Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

이 절차의 전반적인 목표는 미생물이 실험실 조건에서 진화할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 부신 기능 관계, 스트레스 반응, 대사 공학, 그리고 당연히 진화와 같은 미생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 특정 실험실 조건 하에서 가장 적합한 후손을 지속적으로 선택할 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 장비와 초기 배지, 스트레스 배지 및 고스트레스 배지의 준비로 이 절차를 시작하십시오. 초기 배지 4 mL가 들어 있는 15 mL 시험관에 단일 콜로니 또는 야생형 E.coli를 접종하십시오. 시험관을 진탕 배양기에서 37 °C, 220 rpm으로 12시간 동안 배양하십시오.

폭기 및 교반이 이루어지는 37 °C에서 케모스탯(chemostat) 용기를 6시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 펌프의 실리콘 튜브 끝부분을 케모스탯 용기에 무균적으로 연결합니다. 1 mL의 전배양액을 케모스탯 용기로 무균적으로 옮깁니다.

배출 펌프를 작동시켜 대수 성장기의 배양액을 수집합니다. 배출 튜브에서 배양액의 600nm에서의 흡광도를 확인합니다. 그 후, 유입 펌프를 작동시킵니다.

24시간마다 배출 튜브에서 600 nanometers의 배양액 광학 밀도를 확인하십시오. 9.6회의 완전 회전(full turnover)에 해당하는 96시간 동안 케모stat을 작동시킨 후, 저장조를 가장 낮은 농도의 고스트레스 배지로 교체하십시오. 저장조를 더 높은 스트레스 배지로 교체할 때 세포에 충격이 가해질 수 있습니다.

세포 밀도가 너무 낮으면, 세포 밀도를 회복시키기 위해 고스트레스 배지 공급을 잠시 중단하십시오. 광학 밀도가 0.2보다 낮으면, 유입 펌프의 공급을 6시간 동안 중단하십시오. 유입 펌프를 다시 가동하고 광학 밀도가 0.2 이상인지 확인하십시오.

더 높은 농도의 스트레스 요제가 포함된 저장조로 점진적으로 교체하여 스트레스 요제의 농도를 서서히 높입니다. 적응 배양이 스트레스 요제 적응 마일스톤에 도달할 때마다 샘플을 채취하여 향후 게놈 분석을 위해 보관합니다. 샘플 보관을 위해 0.5 milliliter의 배양 샘플을 0.5 milliliters의 멸균된 80%glycerol 용액과 혼합하고 80 degrees celsius에서 보관합니다.

배지와 동일한 농도의 동일한 스트레스 요인이 포함된 1.6% 한천 플레이트 배지를 준비합니다. 케모스탯의 배출 배양액 0.1 mL를 플레이트에 도말하고 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양 후, 멸균된 이쑤시개를 사용하여 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고, 케모스탯과 동일한 농도의 스트레스 요인 및 배지 농도로 구성된 15 mL 시험관에 접종합니다.

6시간 동안 배양합니다. 배양액 1 mL를 50 mL의 배지가 들어 있는 250 mL 삼각플라스크에 옮깁니다. 매시간 0.5 mL의 배양액을 수확하여 600 nm에서 흡광도를 측정합니다.

스트레스 요인이 주어진 상태에서 적응된 균주의 성장률을 야생형 균주의 성장률과 비교하십시오. 야생형 E.coli 균주는 고농도 숙신산 스트레스 조건에서 270일 동안 진화되었으며, 이는 약 930세대에 해당합니다. 더 높은 숙신산 스트레스가 가해질 때마다 바이오매스 농도는 즉시 감소했다가 이후 회복되었습니다.

여기에는 고농도 숙신산 스트레스에 내성이 있는 돌연변이주를 이용한 케모스탯의 모식도가 나와 있습니다. 스트레스 조건 하에서 대부분의 야생형 세포는 씻겨 나가고 돌연변이주가 더 많이 성장합니다. 결과적으로, 돌연변이 후손의 개체 수가 증가하게 됩니다.

두 번째와 세 번째 돌연변이가 지속적으로 선택되어 결국 케모스탯 내에서 우세해집니다. 이 그림은 적응된 균주가 고농도 숙신산 스트레스 조건에서 지체 없이 성장한 반면, 야생형 균주는 그렇지 않았음을 보여줍니다. 유사한 전략을 다양한 스트레스 요인을 이용한 케모스탯 기반의 적응적 실험실 진화에 적용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 지정된 조건 하에서 미생물을 획득하고 진화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련되면 이 기술은 몇 달 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 한꺼번에 너무 많은 스트레스를 가해 케모스탯(chemostat) 세포가 씻겨 내려가지 않도록 주의하고, 매일 광학 밀도를 확인하는 것이 중요합니다.

이 절차 이후에는 어떤 돌연변이가 스트레스 내성 진화에 기여하는가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 게놈 분석 및 전사체 분석과 같은 방법들을 수행할 수 있습니다.