미세 유동 프로브와 라이브 셀 레이어의 빠른 빼기 패터닝

이 비디오 기사에 제시된 방법의 주요 목표는 공간적으로 정의된 세포 패턴을 신속하게 생성하여 세포 간 상호 작용의 현장 시공간 분석을 용이하게 하는 것입니다. 제시된 전략은 미세유체 프로브 기술을 활용합니다. 미세 제작된 프로브 헤드는 나노리터 부피의 생체 화학 물질을 생물학적 기질에 국소화하여 세포 단층을 패턴화합니다.

MFP 기반 패터닝 기술의 주요 장점은 국부 용해로 인해 거의 즉각적으로 발생하므로 패턴을 실시간으로 수정할 수 있다는 것입니다. 세포 패턴을 생성하는 다른 방법에는 세포 패턴의 성공을 실제로 보기 전에 긴 다단계 프로토콜이 필요하다는 것을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠올랐습니다. 세포 표면에서 유체역학적 유동 구속으로 안정적인 실험을 실행하려면 MFP 매개변수를 최적화해야 합니다.

이를 위해서는 시각적 시연이 중요합니다. Aditya Kashyap과 Julien Cors가 이 절차를 시연할 것입니다. 플랫폼의 작동 모듈은 전동 주사기, 전동 스테이지 및 컨트롤러로 구성됩니다.

MFP는 헤드와 기판 사이의 갭 거리를 제어하기 위해 전동 Z-stage에 연결되며, 기판 홀더는 스캐닝 시스템을 구성하는 X 및 Y 전동 스테이지에 부착됩니다. MFP 헤드에는 펌핑 스테이션에 연결하기 위한 유체 바이어스, 헤드를 Z-스테이지에 장착하기 위한 장착 구멍, 연마된 정점에서 나오는 채널이 있습니다. 정점은 세포 배양 기질과 동일 평면상에 설정됩니다.

펌핑 스테이션 및 유체 취급 장치를 준비하려면 생세포 실험 전후에 초순수에서 초음파 처리 및 0.5% 표백제 용액으로 주사기와 주사기 플런저를 세척합니다. 물로 철저히 헹굽니다. 주사기 끝을 수조에 완전히 담그고 플런저를 사용하여 흡입하여 주사기에 물을 채웁니다.

수조 내에서 주사기 샤프트가 주사기 출구의 씰과 접촉하도록 액체를 퍼지합니다. 주사기 기둥에 기포가 보이지 않을 때까지 계속 흡입하고 퍼지합니다. 채워진 주사기를 lower-lock 커넥터를 사용하여 주사기 펌프에 연결합니다.

펌프에 장착된 스위치 밸브를 사용하여 주사기의 액체를 MFP 헤드 또는 액체 저장소로 이어지는 두 개의 모세관 중 하나로 향하게 합니다. 주사기의 크기에 따라 분당 약 10-50마이크로리터의 유속으로 주사기에 약 10-50마이크로리터의 물이 남을 때까지 주사기의 물로 두 모세혈관을 모두 퍼지합니다. 표준 세척을 위해 유리 제품 세제를 사용하거나 엄격한 세척을 위해 0.5% 표백제를 사용하여 5분 동안 MFP 헤드를 초음파 처리하여 청소합니다.

정점을 물에 담그고 비아에 진공을 적용하여 물로 채널을 퍼지합니다. 실체 현미경으로 채널에 잠재적인 장애물이 있는지 검사하고 필요한 경우 이전 단계를 반복합니다. 그런 다음 청소한 헤드를 헤드 홀더에 장착하고 커넥터를 헤드에 나사로 고정합니다.

퍼지된 모세관을 헤드의 채널 바이어스와 인터페이스하는 적절한 미세유체 커넥터 어댑터에 삽입합니다. 헤드 홀더를 Z-stage에 나사로 고정합니다.tage는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 종말점 보정을 수행하기 전에 헤드와 셀 단층 사이의 갭 거리를 제어하는 데 사용됩니다. MFP 헤드를 셀이 없는 챔버 슬라이드 위로 가져오고 5미크론 단계로 천천히 내려가면서 조잡한 제로 갭 거리를 얻습니다.

프로브가 기판과 접촉하면 뉴턴의 고리가 관찰되어야 합니다. 이것은 대략적인 추정치입니다. 정확한 위치는 기판에 대한 프로브 정점의 동일 평면성을 조정 한 후에 얻어야합니다.

형성될 때 뉴턴의 고리가 대칭인지 확인하십시오. 프로브 정점의 동일 평면성을 보장하려면 머리와 Z-s의 인터페이스에서 측각계를 사용하여 헤드의 기울기를 조정하십시오.tage. MFP 헤드를 기판에서 20미크론 떨어진 곳으로 이동하고 측각계를 사용하여 기울기를 조정합니다.

뉴턴의 고리가 접촉 시 대칭이 될 때까지 하강, 영점 조정 및 기울기 조정을 반복합니다. 기울기를 조정한 상태에서 대칭 뉴턴의 고리를 생성하는 Z 위치를 0으로 설정합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 내부 주입 채널과 외부 주입에 필요한 추출 완충액을 위한 처리 액체를 준비합니다.

배수관을 사용하여 주사기 펌프에 연결하고 남은 물을 퍼지하고 주사기가 가득 찰 때까지 분당 40마이크로리터의 속도로 가스가 제거된 용액을 주입 주사기로 흡입합니다. 이렇게 하면 주사기, 커넥터 및 모세관이 기포 없이 충전됩니다. 챔버 슬라이드에서 세포 단층을 준비하려면 표준 세포 배양 프로토콜을 사용하여 T-플라스크에서 세포를 확장하십시오.

배양 플라스크에서 세포 합류점에 도달하면 세포를 트립신화하고 수집합니다. 패터닝을 위해 각 2개의 챔버 슬라이드에 제곱센티미터당 020만 개의 세포를 파딩합니다. 세포 성장 및 생존력을 조절하기 위해 챔버 중 하나의 세포를 사용하여 48시간 동안 세포를 배양합니다.

챔버 슬라이드의 세포 합류점에 도달하면 무혈청 배지에서 준비된 10마이크로몰 농도에서 500마이크로리터의 세포 추적기 염료 용액으로 45분 동안 세포를 배양합니다. 이는 패터닝하는 동안 셀 시각화를 위해 수행됩니다. 피펫을 사용하여 각 챔버를 부드럽게 세척하여 PBS로 라벨링된 세포를 세척합니다.

그 후, 패터닝 실험을 위해 혈청이 보충된 배지에서 세포를 배양합니다. 유체역학적 흐름 구속은 처리 액체의 동시 주입 및 흡인을 사용하여 액체를 국소화합니다. 계층적 감금에서는 여러 처리 액체가 제한되며 외부 HFC는 내부 처리 HFC로부터 샘플을 보호합니다.

MFP를 셀 단층 위로 유리 슬라이드에서 50미크론의 갭 거리로 이동합니다. 이 갭 거리는 계층적 HFC의 접촉을 보장하고 단층 표면 및 두께 변화도 고려합니다. I-two를 통해 분당 6 또는 8 마이크로 리터의 수산화 나트륨을 주입합니다.

텍스트 프로토콜의 흐름 규칙을 사용하여 다른 흐름 속도를 평가합니다. 주입 주사기를 사용하여 주입 유량 QI-2 및 QI-1의 비율을 변경하여 내부 HFC의 크기를 조절합니다. 예를 들어, 분당 1.3마이크로리터에서 분당 4마이크로리터 사이의 QI-one을 사용하고 QI-two를 분당 8마이크로리터로 고정하면 150-300개의 세포가 수산화나트륨 발자국을 얻을

MFP 헤드의 가장 바깥쪽 구멍에서 분당 20마이크로리터의 유속으로 완전한 배지를 주입하여 hHFC 작동 중 배지의 증발 및 흡인을 고려합니다. 셀 단층을 패턴화하려면 스테이지 소프트웨어를 설정하여 초당 10미크론의 스캔 속도와 50미크론의 갭 거리에서 사용자 정의 패턴으로 셀 단층 위의 프로브 헤드를 스캔합니다. 중첩된 hHFC가 작동하고 단층과 접촉한 상태에서 원하는 패턴의 궤적으로 MFP를 스캔하여 패턴화된 세포를 제거합니다.

첫 번째 세포 유형 제거 후 공동 배양의 경우, 이전과 같이 다른 세포주를 파종하여 갭을 채웁니다. 용해물의 다운스트림 분석을 위해 샘플링 스테이션을 준비합니다. 여기에 표시된 것은 3D 프린팅된 8-스트립 PCR 홀더로 구성된 샘플링 스테이션의 예입니다.

응용 프로그램에 필요한 엄격성에 따라 튜브 홀더를 70% 에탄올 또는 기타 표면 오염 제거제로 닦습니다. 튜브 홀더의 마그네틱 클립을 사용하여 기판 홀더에 부착합니다. 샘플링 스테이션을 준비한 후 MFP 헤드를 단층에서 100미크론 떨어진 곳에 배치합니다.

50밀리몰의 수산화나트륨 용액을 내부 주입 채널의 처리 액체로 사용하여 QI-1의 경우 분당 1마이크로리터, QI-2의 경우 분당 마이너스 7마이크로리터, QA-2의 경우 분당 마이너스 17.5마이크로리터의 유속으로 hHFC를 작동하기 시작합니다. 흐름 구속이 안정화되면 프로브 헤드를 50미크론의 갭 거리로 내려가 hHFC가 있는 세포의 선택된 하위 모집단에서 나트륨-수산화물 기반 국소 용해를 수행합니다. 하위 모집단의 용해가 완료되면 헤드를 샘플링 스테이션의 튜브 쪽으로 향하게 합니다.

수집된 용해물을 PCR 튜브로 직접 배출합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용해물을 처리한 후 기기 공급업체가 설정한 대로 용해물을 표준 qPCR 워크플로우에 로드합니다. 계층적 HFC에서 주입 액체의 비율을 제어함으로써 세포 표면과 접촉하는 발자국의 크기가 조절됩니다.

전단(shear)보다는 화학적 효과가 세포 용해(cell lysis)의 지배적인 메커니즘이 되도록 유속이 선택되었습니다. 이것은 전산 유체 역학을 사용하여 전단을 결정함으로써 확증되었습니다. 여기에 표시된 것은 MFP로 궤적 프로그래밍을 스캔하여 세포 섬의 그리드를 생성하는 것입니다.

주입액 비율을 사용하여 풋프린트 크기를 조절하면 세포 제거의 해상도를 제어할 수 있습니다. 이 방법은 여러 세포 집단의 순차적 공동 배양에 사용할 수 있으므로 세포 간 상호 작용의 복잡한 패턴을 생성할 수 있습니다. 수산화나트륨을 처리 액체로 사용하면 용해물이 세포의 PCR 기반 분석과 호환됩니다.

여기서, DNA 함량은 5 발자국과 1 발자국에서 정량화되었으며, 설명 된 방법을 사용하여 용해되었습니다. 이 기술을 숙달하면 30분 이내에 세포에서 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 HFC에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 채널과 모세혈관에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

부식성 화학 용액인 수산화나트륨으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 및 실험실 가운과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 면역염색 또는 MFP 매개 용해에 의한 DNA-RNA 염기서열분석을 통해 국부적으로 세포를 분석하여 세포의 기하학적 제한으로 인해 어떤 단백질이 과발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 분자 생물학 분야의 연구자들이 조직 생성 및 퇴화 중에 세포 간 및 세포 외 신호 전달을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 로컬 처리를 위해 MFP에 설정된 세포 단층을 빼기 패턴화하고 세포의 공동 배양에 대한 복잡한 기하학을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.