Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

이 절차의 전반적인 목표는 미생물이 실험실 조건에서 진화할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 부신 기능 관계, 스트레스 반응, 대사 공학 및 진화와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 실험실 조건에서 가장 확실한 후손을 지속적으로 선택한다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 초기 매체, 응력 매체 및 높은 응력 매체뿐만 아니라 장비를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 4ml의 초기 배지가 포함된 15ml 시험관에 단일 콜로니 또는 야생형 대장균을 접종합니다. 시험관을 진탕 인큐베이터에서 섭씨 37도, 220rpm에서 12시간 동안 배양합니다.

화학요법 용기를 배양하여 섭씨 37도에서 6시간 동안 통기 및 교반을 제공합니다. 배양 후 펌프의 실리콘 튜브 끝을 화학 물질 용기에 무균 적으로 연결합니다. 무균 방식으로 1ml의 사전 배양을 화학 물질 용기에 옮깁니다.

배출 펌프를 시작하고 지수 단계에서 배양을 수집합니다. 배출 튜브에서 배양의 600나노미터에서 광학 밀도를 확인합니다. 그런 다음 흡입 펌프를 시작하십시오.

24시간마다 배출 튜브에서 600나노미터에서 배양물의 광학 밀도를 확인합니다. 96시간 동안 화학체를 작동한 후(9.6 전체 회전율) 저장소를 가장 낮은 농도의 고응력 매체로 교체하십시오. 저장소를 더 높은 응력의 매체로 교체하면 세포가 충격을 받을 수 있습니다.

세포 밀도가 너무 낮으면 세포 밀도를 복원하기 위해 일정 시간 동안 더 높은 응력 매체에 대한 공급을 중단하십시오. 광학 밀도가 0.2 미만이면 급수 흡입 펌프를 6시간 동안 정지하십시오. 흡입 펌프를 다시 시작하고 광학 밀도가 0.2 이상인지 확인하십시오.

더 높은 스트레스 요인 농도를 포함하는 저장소로 점진적으로 변경하여 스트레스 요인의 농도를 점진적으로 증가시킵니다. 스트레스 요인 적응 이정표에 도달할 때마다 적응된 배양의 샘플을 채취하고 추가 게놈 분석을 위해 보관합니다. 시료 보관을 위해 0.5mL 배양 시료를 0.5mL의 멸균된 80% 글리세롤 용액과 혼합하여 섭씨 80도에서 보관하십시오.

배지와 동일한 농도에서 동일한 스트레스 요인을 포함하는 1.6% 에이저 플레이트 배지를 준비합니다. 화학 물질에서 배출구 배양을 0.1 밀리리터로 플레이트화하고 섭씨 37도에서 16 시간 동안 배양합니다. 배양 후 멸균 이쑤시개를 사용하여 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 화학요법과 동일한 스트레스 요인 및 동일한 중간 농도를 함유한 15ml 시험관에 접종합니다.

6시간 동안 배양합니다. 배양 육수 1ml를 배지 50ml가 들어 있는 250ml 삼각 플라스크에 옮깁니다. 매시간 0.5ml의 배양 배지를 수확하고 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.

적응된 균주의 성장 속도를 스트레스 요인이 주어졌을 때 야생형 균주의 성장 속도와 비교합니다. 야생형 대장균 균주는 거의 930 세대에 해당하는 270 일 동안 높은 숙시네이트 스트레스 조건에서 진화했습니다. 더 높은 석시네이트 응력이 추가될 때마다 바이오매스 농도는 즉시 낮아졌다가 다시 회복되었습니다.

여기에 표시된 것은 높은 석시네이트 응력에 내성이 있는 돌연변이가 있는 화학체의 개략도입니다. 대부분의 야생형 세포는 스트레스 조건에서 씻겨 나가고 돌연변이체는 더 많이 자랍니다. 결국, 돌연변이 후손의 개체수가 증가합니다.

두 번째와 세 번째 돌연변이는 화학항진을 위해 지속적으로 선택되고 결국 우세합니다. 이 그림은 적응된 균주가 높은 숙시네이트 응력 조건에서 지체 없이 성장한 반면 야생형 균주는 그렇지 않았음을 보여줍니다. 유사한 전략이 다양한 스트레스 요인과 함께 화학 물질을 사용하는 적응형 실험실 진화에 적용될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 지정된 조건에서 미생물을 획득하고 진화시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 몇 달 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 한 번에 너무 많은 스트레스를 가하여 화학자 세포를 씻어내지 않도록 기억하고 매일 광학 밀도를 확인하는 것을 잊지 않는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 게놈 분석 및 전사체 분석과 같은 방법을 수행하여 스트레스 내성 진화에 기여하는 돌연변이와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.