F9를 RARE-LacZ를 셀 기반 리포터 분석을 사용하여 E8.5 배아 및 Neurosphere 문화에서 상대 레티노 산 수준의 정량적 측정

본 절차의 전반적인 목표는 세포 기반 리포터 어세이를 사용하여 E8.5 마우스 배아 또는 성체 신경구 배양물과 같은 조직 표본 내의 상대적 레티노산(retinoic acid) 수치를 정량적으로 측정하는 것입니다. RA 신호 전달 경로는 잘 규명되어 있으나, RA를 직접 조직학적으로 측정하는 것은 기술적으로 불가능합니다. 본 어세이는 유전자 돌연변이가 RA 수치에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 핵심적인 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 매우 민감하고 다용도로 활용 가능하다는 것이며, 다양한 조직 샘플에서 광범위한 RA 농도를 측정할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 다양한 조직 샘플 내의 RA 수치를 결정하는 데 직접적인 통찰을 제공할 뿐만 아니라, RA 수치의 변화를 모니터링하여 RA 대사 효소의 존재 여부를 결정하는 등의 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 모든 실험을 시작하기 전에, F9 RARE-LacZ 세포의 RA에 대한 반응을 테스트하십시오. 96-well 플레이트에 분주된 F9 RARE-LacZ 세포에 1 nM의 all-trans RA를 첨가하십시오.

그다음, 플레이트를 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, LacZ 염색을 수행하여 세포에 청색 침전물이 형성되었는지 확인합니다. 세포 전체의 색상이 균일하지 않은 경우, 해당 세포를 서브클로닝합니다.

선택한 배양액을 10 cm 디쉬에 10 mL당 100,000 cells의 밀도로 분할 배양합니다. 2일간 배양 후, 24-well 플레이트의 각 웰에 0.2% gelatin 500 µL를 넣어 준비하고, 플레이트를 상온에서 30분 동안 방치합니다. 그 다음, gelatin을 제거하고 500 µL의 증류수로 웰을 2회 세척합니다.

이제 각 웰에 F9 RARE-LacZ 세포 배양액 500 µL를 첨가합니다. 다음으로, 멸균된 P10 피펫 팁을 사용하여 F9 세포 콜로니를 채취해 각 웰에 하나씩 옮깁니다. 3~4일간 배양한 후, 콜로니를 젤라틴 코팅된 24-웰 플레이트 두 개로 나누어 하나는 테스트용으로, 다른 하나는 증식용으로 사용합니다.

이틀 더 배양한 후, 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 nanomolar의 RA를 첨가하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, LacZ 염색을 실시하여 고반응군을 확인하고 해당 배양물을 확장합니다. E8.5 배아를 수확하거나 신경구(neurosphere)를 해리하기 하루 전, 96-웰 플레이트의 웰당 100 microliters의 0.2% gelatin으로 코팅하고 30분 동안 그대로 둡니다.

그 후, 젤라틴을 흡입하여 제거하고 각 웰을 200 µL의 증류수로 두 번 헹굽니다. 다음으로, 10 cm 디쉬에서 배양 중인 선택된 F9 RARE-LacZ 세포를 트립신 처리합니다. 그런 다음, G418이 포함되지 않은 배양액을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 100,000개의 세포를 분주합니다.

각 배아를 공동 배양할 수 있을 만큼 충분한 웰에 분주하거나, 뉴로스피어(neurosphere)를 사용하는 경우 유전자형당 3개의 웰을 준비하십시오. 또한 표준 곡선을 위해 24개의 웰을 준비합니다. 그 다음, 플레이트를 24시간 동안 배양하십시오.

배아 세포 공동 배양을 위해 E8.5 배아의 박리를 시작합니다. 다음으로, 새로운 1.5 milliliter 튜브에 10 microliters의 trypsin을 넣고, 넓은 구경의 P20 피펫 팁을 사용하여 배아 전체를 튜브로 옮긴 후 튜브를 얼음 위에 둡니다. 모든 배아가 분리되면, 조직을 해리시키기 위해 모든 튜브를 37 degrees Celsius에서 5분 동안 배양합니다.

5분 후, P20 피펫 팁을 사용하여 각 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합한 다음, F9 RARE-LacZ 세포가 준비된 96-웰 플레이트의 웰에 10 µL를 옮깁니다. 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 신경구(neurosphere) 공배양의 경우, 먼저 신경구 배양물을 15 mL 튜브로 옮기는 단계부터 시작합니다.

튜브를 200 g에서 10분 동안 원심 분리하고, 상층액을 1 mL만 남기고 모두 제거합니다. 그 후, P1000 피펫을 사용하여 내용물을 혼합합니다. 이제 소량의 샘플을 취해 해리된 세포의 밀도를 측정합니다.

그 다음, 100,000개의 해리된 신경구 세포를 F9 RARE-LacZ 세포 위에 분주합니다. 각 신경구 배양 유형별로 3개의 웰에 분주하십시오. 이제 표준 곡선 작성을 위한 웰을 준비하시기 바랍니다.

F9 RARE-LacZ 배양 배지에서 7가지 서로 다른 농도로 연속 희석하여 준비한 all-trans RA 용액 100 µL를 3반복으로 첨가합니다. 처리하지 않은 세포를 음성 대조군으로 포함합니다. 마지막으로, 모든 웰이 채워진 96-웰 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 배지를 제거하고 웰당 100 µL의 2.5% glutaraldehyde를 사용하여 배양물을 고정합니다. 플레이트를 상온에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 고정액을 제거하고 200 µL의 PBS로 웰을 2회 세척하며, 세척당 10분씩 소요합니다.

다음으로, 각 웰을 200 µL의 LacZ 세척 용액으로 10분씩 3회 세척합니다. 세 번째 세척 단계 동안, 호일로 감싼 15 mL 튜브에 X-gal 염색 용액을 준비합니다. 또한, 96-웰 플레이트용 습윤 챔버를 준비합니다.

이제 각 웰에 200 µL의 X-gal 염색 용액을 추가합니다. 플레이트를 습윤 챔버 안에 넣고 37 °C에서 배양합니다. 배양이 끝나면 LacZ 염색 용액을 제거하고 200 µL의 PBS로 교체합니다.

그런 다음, 610 nanometers에서 흡광도를 측정하고 플레이트를 촬영합니다. F9 RARE-LacZ 리포터 세포주는 부착성 배아 암세포로 구성되어 있으며, beta-galactosidase의 비례적 유도를 통해 RA에 정량적으로 반응합니다. 또한 이들은 상피세포 형태를 나타냅니다.

G418 선택 배지에서 배양함에도 불구하고, 이 세포들의 RA에 대한 반응은 여러 차례의 계대를 거치며 약해집니다. 따라서 RA에 대해 강하고 균일한 반응을 보이는 세포를 확보하기 위해서는 주기적인 서브클로닝이 필요합니다. Gpr161의 vl 돌연변이에 대해 동형접합체인 E8.5 배아는 배아 RA 신호 전달이 감소할 것으로 예상됩니다. 해리된 배아와 F9 RARE-LacZ 세포를 이용한 앞서 설명한 공동 배양 분석법을 통해 이러한 예상 결과가 확인되었습니다.

RA 농도를 확인하기 위해 야생형 성체 유래 신경구(neurosphere)와 F9 RARE-LacZ 세포를 공동 배양하였습니다. E8.5 단계의 세포와 비교했을 때 염색이 증가한 것은 신경구 배양의 균질성 때문일 수 있습니다. RA 수치에 대한 표준 곡선을 생성함으로써, 야생형 신경구 배양물과 E8.5 배아 내의 RA 수치를 정량화할 수 있었습니다.

이 절차를 수행하는 동안, RA에 강력하게 반응하는 F9 RARE-LacZ 세포를 주기적인 서브클로닝을 통해 유지해야 함을 기억하십시오. 또한, 균질한 분포와 일관된 RA 측정을 위해 샘플을 충분히 해리시켜야 합니다. 이 절차를 통해 유전자 돌연변이가 RA 수치에 미치는 영향을 조사할 수 있으며, 이후 RA 신호 전달 경로의 어떤 구성 요소가 직접적으로 영향을 받는지 조사하기 위한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.