탁액 (107 CFU / ㎖) 1 ㎖의 26 G 바늘을 1 mL를 주사기를 채운다. 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 층류 후드 내부에 발생하기 쉬운 위치에 평평한 표면에 마취 마우스를 놓고 마우스의 측면에 피하에게 백신 100 ㎕ (106 CFU / 복용량을) 다시 접종. 케이지에 마우스를 반환하고 prope 수 있도록 그것을 모니터RLY는 마취에서 회복. </li><li> 각 마우스 행정부 사이의 주사기 바늘을 변경합니다. 상술 한 바와 같이 기포를 제거했다. </li><li> 비강 내 투여의 경우, 후드 안쪽에 누운 자세에서 마취 마우스를 놓습니다. </li><li> 마이크로 피펫으로 2.5 × 107 CFU / ㎖로 현탁액의 20 μl를 가져 가라. 마우스의 볼륨을 숨을 쉴 수 있도록 방울 사이의 시간을두고 접종 드롭하여 드롭 전체 볼륨이 입금 될 때까지 두 개의 콧 구멍 사이에 배치 참고 :. 마우스는이 절차를 수행하는 동안 호흡 곤란으로 고생 할 수 있습니다 그들이에 남아 있어야하므로 가급적으로 방지하기 위해 다음 중 하나를 관리하다 전에 각 드롭 동화. </li><li> 또 다른 20 μL와 마이크로 피펫을 재 작성하고 작업을 반복합니다. 마우스가 첫 번째 접종 후 마취에서 깨어 시작되면, 이전에 두 번째로 마취 실에 넣습니다. 케이지에 마우스를 반환하고 올바르게 복구되었는지 확인마취에서. </li></ol> H37Rv 스트레인 3. 마우스 비강 도전 <ol><li> 미리 정량 H37Rv 글리세롤을 해동하고 ㎖의 당 2,500 CFU의 세균 현탁액을 준비하기 위해 PBS에 희석. 동물 당 투여 량을 고려하여 최종 부피를 계산하면 40 μL이다. </li><li> 2.5에 설명 된대로 H37Rv는 비강 접종 - 2.7. 마우스 당 최종 도전 선량이 10 CFU / 40 μL이다. </li></ol> 폐에서 유도 된 면역 반응 4. 분석 <ol><li> 폐 세포 현탁액 주 : 폐 백신 유발 적응성 면역 반응의 평가는 단일 세포 현탁액의 생성을 필요로한다. 이를 위해, 우리는 GentleMACS 티슈 dissociator를 사용한다. <ol><li> 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다. </li><li> 층류 후드 내부에서 L을 추출멸균 가위와 집게를 사용하여 깨끗한 표면에 배치 ungs. 면도 폐 기관지 및 결합 조직을 제거하고 (처리 될 때까지 얼음 상에 유지) PBS로 1.5 ㎖의 튜브에 폐를 옮긴다. </li><li> pH가 7.4, 150 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2, 1.8 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES-NaOH를 5 mL를 함유 기관 해리 (C-dissociator 튜브)에 대한 적절한 튜브에 폐를 배치, 휴대 정지를 생성하려면 완충기. </li><li> 콜라게나 D 100 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ (2 ㎎ / ㎖ 최종 농도)과의 DNase I 20,000 IU / ㎖의 40 μl를 (160 IU / ml의 최종 농도를 추가합니다. 주 : 콜라게나 D 또는 DNaseI의 스톡 솔루션은 각각이 1 ㎜ (V / V), 20 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5의 Y의 MgCl 동결 PBS 효소 또는 글리세롤 50 % 용해 제조된다. </li><li> 조직 dissociator에 튜브를 놓고 폐 조각에 대해 사전 정의 된 프로그램 m_lung_01를 사용합니다. 30 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 인큐베이션 튜브. </li><li> 장소 일전자 상기 dissociator 튜브 및 단일 세포 현탁액에 완전한 폐 균질화에 대해 사전 정의 된 프로그램 m_lung_02를 사용합니다. </li><li> 50 mL의 원심 분리 튜브에 장착 된 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 통과한다. RPMI 1640 배지 10 ㎖로 스트레이너 씻으십시오. </li><li> 원심 분리기 세포 400 XG에 5 분간 및 상층 액을 버린다. </li><li> 버퍼를 용균 적혈구의 1 ML을 추가 텍싱하여 혼합하고 실온에서 1 분 동안 품어. </li><li> 400 X g에서 5 분 동안 RPMI 1640 배지 및 원심 분리기 세포의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 완전 RPMI 1640 배지에 0.5 ㎖ 중의 재현 탁 된 세포를 10 % 열 - 불 활성화 된 태아 송아지 혈청 (FCS), 2 mM의 L 글루타민, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 IU / ㎖ 페니실린, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 첨가. 주 : FCS 30 분 동안 56 ℃에서 배양하여 비활성화된다. </li><li> 세포를 카운트 10 7 세포 / ml의 최종 세포 밀도에 도달하는 전체 RPMI에게 1640 배지를 추가합니다. 주 : 세포 수를 들어, 우리는 자동 세포 계수기를 사용한다. </li><li> U-바닥 96 웰 멸균 접시에 세포 현탁액을 100 μl를 배포 (10 6 세포 / 웰). </li><li> 상업 H37Rv 정제 된 단백질 유도체 15 ㎍ / ㎖ (PPD) (5 μg의 / ml의 최종 농도)로 전체 RPMI 1640 배지의 잘 50 μL /를 추가합니다. </li></ol></li><li> ELISA에 의해 사이토 카인 결정을위한 뜨는 수집 <ol><li> 4.1.14에서 37 ° C에서 48 시간 5 % CO 2 판을 품어. </li><li> 5 400 XG에 분, 상층 액 100 ㎕를 복구하기위한 원심 분리기 판. </li><li> -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 각각 IFNγ에 대한 분석 버퍼와 IL17A 결정에 상층 액을 1/10 및 1/2 희석. 제조업체 지침 (ELISA 개발 키트)에 따라, 상업 EL​​ISA 키트와 사이토 카인 농도를 결정합니다. </li></ol></li><li> 사이토 카인의 결정에 대한 세포 내 얼룩유동 세포 계측법에 의해 CD4 + 세포 -producing <ol><li> 4.1.14에서 37 ° C에서 18 시간 5 % CO 2 판을 품어. </li><li> 각 웰 (10 μg의 / ml의 최종 농도)에 Brefeldin 1 ㎎ / ㎖ (DMSO에 용해 주)의 1.5 μl를 추가 여섯 추가 시간 동안 배양한다. </li><li> 3200 XG에서 1 분 동안 4.3.2에서 접시를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 10 % FCS (1/500)를 RPMI 1640에 희석 항 - 마우스 CD4-FITC의 50 μL와에 재현 탁 세포를 4 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> , 3,200 XG에서 1 분 동안 4.3.4에서 접시를 원심 분리기 뜨는을 버리고 100 μL / 웰의 고정 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 20 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> permeabilization 용액 150 μL / 워시로 두 번 세포를 씻으십시오. 참고 : 10 배 농축 재고 1X 작업 용액을 제조 탈 이온수로 희석한다. </li><li> 안티 마우스 IFNγ-APC 및 항 - 마우스 IL17A - APC.Cy7의 50 μL에 재현 탁 세포는 permeabil에 희석화 용액 (1/250 모두 항체). </li><li> 실온에서 1 시간 동안 품어. </li><li> permeabilization 용액 150 μL / 워시로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 유동 세포 계측법 획득을위한 PBS 200 μL에 재현 탁 된 세포. </li></ol></li></ol> 기관지 폐포 세척에서 면역 글로불린 5. 분석 (BAL) <ol><li> BAL 샘플 획득 <ol><li> 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다. </li><li> 확인 완전히 절제하지 않도록하고, 적절한 정밀 멸균 집게와 가위를 사용하여 기관을 노출하고기도에 작은 상처를 수행합니다. BAL 샘플을 오염시킬 수있는 출혈을 일으킬 않도록주의하십시오. </li><li> 기관에 얼음처럼 차가운 PBS 800 μL와 멸균 1 ML의 주사기에 연결된 정맥을 소개합니다. </li><li> PBS를 폐하고 연구에 천천히 접종폐 붕괴를 방지하기 위해 매우 느리게 주사기의 피스톤을 후퇴 Ecover 주방 BAL 볼륨. 참고 : (500) 600 μL의 복구 만족입니다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 BAL 볼륨을 전송하고 그 혈액 (처리까지 얼음에 유지)에 오염되지 않은 나타내는, BAL은 채색 유지 확인합니다. </li><li> 새로운 튜브에 5 400 XG에 분 및 전송 상등액을위한 원심 분리기 BAL 샘플. </li><li> -80 ° C에서 보관 상층 액. </li></ol></li><li> BAL 상층 액에서의 IgA의 결정 참고 : 사용 된 모든 시약은 RT에 있습니다. <ol><li> M. (10 μg의 / ㎖) PBS에 희석 PPD 100 ㎕와 코트 고 단백질 결합 폴리스티렌 평면 바닥 96 웰 플레이트 결핵 - 특정의 IgA 결정, 또는 전체의 IgA 결정을 위해 PBS에 10 배 희석 BAL의 상층 액 100 ㎕와. </li><li> 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 뜨는을 취소하고 D에 종이 타월에 접시를 누릅니다공예. 200 μL / PBS 잘 씻으시오. </li><li> 200 μL / 웰의 소 혈청 알부민 (BSA) PBS-트윈 80, 0.05 % (부피 / 부피) (블로킹 완충액) (V / w) 1 %로 차단. </li><li> 실온에서 1 시간을 품어. </li><li> 200 μL / PBS-트윈 80 0.05 % (v / v)의 (세척 버퍼) 잘 한 번 씻으십시오. </li><li> PPD를 코팅 우물에 희석 BAL의 상층 액 100 μl를 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. 참고 : 전체의 IgA 결정은 PPD 별의 IgA와 병렬로 수행 할 경우,이 배양 동안 100 μL 세척 버퍼 전체의 IgA 우물을 둡니다. </li><li> 세척 buffer.0170004 200 μL / 웰로 3 회 세척 </li><li> 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)의 100 μl를 추가 버퍼 (1 / 10,000) 차단에 희석 항 - 마우스의 IgA를 π 공역 계. </li><li> 1 시간 RT를 품어. </li><li> 세척 완충액 200 μL / 웰로 5 회를 씻으십시오. </li><li> 3,3 100 ㎕ / 웰 추가 &#39;, 5,5&#39;- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB). t 실온에서 20 분 인큐베이션그는 어두운. </li><li> 100 μL / 웰의 H 2 SO 4 0.5N를 추가합니다. 파장 450 nm에서 분광 광도계 플레이트를 읽었다. </li></ol></li></ol> 폐 6. 세균 부하 결정 <ol><li> 폐 균질화 및 도금 <ol><li> 네 주 공격 후, 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다. </li><li> 층류 후드 내부의 평면 및 소독 표면에 고정 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. </li><li> 절개를 확인하고 흉부 영역을 볼 수 떠날 가슴 영역에서 피부를 제거합니다. </li><li> 갈비뼈를 잘라 멸균 가위와 집게를 사용하여 폐와 심장을 수확. 깨끗한 표면에 장기를 놓습니다. </li><li> 심장, 기관지 및 결합 조직을 제거하여 폐를 청소하고 1 ㎖ 탈 이온수에 1.5 ㎖의 튜브에 폐를 전송할(처리 될 때까지 얼음에 유지). </li><li> 탈 이온수 1 ml를 포함, - (dissociator 튜브 M) 장기 균질화에 대한 적절한 튜브에 각 마우스의 폐를 전송하는 멸균 집게를 사용합니다. </li><li> 조직 dissociator에 튜브를 놓고 폐를 균질화하는 미리 정의 된 프로그램 RNA_1를 사용합니다. </li><li> 900 μL에 희석 폐 균질 100 ㎕를 시작으로 1.5 ml의 튜브에 5 ~ 10 배 연속 희석을 확인합니다. </li><li> 플레이트 희석은 1.11-1.14에 설명 된대로. </li></ol></li><li> PCR에 의해 BCG와 H37Rv 사이의 차별화 참고 : 비강 내 경로에 의해 BCG 접종 그룹에 해당하는 6.1.6에서 판에서, 우리는 CFU가 백신 수여 예방 효과가 맞습니다 평가로 간주하도록 BCG와 H37Rv 사이의 안목 PCR에 의해 식민지의 대표 번호를 분석 고유 H37Rv합니다. RD9이 PCR 표적 증폭, BCG와 M. 너와 다른 게놈 영역berculosis, H37Rv에 대한 2618 bp의 및 BCG (11)에 대한 465 염기쌍의 단편을 제공. <ol><li> PCR 튜브에 (9 μL / 샘플)을 배포 한 후 표시로 샘플 당 볼륨이있는 모든 샘플에 대한 마스터 믹스 재고를 준비합니다. 참고 : 버퍼 5 배 : 2 μL. 앞으로 프라이머 25 μM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC) : Taq 중합 효소에게, μl의 5 단위 / 0.32 μL : 0.32 μL는 프라이머 25 μM (GCCCAACAGCTCGACATC)를 역 0.04 μL, 탈 H 2 O : 6.32 μl를. </li><li> 멸균 된 이쑤시개로 콜로니를 터치 마스터 믹스를 함유하는 PCR 튜브에 샘플 이쑤시개 젖어. </li><li> 다음 프로그램으로 PCR을 실행 : 10 분 ~ 95 ° C (이 단계는 박테리아 중단을 유발하는 것입니다), 10 분, 95 ° C, 1 분, 95 ° C에서 35주기 (30 초 (이 단계는 박테리아 혼란을 유발하는 것입니다) 58 ° C와 4 분 72 ° C에서)에서. </li><li> 단편을 시각화 티듐 브로마이드 실행 샘플을 1 % 아가 로스 겔에서 PCR 샘플을로드. </l난&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WHO+2014+global+tuberculosis+report--further+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go.</a> Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).</li>
<li>Mangtani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+BCG+vaccine+against+tuberculosis%3A+a+systematic+review+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials.</a> Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+dose-dependent+superior+protection+compared+to+that+of+subcutaneous+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).</li>
<li>Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+intranasal+mucosal+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+improved+protection+compared+to+subcutaneous+vaccination+against+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis.</a> Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).</li>
<li>Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+intranasal+vaccination+with+Mycobacterium+bovis+BCG+against+airway+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).</li>
<li>Lagranderie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG-induced+protection+in+guinea+pigs+vaccinated+and+challenged+via+the+respiratory+route%5BTitle%5D)+AND+%22Tuber+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route.</a> Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).</li>
<li>Gopal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17-dependent+CXCL13+mediates+mucosal+vaccine-induced+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis.</a> Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).</li>
<li>Khader, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+and+IL-17+in+the+establishment+of+protective+pulmonary+CD4%2B+T+cell+responses+after+vaccination+and+during+Mycobacterium+tuberculosis+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge.</a> Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+but+Not+Subcutaneous+Delivery+of+BCG+Vaccine+Confers+Protection+to+Tuberculosis-Susceptible+Mice+by+an+Interleukin+17-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism.</a> J Infect Dis. , (2015).</li>
<li>Middlebrook, G., Cohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriology+of+tuberculosis%3A+laboratory+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Public+Health+Nations+Health%22%5BJournal%5D)">Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods.</a> Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).</li>
<li>Brosch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+evolutionary+scenario+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).</li>
<li>Kaushal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccination+with+attenuated+Mycobacterium+tuberculosis+induces+strong+central+memory+responses+and+protects+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis.</a> Nat Commun. 6, 8533(2015).</li>
<li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).</li>
<li>Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transport+within+cerebral+perivascular+spaces+underlies+widespread+tracer+distribution+in+the+brain+after+intranasal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).</li>
<li>Griffiths, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+enhances+vaccine-induced+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> PLoS One. 8 (10), e78312(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+Th17+cells+in+Peyer%27s+patches+is+responsible+for+the+induction+of+T+cell-dependent+IgA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses.</a> Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).</li>
<li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li>
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현재 결핵 백신인 BCG는 역사상 가장 널리 투여된 백신이지만 결핵은 전 세계적으로 전염병으로 인한 사망 및 이환율의 주요 원인 중 하나로 남아 있습니다. 이 역설은 전염의 원인 형태인 폐결핵에 대한 이 백신의 보호 부족으로 설명됩니다. 폐 형태의 질병에 효과적인 새로운 예방 접종 접근법은 전 세계적으로 질병 전파에 가장 큰 영향을 미칠 것이기 때문에 시급히 필요합니다.
우리의 데이터는 자연적인 감염 경로를 모방하기 위해 BCG 투여 경로를 변경하는 것이 폐결핵을 예방하는 성공적인 전략이 될 수 있음을 분명히 보여줍니다. 우리의 결과는 기니피그와 비인간 영장류(NHP) 6,9,12를 포함한 다양한 동물 모델에서 동등한 데이터를 보여주는 다른 저자와 일치합니다.
놀랍게도, 우리의 미공개 데이터는 비강내 경로에 의한 투여량이 프로토콜의 중요한 단계임을 나타냅니다. 이러한 결과는 10μl(40μl 대신)에 재현탁된 ...

결핵 (TB)는 TB 놀라운 세계 보건 문제 일 수 있습니다 세계에서 HIV보다 더 많은 관련 사망의 원인이되는 주요 감염 질환 중 하나 다 약제 내성 균주의 증가 증가와 결합이다. 새로운 진단 도구,보다 효과적이고 독성이 적은 약물, 새로운 안전하고 효과적인 결핵 백신은 특히 개발 도상국에서, 긴급한 필요하다. 감쇠 Bacille 칼 메트 - GUERIN은 (BCG)은 현재 전 세계적으로 1970 년대 이후 출생시 피내 투여 된 TB, 대한 전용 허가 백신 살고있다. BCG는 아이들의 질환 (수막염 및 속 립성 결핵)의 심한 형태의 예방에 효과적인 것으로 간주되지만, 질병 전파 (2)의 책임 폐결핵에 대한 일관성 효과를 보여 주었다. TB 감염의 자연 경로를 모방 폐 예방 접종은 로컬 호스트 면역 반응을 프라이밍위한 매력적인 접근 방식을 나타냅니다에스. 피하 또는 피내 경로 3-6에 비해 이와 관련하여, 다른 관련 TB의 동물 모델에서 다양한 전임상 작품 폐 면역화 다음 큰 백신 효능을 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 폐 예방 접종에 의해 유발 보호 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 지난 몇 년 동안, 여러 작품 IL17 점막 백신에 의한 예방 효과에 대한 결핍 된 마우스 모델에서와 같이, TB-특정 점막 면역 반응의 중요한 요소로 IL17 중재 응답으로 지적은 7,8를 손상된다. 최근에 우리는 BCG 관리는 DBA / 2 마우스, 피하 BCG 예방 접종 9 후 보호의 부족을 특징으로하는 마우스 변형을 보호 비강 처음으로 보여 주었다. 이러한 결과는 호흡기 결핵 예방 접종은 피내 BCG가 pulmon에 대한 효과로 간주됩니다 발병 국가에서 TB의 비율을 감소 시키는데 더 효과적 일 수 있다고 제안진 TB.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 국물</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3mm 직경 유리 구슬</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1ml 주사기 26GA 0.45 x 10mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x 농축</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x</td></tr><tr><td>농축 태아 송아지 혈청</td><td>생물학 산업</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>셉터 2.0 핸드헬드 자동 세포 계수기</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>셉터 세포 계수기 센서, 40 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IFN-&gamma; ELISA 개발 키트&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL17A ELISA 개발 키트&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 키트</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 쥐 안티 마우스 IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 안티 IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4 인치</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td> 소 혈청 Sigma A4503 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Goat Anti-Mouse IgA(&alpha;-chain specific)&마이너스에서 BAL <tr><td>고단백질 결합 폴리스티렌 플랫 바텀 96웰 플레이트 MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr> Albumin의 기관 캐뉼라로 사용<tr><td>; 과산화효소 항체</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA 중합효소</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>키트에는 버퍼 5x가 포함되어 있습니다.</td></tr></tbody></table>

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 bcg 관리에 따라

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

피내 BCG 백신 접종에 대한 전 세계적인 보도에도 불구하고 결핵은 여전히 세계에서 가장 널리 퍼진 전염병 중 하나입니다. 전임상 데이터는 폐결핵 백신이 전염의 원인이 되는 폐질환을 예방하기 위한 유망한 전략으로 장려하고 있습니다. 이 연구에서는 피하 백신과 비교할 때 비강 내 BCG 백신 접종의 이점을 마우스 모델에서 입증하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 본 연구의 데이터는 비강 내 BCG 투여 후 더 큰 보호 효능을 나타냈다. 또한, 본 연구 결과는 폐 백신 접종이 Th1 및 Th17 반응을 포함한 폐의 면역 반응을 높이고 호흡기 기도의 면역글로불린 A(IgA) 농도를 증가시킨다는 것을 나타냅니다. 본 연구의 데이터는 Mycobacterium tuberculosis 챌린지 후 폐에서 IL17 생성 세포의 존재와 보호 효능 사이의 상관관계를 보여주며, 이는 폐 백신 접종에 의해 부여되는 보호 반응에서 이 사이토카인의 역할을 시사합니다. 마지막으로, BCG 외에 다른 결핵 백신으로 외삽할 수 있는 마우스 모델에서 호흡기 백신 접종을 연구하기 위해 개발한 글로벌 워크플로우를 자세히 설명하며, 이는 점막 반응 또는 기관내 또는 에어로졸과 같은 다른 폐 투여 경로를 표적으로 합니다.

피하 및 비강 :이 작품은 BCG의 관리의 두 경로의 비교에 대해 설명합니다. 피하 전세계 BCG 현재 임상 경로 인 피내, 비슷하다. 백신의 비내 경로 M.의 감염 천연 경로를 모방하는 것을 목표 목적으로 결핵은 폐에 직접 병원체의 주요 표적 장기를 면역 반응을 유도한다. 그림 1은 다음 워크 플로를 설명합니다. 십주 된 여성 DBA에 여덟은 / 2 마우스는 행정의 피하 또는 비강 경로로 106 CFU BCG의 덴마크어로 예방 접종을하고 있습니다. 여덟 주 후에 쥐의 그룹은 백신에 의한 폐의 면역 반응을 분석하기 위해 희생된다. BAL 샘플을 먼저 얻을 수있다, 그리고, 우리는 폐를 수확. 백신 수여 예방 효과를 연구하기 위해, 우리는 differe 접종M.의 ...

본 문서에서는 마우스 모델에서 BCG를 사용하여 비강 내 및 피하 면역에 의해 유도된 보호 효능 및 폐 면역 반응을 비교하기 위해 따랐던 방법론을 자세히 설명합니다. 본 연구의 결과는 폐 백신 접종의 이점을 보여주며, 백신 유도 보호에서 IL17 매개 반응의 역할을 시사한다.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

본 절차의 전반적인 목적은 결핵 백신 접종 후 폐에서 나타나는 면역 반응을 연구하는 것이며, 여기에는 비강 내 챌린지에 대한 백신의 보호 효능과 백신으로 인해 유도된 국소 폐 면역 반응이 포함됩니다. 이 방법론은 최적의 폐 면역 보호를 위해 폐 백신에 의해 유도되는 방어적 폐 면역 반응의 식별을 포함하여, 결핵 백신 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 장점 중 하나는 동물 모델의 폐 면역 반응을 보호 효능과 병행하여 개별적으로 평가할 수 있다는 점입니다.보호 효과와 상관관계가 있는 특정 면역 파라미터를 식별할 수 있습니다. BCG 백신을 피하 투여하려면, 먼저 26 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 BCG 백신 현탁액 1 mL를 채우고 기포를 제거합니다. 그다음 마취된 마우스를 층류 후드(Laminar flow hood) 내에서 복와위로 놓은 후, 뒷다리 옆구리 부위에 100 µL의 박테리아를 피하 접종합니다.비강 내 투여를 위해, 마이크로피펫에 BCG 현탁액 20 µL를 취한 후 마취된 마우스를 후드 내에서 앙와위(supine position)로 배치합니다. 20 µL의 전체 부피가 모두 투여될 때까지 두 콧구멍 사이에 접종액을 한 방울씩 투여하며, 마우스가 현탁액을 흡입할 수 있도록 방울 사이에 시간 간격을 둡니다. 그 후, 마이크로피펫에 세균 20 µL를 다시 취하여 투여 과정을 반복합니다.H37Rv 결핵균(microbacterium tuberculosis) 균주를 이용한 비강 내 챌린지를 위해, 백신 접종 후 적절한 실험 시점에 앞서 시연한 바와 같이 H37Rv 세균 현탁액 40 microliters를 비강 내로 투여하여 동물에게 접종합니다. 기관지폐포 세척액 또는 볼 샘플을 얻으려면, 먼저 멸균 핀셋과 가위를 사용하여 기관을 노출시킵니다. 그런 다음 조직을 완전히 절제하지 않도록 주의하며 기관에 작은 절개창을 내고, ice-cold PBS 800 microliters가 들어 있는 멸균 1 mL 주사기에 연결된 캐뉼라를 삽입합니다.캐뉼라가 제대로 삽입되면 PBS를 폐에 조심스럽게 채운 다음, 플런저를 천천히 당겨 최소 500~600 $\mu\text{L}$의 세척액을 회수합니다. 회수된 액체를 얼음 위에 둔 1.5 mL 튜브에 분주하고, 현탁액에 색이 없는지 확인하여 혈액 오염이 없음을 확인합니다. 샘플은 세포 처리 전까지 얼음 위에 보관하십시오.폐의 세균 수치

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 생쥐의 Bordetella 백일해 감염에 대한 무세포 백일해 백신의 효능을 테스트하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 백신 접종 후, 생쥐는 감염을 겪었고, 생쥐의 조직 균질액을 배양하여 박테리아 군체를 분석하여 백신으로 인한 보호 면역을 판독했습니다.

마우스 모델에서 박테리아 감염에 대한 백신 유도 면역 평가

이 비디오는 마우스의 비강 내 BCG 면역을 보여주며, 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 모두 활성화하여 폐 상주 기억 T 세포와 효과기 B 세포의 발달로 이어져 마이코박테리움 감염에 대한 보호를 강화합니다.

마우스 모델에서 BCG를 사용한 비강 내 면역

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

본 연구는 폐의 선천성 면역 반응을 촉진하고 마우스의 급성 폐렴구균성 폐렴을 예방하기 위해 설하 면역요법을 사용하는 것의 편리함을 보여줍니다.

대안으로 설하 면역 요법은 급성 호흡기 감염에 대한 보호를 유도하기 위해

장기 배양 인터페론 γ 효소 - 결합 된 Immunospot 분석은 중앙 메모리 응답의 척도로서 사용하고 보호 항 미코 박테리아 백​​신 응답과 상관된다. 이 분석을 통해, 말초 혈액 단핵 세포는 마이코 박테리아 항원과 인터루킨 -2 14 일 동안 활성화, 분화 및 중앙 메모리 T 세포의 확장을 자극.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

기니 돼지 PBMCs에 대 한 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과 개발 전염병 연구이 관련성이 높은 모델 T 세포 응답의 특성을 수 있습니다. 우리는 DNA 백신의 피부 전달과와 관련 된 T 세포 응답을 측정 하는 분석 결과 적용 했습니다.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

학습하세요 마우스 모델에서 피하 및 비강 BCG 백신 접종의 보호 효능과 폐 면역 반응을 비교하는 방법을. IL17 매개 면역 반응과 특정 면역 매개변수를 식별하여 결핵 백신 개발에 기여합니다.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

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