Name: 신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 학습하세요 신생아 마우스 심장 조직에서 세포 외 기질 기반 스캐폴드를 제작하는 방법을. 이 기술은 재생 심장학 연구에서 세포-기질 상호작용을 탐구하는 새로운 모델을 제공합니다.

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저자는 피규어를 준비한 Ms. Cynthia DeKay에게 감사의 뜻을 전합니다.

모든 마우스 실험은 미국 동물 복지 법에 따라 수행하고 미네소타 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마우스 심장 격리 1. 방법 <ol><li> 단일 사용 블레이드 잘린에 의해 신생아 마우스를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 흉부를 면봉. </li><li> # 5 포셉 한 쌍의 측 방향으로 피부를 당기면서 표준 가위로 가슴 벽에서 멀리 절단하여 가슴에서 피부를 해부하다. </li><li> 복벽을 통해 절단에 의해 가위로 흉골 단지 열등한 복부를 관통. 가위로 가슴의 양쪽에 리브 불구하고 절단하는 동안 # 5 집게와 칼 모양의 프로세스를 파악, 몸에서 rostrally 흉골을 철회. 흉곽은 심장을 표시 할 수있는 집게와 우량 반영됩니다. </li><li> 퉁명스럽게 노출, # 5 집게 측 방향으로 당겨 흉선의 두 가지 주요 로브를 해부대동맥 아치뿐만 아니라 대정맥과 폐정맥. </li><li> 10 센티미터 봄 가위로 대동맥 궁에서 주요 동맥 및 대동맥 자체를 가로로 쪼개다. 마음의베이스와 팔 머리 동맥과 대동맥을 유지합니다. 기도와 식도에서 분리, 앞으로 마음을 반영하기 위해 #와 함께 5 집게를 절단 혈관의 끝을 잡고. </li><li> 10 센티미터 봄 가위로 심장의 양쪽 폐와 심장 사이에서 절단하여, 폐 혈관 및 기타 주요 정맥을 가로로 쪼개다. 혈관은 배수를 제공 할 열려. </li><li> 주요 혈관의 잘린 끝을 잡고는 # 5 집게와 종격동에서 마음을 제거합니다. 카테터 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 60mm 배양 접시에 마음을 놓습니다. </li></ol> 랑겐 돌프 관류에 의해 탈세 포화 2. 방법 <ol><li> 사전에 카테터 어셈블리를 준비합니다. 4 센티미터 부분을 그립니다PE의 작은 알코올 불꽃 50 튜브는 작은, 얇은 카테터를 만들 수 있습니다. 측정 기준을 만족하는 날개 끝 손질 (약. 약. 500 μm의 지름의 플랜지 300 μm의 외경 OD)도 1에 도시 된이.이 손잡이의 각각의 측면에서 두 개의 대칭적인 카테터를 제공한다. </li><li> 얇은 끝 부분에있는 구멍에 플랜지를 용융, 간단히 불꽃에 튜브의 절단 끝을 가리 킵니다. </li><li> PBS로 12 mL를 주사기를 채우고 주사기에 3 방향 스톱 콕을 배치하여 카테터를 조립한다. 꼭지에 22 G × 1 바늘을 추가하고 격막을 통해 바늘을 구동한다. 바늘 (그림. 1)에 그려진 PE 튜브 카테터를 밀어 넣습니다. </li><li> 모든 기포가 제거 된 것을 보장 PBS로 조립 부품 관개. </li><li> 대동맥 밸브를지나 연장하지, 분리 된 심장의 대동맥으로, 위의 설명과 7-0 봉합사의 한 넥타이와 결찰로 제조 된 카테터를 삽입합니다. t의 플랜지를 휴식그는 꽉 밀봉을하고 카테터를 오는 마음을 방지 넥타이에 근위 카테터. </li><li> 부드럽게 PBS가 들어있는 주사기를 사용하여 마음을 관류하면서, 배율 아래 카테터를 관찰한다. 거기에 누수가 시스템에없고 잠재 혈액이 제거 될 때 조직이 균일 blanches 있는지 확인합니다. </li><li> 입구 어댑터의 목에 격벽을두고 유리 위에 측면 폴딩하여 밀봉. </li><li> 도 20에 나타낸 바와 같이 mmHg의 압력을 발생하는 열을 생성하기 위해 충분한 길이의 선을 통하여 증류수 1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 60 ㎖ (DH 2 O)로 충전 된 저장조에 부착. 1. 1 mmHg에서의 관계에 기초하여 상기 액체 컬럼의 높이의 압력을 계산하면 1.3595 cm의 H 2 O. 같다 주의 : SDS는 자극 특성을 가진 고도의 응집 분말이다. 접촉은 피해야한다. 적절한 보호 복을 사용하여 분말을 처리합니다. </li><li> 14 시간 동안 1 % SDS와 마음을 관류. 마음은 전혀 관찰 나머지 조직과 외관 반투명됩니다. </li><li> 나머지 SDS 용액의 콕하도록 시스템을 씻어 내고 10 ㎖의 DH 2 O로 대체 1X 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균)를 포함하는 60 ml의 PBS 다음 10 ml의 DH 2 O 다음 (증류수에 희석) 10 ml의 1 % 트리톤 X-100과 마음을, 관류. </li><li> 4 ° C에서 1 배 펜 연쇄상 구균와 PBS의 마음을 저장합니다. 의도 된 게시물 탈세 포화 응용 프로그램이 다음 대동맥의 카테터가 유지되어야한다 관류를 필요로하는 경우, 그렇지 않으면 봉합 넥타이를 잘라 카테터를 제거합니다. </li></ol> 3. DNA 결정 <ol><li> 50 mM의 KCl을 200 μg의 / ㎖ 프로 테 K를 사용하여 decellularized ECM 또는 제어 마음의 다이제스트를 준비, 2.5 밀리미터의 MgCl 10 mM 트리스 (산도 8.3) 2, 0.45 % 트윈 20. </li><li> 조직이 용해 될 때까지 교반하면서 55 ℃에서 조직을 부화일반적으로 4 ~ 5 시간. </li><li> 분석 4,11 바인딩 DNA와 균질의 DNA 함량을 정량. </li></ol> 4. 고정 및 조직의 단면 <ol><li> 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에 decellularized, recellularized 또는 제어 P3의 마음을 수정합니다. </li><li> PBS 배에서 조직을 씻으십시오. </li><li> 이 싱크 될 때까지 4 ℃에서 0.1 M 인산 완충액 7.5 % 자당 용액의 조직을 놓는다. </li><li> 이 싱크 때까지, 다시 4 ° C에서 0.1 M 인산 버퍼에 15 % 자당의 해결책을 변경합니다. </li><li> 37 ° C로 가온 조직을 15 % 수 크로스 및 0.1 M 인산염 완충액 젤라틴 용액 부피의 절반을 교체하고 밤새 평형. 젤라틴의 농도는 1 %, 2.5 %, 5 %를 단계적으로 증가하고 마지막으로 7.5 %를 두 번 있습니다. </li><li> 신선한 7.5 % 젤라틴을 사용 cryomolds에서 샘플을 놓습니다. decellularized 샘플의 형상을 회복하기 위해 액체 젤라틴 t로서 챔버로 살포 될 수있다그는 마음이 성형. 액체 질소에 cryomolds 부동으로 고정. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 그라 이오 스탯으로 잘라 (10 μm의 두께) 섹션. 섹션면에 가까운 슬라이드를 가져오고 섹션 인해 정전 기적으로 처리 된 슬라이드의 전하로 표면에 칼으로부터 이동 관찰합니다. 밤새 슬라이드를 건조 및 향후 분석을 위해 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 냉장고에서 슬라이드를 제거, 실내 온도 평형 후 젤라틴을 용해 37 ° C에서 20 분 동안 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 넣습니다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신와 단계 4.7에서 절단 된 부분을 얼룩. 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드. 1.5 분 동안 에이전트 블루 우잉, 1 분 동안 수돗물, 3 분 동안 버퍼, 1.5 분 동안 수돗물, 45 초 동안 헤 마톡 실린에 단계 4.8에서 수화 슬라이드를 노출, 80 % 에탄올 1 분, 알코올 에오신 Y 8 초, 1 분 배 1 분, 1 분 배 100 % 에탄올, 에이전트를 삭제 (크실렌 대체) 80 % 에탄올, 수지와 커버 슬립기반 장착 매체. 현미경 슬라이드를 검사합니다. </li><li> 가습 실에서 수화 슬라이드를 배치하여 이러한 콜라겐 IV와 같은 ECM 구조 단백질의 심장 ECM, 얼룩의 ECM 단백질의 반응성의 보존을 확인하고 0.1 % 트리톤과 인산염 완충 식염수에 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS)로 처리하려면 -X100 실온에서 1 시간 (RT)에 대한 (PBST). 조직 섹션을 충당하기에 충분한 볼륨을 사용합니다. </li><li> 5 % NDS / PBST에서 경험적으로 결정된 희석 선택의 차 항체와 솔루션을 교체합니다. 예를 들어, 콜라겐 IV 항체를 1로 희석 하였다 : 150. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> PBST 배와 슬라이드를 세척하고 형광 염료와 결합 선택의 차 항체를 적용합니다. 실험적으로 결정된 양으로 항체를 희석. 실온에서 1 시간 동안 품어. PBS 3 배 씻으시오. </li><li> DAPI는 DAPI 함유 mounti를 사용하여 세포 핵의 유무를 확인하는 등의 DNA 결합 염료 슬라이드 얼룩커버 슬라이드를 미끄러 때 매체 ng를. </li><li> 400X 50에서 형광 현미경 슬라이드를 검사합니다. </li></ol> Recellularization 5. P1 신생아 쥐 심실 심근 <ol><li> 70 % 에탄올로 각각의 강아지 스프레이 단일 사용 블레이드 목을 베다. </li><li> 흉부가 흉강을 노출 작은 멸균 가위로 중간 선에서 분할되는 동안 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 각각의 강아지를 잡으십시오. 이 주요 혈관 만 심실 조직을 떠나는 심방의 무료 절단하는 동안 심장이 가슴에서 자유롭게 돌출 할 수 있도록 압력을 적용합니다. </li><li> 20 mL의 빙냉 칼슘 모든 하트가 수집 될 때까지 20 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (CBFHH)과 중탄산염 무료 행크 완충 식염수 용액을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 직접 각각의 심장 놓는다. </li><li> CBFHH을 기음과 튜브에 신선한 CBFHH (얼음처럼 차가운)의 10 ~ 15 ml에 추가 할 수 있습니다. t의 조직을 소용돌이에 의해 조직을 씻으십시오그는 튜브를 여러 번. </li><li> 60 밀리미터 플라스틱 페트리 접시에 마음을 함유하는 용액을 가만히 따르다. </li><li> 멀리 봄 가위로 마음에서 그것을 트리밍에 의해 얼음에 확대에 따라 마음에서 어떤 잠재적 인 심방 조직을 해부하다. 균일 크기의 작은 조각으로 심실을 말하다. # 5 집게로 요리에서 어떤 구분이 아닌 심실 조직을 제거합니다. </li><li> 멸균 마이크로 교반 막대를 포함하는 작은 멸균 바이알에 조직 조각을 전송할 필요로 CBFHH 용액 많은 피펫. </li><li> 조직은 유리 병의 바닥에 침전하고 CBFHH 솔루션을 제거 할 수 있습니다. </li><li> CBFHH의 효소 용액 1.75 ㎎ / ㎖ 트립신, 20 μg의 / ㎖의 DNase II 50 ㎖를 확인합니다. 피펫 (5)이 효소 용액 mL 및 자기 교반기 다진 심실 조직과 장소를 함유하는 관에 추가. 8 분 동안 실온에서 일정한 속도 (340 RPM)에서 교반 하였다. 참고 : 교반 작용이 완만하고 아직 허용해야슬러리의 서스펜션. </li><li> 스터 판에서 병을 제거하고 슬러리를 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 그것은 주로 혈액 세포 및 조직 파편을 포함로 피펫은, 초기 소화 상층 액을 버리고. </li><li> 피펫 제 5 ㎖의 효소 용액의 분취 량과 소화 뇌실에 추가. 8 분 동안 교반하고 또 다른 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이전 다이제스트를 시작으로, 두 개의 50 ㎖ 튜브 (1 표지 및 2) 각각의 제조 12 ml를 함유하는 빙냉 소 태아 혈청 (FBS). 각 튜브 꼭대기 40 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 피펫 관 (1)의 필터를 통해이 뜨는. </li><li> FBS가 포함 된 두 개의 튜브의 다이제스트 상등액의 위치를 ​​교대로 소화 공정을 추가로 8 회 반복한다. 각각의 튜브에서 동일한 양을 보장하기 위해 관 (1)과 (2) 사이에 균등 최종 상등액을 분할. 참고 : 각 컬렉션 튜브는 현재 세포 현탁액의 32.5 ml의 총 부피를 포함합니다. </li><li> 튜브가 포함 된 원심 분리기4 ° C에서 6 분의 상층 액 150 XG를 보내고. </li><li> 소화 씩을 수집하는 동안, 접시 당 (10 % FBS, 1X 펜 연쇄상 구균, 1 배 L 글루타민과 둘 베코의 변형 이글의 미디어 (DMEM)) 미디어의 6 ㎖로 오 100mm의 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 미디어를 평형 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 이러한 분취 량을 품어. </li><li> 모두 수집 튜브에서 세포 결합 된 CBFHH 효소 혼합물 대기음 상기 제조 배양 배지의 30 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 100 밀리 판의 각 세포 현탁액의 6 mL로 돌아가서 37 ° C에서 45 분 동안 품어. </li><li> (섬유 아세포 분획 접시에 접착하기 시작하고, 원하는 경우 별도로 성장 될 수있다) 인큐베이션의 끝에, 5 새로운 요리에 비 부착 세포를 전송하고 45 분 동안 다시 배양한다. </li><li> 프리 도금의 두 번째 라운드의 끝에서, 요리의 미디어 및 비 - 부착 세포를 수집하고 (150)에 미디어를 스핀6 분 XG. </li><li> (관류 액 100 ㎕의 구조 당 4.0 × 10 5 세포)를 대략 원하는 농도로 세포를 가지고 초과 용지를 그립니다. 계산 및 또는 생존 능력 테스트 (14)에 대한 나누어지는을 제거합니다. </li></ol> P3 심장 매트릭스 6. 생물 반응기 Recellularization <ol><li> 밤새 세포를 첨가하기 전에 배지 (단계 5.15 참조)와 격리 심장 매트릭스를 전처리. </li><li> 도에 나타내는 바와 같이 랑겐 돌프 시스템의 요소들을 조립한다. 이. 유리 부를 오토 클레이브 산화 에틸렌 멸균을 보증하기 위해 플라스틱 부품 살균. 시스템의 다양한 서브 유닛이 지지대 상에 장착되기 전에 층류 후드에서 조립 될 수있다. 순환 수조 가열 수류는 명확성을 위해 생략되었다. </li><li> 조직 배양 배지 120 ml에 함께 조립 된 시스템을 작성한다 (단계 5.15 참조). </li><li> 60 밀리미터 막 다른의 단계 2.14에서 카테터 심장 매트릭스를 배치배율 아래 진짜야 요리 카테터에 단계 5.20에서 세포 현탁액로드 × 1 바늘 22 G와 1 ML의 주사기를 연결합니다. 이 어셈블리는 마음을 embolizing 피하기 위해 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 통한 관상 동맥 심장 행렬에 세포 현탁액 100 μl를 관류. 완료되면, 주사기 / 바늘 조합을 분리합니다. 참고 : 약의 느린 관류. 분당 20 μL가 심장 천이, 정맥 유출 셀을 방지 할 필요가있다. </li><li> 생물 반응기 심장 병 뚜껑의 아래쪽에있는 루어 피팅에 고정 된 22g 무딘 스텁으로, 그루터기에 카테터를 밀어 넣습니다. </li><li> 연동 펌프를 시작하고 그림 2에 설명 된대로 진행하는 것이 관찰한다. 저수지에서 흐름의 진행 단계 2.5에서 대동맥에 배치 카테터 (그림. 2에서 빨간색 경로)에 버블 트랩을 통해 펌프를 통해. 정맥에서 심장 순환 흐름을 관찰미디어 저장소에 정점, 재순환에서 s와 똑. 주 : 관류 유량 같은 구조의 혈관 저항 및 심장의 크기이지만 100 μL 내지 50의 비율로 각각의 요인에 의존 / 분 좋은 출발점이다. 중간 시점에서, 관능 평가가 수행 될 수있다. 신생아 recellularized 심장의 크기 규모는 수행 할 수 있지만, 우리는 광학 기반 시스템 그들이 성인 쥐 마음에 사용 된 것처럼 동작을 치고 정량화하는 데 사용할 수있는 것으로 확인의 평가를 제한한다. 4 구조는 확장을 위해 관류 할 수 있습니다 (23 시간까지) 시간의 기간. </li></ol>

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마음의 반복 관류에이 기술의 의존도는 색전증을 피하기 성공적인 결과의 중요한 구성 요소를 만든다. 단계 2.8-2.14 사이의 솔루션의 변화 단계 2.2-2.6의 심장의 초기 카테터,에서, 어떤 타협 심근에 관류의 흐름을 기포의 도입을 허용 할 수 있습니다 조작이 있습니다. 때문에 신생아 심장의 소형 크기로, 혈관에 미세한 기포 따라서 불완전 탈세 포화 렌더링, 기술 경색의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 나중에 세척 단계에서, 불완전 관류에 부정적인 영향을 생체 적합성 세제 잔류 물이 발생할 수 있습니다. 변화에 용액으로부터의 가스 움직임을 용해 할 때 또한 기포 형성의 원인이 될 수있는 또, 단계 2.14에 제시된 바와 같은 4 ℃로 보관 중 매트릭스를 제거 할 때와 같은 급격한 온도 변화는주의 접근해야 온도입니다. W주입을 위해, 세포 현탁액에 주사기를 준비 할 때, 부가적인 치료가 적용되어야 recellularization로 진행 편 무료 버블 (6.4 공정)이다. 이...

심부전은 일반적이고 치명적입니다. 그것은 기관에의 혈류를 저해하고, 신체의 대사 충족 수요를 남긴다 심장의 수축력 저하를 초래 진행성 질환이다. 570 만 미국인들이 심장 마비를 가지고있는 것으로 추정하고 미국 9 입원의 주요 원인이다. 미국에서 심장 마비 환자를 치료 집단 비용은 연간 9-10 당 $ (300) 억 달러를 초과합니다. 말기 심부전 유일한 최종 치료 동소 심장 이식이다. 매년, 10 만 명 이상의 기증자 마음이 미국 1-2에서 심장 이식 절차에 필요한 것으로 추정된다. 때문에 기증자의 제한된 번호 만 약 2,400 이식은 미국이 매년 수행됩니다. 분명히, 이러한 장기 결품 다른 전략 transplanta 추가 기관을 생산하는 데 필요한으로 해결되어야거부 평생 면역 억제와 관련된 부작용을 회피하기 위하여 기 및 이상적으로 이러한 장기자가있을 것이다. 포유류 성인 심근 부상에 따라 제한된 재생 능력을 보여하지만 최근의 증거는 포유류의 신생아 마음이 상해 5-8 다음과 같은 놀라운 재생 능력을 유지하는 것이 좋습니다. 특히, 부분적인 수술 적 절제 다음, 회생 창이 출생과 출생 후의 일 사이에 발견되었다 (7)이 회생 기간은 섬유 성 흉터의 부족, 신생 혈관의 형성, 심장 외막에서 혈관 신생 인자의 방출 및 심근 확산 5-8 특징 11. 시간이 회생 창이 bioartificial 심장의 개발을위한 신규 물질의 공급원으로 신생아 심장을 사용하는 가능성을 제공한다. 세포 외 기질은 cardiomyocyt를 촉진하는 중요한 단서를 제공하는 것으로 알려져E 증식 및 성장. 신생아 및 성인 행렬 (12) 및 재생을 촉진 할 수있는 능력 분자의 가용성에 뚜렷한 차이가 13을 탐구하고있다. Decellularized 성인 매트릭스 셀룰러 다시 채우기위한 ECM 지지체 및 bioartificial 심장의 생성을 제공하는 여러 연구에 사용되었다. 줄기 세포 기술이 연구 및 새로운 발견이 빠르게 발전하고 있지만, 몇 가지 장애물이 충족되어야 아직. 예를 들어, 매트릭스 벽으로 행렬의 기본 구조 셀룰러 통합 보존 한계 및 능력이 접근법의 성공 증식 및 성장은 모든 제한을 지원한다. 회생 특성이 우수 신생아 심장 기인되었지만, 이러한 조직을 사용하는 실용적인 측면은 탐색을 제한하고있다. 신생아 심장의 증명 재생 능력을 바탕으로, 우리는 개발을 통해 새로운 매트릭스를 개발했다P3 마우스 심장 탈세 포화의 기술. 이전에 6 결정하지만 마음 수확, decellularize 및 recellularize에 충분한 크기로는 심장 재생의 창 내에서 그대로 P3의 마음은이 연구를 위해 선택되었다. 이 연구의 목적은 쥐 신생아 심장에서 매트릭스를 생성하는 가능성을 입증한다. 우리의 연구는 ECM의 단백질 구조적 무결성을 유지하면서 분 신생아 심장 decellularizing의 가능성에 대한 증거를 제공한다. 우리는 또한 mCherry 표현 심근이 심장 ECM을 recellularize 할 수있는 능력을 보여 우리는 recellularization 다음과 같은 다양한 심장 마커의 발현이 심근을 조사했다. 이 기술은 bioartificial 심장의 개발 신생아 행렬의 우월성 시험을 허용한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1입니다. 마우스 심장 격리 재료</td></tr><tr><td>P1 마우스 새끼(그림 참조; 나6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>또는 동급</td></tr>, <tr><td>60mm 배양 접시</td>, <td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>, 인산염 완충 식염수, pH 7.4(멸균),</td> <td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>, 일회용 블레이드</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>또는 동급</td></tr>, <tr><td>표준 가위</td>, <td>Moria Bonn(Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>스프링 가위, 10cm</td><td>Fine Science Tools</td>, <td>15024-10</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>, 15000-00</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td colspan="4">2. 탈세포화</강></td></tr><tr><td>입구 어댑터</td>용 재료 <td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>오토클레이브 가능</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>오토클레이브 가능</td></tr><tr><td>1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>오토클레이브 가능한</td></tr><tr><td>남성 루어에서 1/8" 호스 바브 어댑터</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>가능한 여성 루어에서 1/8" 호스 바브 어댑터</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>오토클레이브 가능한</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 수술용 봉합사&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>링 스탠드</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>클램프</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>클램프 정규 홀더</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>60 cc 주사기 배럴&nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>22G x 1 주사기 바늘</td><td>BD</td><td>305155</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>12cc 주사기</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>3방향 정지 콕</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>PE50 튜빙</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>열에 의해 성형될 수 있어야 합니다. 폴리에틸렌 권장.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>초순수 등급 권장. 신선한 용액을 만들고 필터는 사용하기 전에 살균하십시오.</td></tr><tr><td>1% 트리톤 X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>10% 재고에서 신선한 용액을 만들고 필터는 사용 전에 살균합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>또는 MilliQ 시스템 정제수.</td></tr><tr><td>1x 펜/스트렙</td><td>코닝 CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>또는 동급 &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3입니다. DNA 정량화를 위한 물질</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U/mg 활성</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>트윈 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Tris base/hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA 분석 키트</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td>는 <td>형광계가 판독해야 합니다</td></tr><tr><td colspan="4">4. 조직의 고정 및 절편 방법</강></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>또는</td></tr><tr><td>돼지 껍질의 동등한 젤라틴 A형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td>은 <td>300 블룸 이상이어야 합니다</td></tr><tr><td colspan="4">5. 조직 조직학 방법</td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>블루 버퍼&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>알코올 중독자 Eosin Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801615</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Formula 83 Xylene 대체품&nbsp;</td><td>CBG 바이오텍&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium&nbsp;</td><td>피셔 케미컬&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>Collagen IV 항체</td>, <td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>&alpha;-Actinin 항체</td>, <td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>mCherry 항체</td>, <td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>NKX2.5 항체</td>, <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>의 Donkey anti-mouse AF488 항체</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken AF594 항체</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 CY5 항체</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr>DAPI <td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>또는 동급</td>의<td>Prolong Gold Antifade Mountant <</td></tr><tr>td colspan="4">6. pre-plating</td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>50 ml 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm를 사용하여 신생아 심실 심근세포 분리 Primeria 표면</td><td>353803</td><td>Corning</td> 플레이트는 <td>섬유아세포 부착을 강화하여 더 높은 근세포 순도를 촉진합니다</td></tr>. <tr><td>Trypsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>또는</td></tr><tr><td>동등한 DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>또는</td></tr><tr><td>동등한 비타민 B12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>Fibronectin 코팅 플레이트&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>심장 생물반응기 유리 제품</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>오토클레이브 또는 가스로 멸균할 수 있어야 합니다.</td></tr></tbody></table>

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

말기 심부전의 유일하고 확실한 치료법은 정형외과성 심장 이식입니다. 매년 미국에서 심장 이식 시술을 위해 100,000개 이상의 기증자 심장이 필요한 것으로 추정됩니다1-2. 기증자의 수가 제한되어 있기 때문에 미국에서는 매년 약 2,400건의 이식 수술만 시행됩니다.2. 세포 치료 연구에서 기계적 보조 장치 이식에 이르기까지 수많은 접근법이 단독으로 또는 조합하여 심장이 스스로 회복하도록 달래거나 고장난 심장을 쉬게 하기 위해 수행되었습니다3. 이러한 노력에도 불구하고 심실 보조 장치는 여전히 이식을 위한 목적으로 주로 사용되고 있으며 세포 치료의 유용성은 일부 치유 가능성을 가지고 있지만 여전히 임상 시험에 국한되어 있습니다. 또한 직접 이종 이식이 시도되었지만 면역 거부 반응으로 인해 성공이 제한적이었습니다. 분명히, 이식을 위한 추가 장기를 생산하기 위해서는 또 다른 전략이 필요하며, 이상적으로는 이러한 장기가 거부 반응 및 평생 면역 억제와 관련된 합병증을 피할 수 있도록 자가 가능해야 합니다. 탈세포화(Decellularization)는 조직에서 상주 세포를 제거하여 천연 세포외 기질(ECM) 또는 골격을 노출시키는 과정입니다. 관류 탈세포화는 조직의 3차원 구조를 완전히 보존하는 동시에 조직의 기계적 특성의 대부분을 그대로 유지합니다4. 이러한 골격은 연구 모델을 생성하고 이식에 필요한 장기를 생성하기 위해 건강한 세포로 재증식하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 놀라운 심장 재생 능력을 유지하는 것으로 알려진 신생아 마우스(P3)의 골격을 세제 매개 탈세포화(decellularization)5-8에 노출시켰고, 이 골격을 쥐 심장 세포로 다시 채웠습니다. 이러한 연구는 신생아 심장 구조물 엔지니어링의 타당성을 뒷받침합니다. 그들은 또한 초기 산후 심장의 ECM이 개선된 재세포화 전략을 초래할 단서를 가지고 있을 수 있는지에 대한 조사를 가능하게 합니다.

탈세 포화 평균적으로, 이러한 프로토콜을 사용하여 P3 심장 탈세 포화까지의 시간은 약 14 시간이다. P3의 신생아 23 mg의 평균 심장 무게 주어진. Acellularity 도 3a는 완전히 그대로 P3 신생아 마음을 (전체 마운트). 그림 3b는. 탈세 포화 다음과 같은 마음을 보여줍니다도 4a 및도 각각 손상 및 decellularized 마음의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 보여 4b는 보여줍니다. 헤 마톡 실린 긍정적 인 핵의 부재와 decellularized 마음에 호산 구조의 감소에 유의하십시오. 또한, decellularized 마음의 DNA 함량이 크게 그대로 마음...

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

본 방법론의 전반적인 목표는 재생 연구에 사용하기 위해 신생아 mirian 심장 조직으로부터 새로운 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이 방법은 재생 심장학의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포외 기질이 증식 가능한 심장 조직에서 유래되었으므로, 세포-기질 상호작용 연구를 위한 새로운 모델을 제공합니다.이 기술의 주요 장점은 신생아 세포외 기질의 새로운 특성들을 발견할 수 있다는 것입니다. 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Stefan Kren이 맡겠습니다. 절차를 시작하기 전에, PE 50 튜브의 4 cm 구간을 작은 알코올 램프 불꽃으로 가열하여 더 작고 얇은 카테터를 만드십시오.PO의 양쪽에서 두 개의 대칭적인 카테터가 생성되도록 끝단을 적절한 크기로 자르고, 튜브의 절단된 끝부분을 화염에 짧게 노출시켜 얇은 쪽의 개구부에 하나의 플랜지가 형성되도록 녹입니다. 다음으로, 12 mL 주사기에 PBS를 채우고 주사기에 3방향 스톱콕을 장착합니다. 스톱콕에 22 gauge 바늘을 연결하고 바늘을 격막을 통해 삽입합니다.그 다음, PE 튜빙 카테터를 바늘 위로 밀어 넣고 어셈블리를 PBS로 세척합니다. 카테터 어셈블리가 준비되면, 신생쥐의 흉부를 70% ethanol로 닦아냅니다. 그런 다음 5번 포셉으로 조직을 측면으로 당기면서 표준 가위를 사용하여 가슴 피부를 절개합니다.다음으로, 흉골 바로 아래의 복벽을 천공하고 포셉으로 검상돌기를 잡습니다. 가슴 양측의 갈비뼈를 절개하면서 흉골을 체내에서 머리 쪽으로 견인하고, 흉곽을 상단으로 젖힙니다. 심장이 보이면 흉선을 측면으로 당겨 두 개의 주요 엽을 분리하여, 대동맥궁과 대정맥 및 폐정맥을 노출시킵니다.10 centimeter 스프링 가위를 사용하여 대동맥궁에서 분지되는 주요 동맥들과 대동맥 자체를 절단합니다. 절단된 혈관의 끝부분을 잡아 심장을 앞으로 젖혀 기도 및 식도와 분리하고, 폐와 심장 사이 및 심장 양측을 절단하여 폐혈관과 기타 주요 정맥을 절단합니다. 그런 다음, 절단된 주요 혈관의 끝부분을 잡아 종격동에서 심장을 제거하고, 멸균된 PBS가 담긴 60 millimeter 배양 접시에 심장을 넣습니다.심장을 탈세포화하려면, 배양 접시를 해부 현미경 아래에 두고 카테터 어셈블리 바늘을 대동맥판막을 넘지 않는 지점까지 대동맥 내부로 삽입하십시오. 7-0 봉합사로 한 번 묶어 바늘을 고정하고, 카테터의 플랜지가 결찰 부위에 근위하게 맞닿아 밀폐가 되도록 한 뒤, PBS로 심장을 천천히 관류하십시오. 누출이 없다면, 잠재된 혈액이 제거되면서 조직이 균일하게 하얗게 변할 것입니다.셉텀을 인렛 어댑터의 목 부분에 넣고 셉텀의 가장자리를 유리관 위로 접어 고정합니다. 그다음, 증류수에 1% Sodium dodecyl sulfate를 희석하여 60 milliliters를 채운 리저버를 연결하며, 이때 20 millimeters of mercury의 압력을 생성할 수 있는 충분한 길이의 라인을 사용합니다. SDS로 심장을 14시간 동안 관류합니다. 관류가 끝나면 심장은 관찰 가능한 잔여 조직 없이 투명해집니다.남은 SDS 용액을 사용하여 스톱콕까지 시스템을 세척하고, 저장조에 10 milliliters의 탈이온수를 채웁니다. 그 다음, 10 milliliters의 1%Triton X-100, 10 milliliters의 탈이온수, 그리고 페니실린과 스트렙토마이신이 포함된 60 milliliters의 PBS를 순차적으로 관류하여 심장을 세척합니다. 마지막 관류 후, 심장을 PBS와 항생제가 포함된 용액에 넣어 4 °C에서 보관합니다.조직을 재세포화하기 위해, 해부 현미경 하에서 카테터가 삽입된 심장 매트릭스를 60 millimeter 배양 접시로 옮기고, 관심 있는 적절한 세포가 충전된 22 gauge 바늘이 장착된 1 milliliter 주사기를 카테터에 연결합니다. 어셈블리에 기포가 없는지 확인하고, 관상동맥을 통해 심장 매트릭스 내로 분당 20 microliters의 세포 현탁액을 천천히 관류합니다. 세포 100 microliters가 주입되면, 주사기를 분리하고 카테터를 바이오리액터 심장 용기 뚜껑 하단의 루어 피팅에 고정된 22 gauge 뭉툭한 스텁(blunt stub) 위로 밀어 넣습니다.이제 연동 펌프를 작동시키고, 용액이 저장조에서 펌프를 거쳐 버블 트랩을 통해 카테터로 흐르는지, 그리고 심장 순환액이 정맥을 통해 흘러나와 심첨부에서 떨어지며 배지 저장조로 재순환되는지 확인하십시오. 이 이미지들은 온전한 심장과 탈세포화된 심장의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과를 보여줍니다. 탈세포화된 심장에서 헤마톡실린 양성 핵이 사라지고 에오신성 구조가 감소한 것에 유의하십시오.온전한 신생아 심장과 탈세포화된 신생아 심장의 세포 외 기질 함량을 평가하기 위해 면역염색을 실시한 결과, collagen IV가 온전한 심장과 탈세포화된 심장 모두에서 강력하게 발현되며, 세포 제거 후에도 이 단백질의 국소화가 유지되는 반면 DAPI 양성 핵은 효과적으로 제거되었음을 보여줍니다. 또한, 세제 기반의 탈세포화 이후 신생아 심장의 DNA 함량이 감소하였으며, 이는 다른 조직에서 세제 기반 탈세포화를 사용한 보고들과 일치합니다. 본 이미지들에서는 좌심실 벽으로 이동한 재세포화된 심근세포를 관찰할 수 있습니다.관류 후 최대 23일까지, 이주한 세포들은 심장 전구세포 마커, mCherry, 분화된 심근세포 마커 또는 DAPI에 대해 양성을 보일 수 있으며, 대부분의 세포는 네 가지 마커를 모두 발현합니다. 이 기술에 숙련되면 적절히 수행했을 때 34시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 관류 장치를 통해 공기가 유입되어 심장에 색전증이 발생하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 젤 제작 및 3D 프린팅을 이용하여 체외에서 증식성 이식편이나 심지어 3D 심장을 만들 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 심장 재생을 촉진하는 길을 열어줄 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신생아 생쥐 심장을 탈세포화하고 재세포화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.Sodium dodecyl sulfate를 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 건조 분말 시약을 취급할 때는 항상 N-95 마스크나 흄 후드와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한...

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

이 프로토콜에서는 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 두 개의 별개의 고분자 재료로 만든 생체 모방 심장 세포 배양 하층의 제작을 보여줍니다.  설명된 방법은 in vitro 및 in vivo 응용 프로그램을 위해 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링할 수 있는 확장 가능하고 비용 효율적인 기술을 제공합니다.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

이 프로토콜은 출생 후 1일차 마우스의 좌심실에서 심근경색의 외과적 유도에 의한 재현성이 높은 심장 재생 모델을 설명합니다. 이 방법은 저체온 마취 유도와 좌측 전방 하행 관상 동맥 결찰을 포함합니다.

신생아 쥐의 심근 경색, 심장 재생의 모델

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.

시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization

이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.

내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

성인 인간의 심장에서 분리된 섬유아세포를 배양하여 젤라틴 코팅된 접시에 합류시켜 심근 특이적 세포외 기질을 생성했습니다. 탈세포화 후, 이 기질은 다른 심장 세포 및 세포-기질 상호 작용의 배양 및 연구에 사용할 수 있습니다.

Culture Dish Coating을 위한 성인 인간 섬유아세포의 심장 세포외 기질 생산

학습하세요 신생아 마우스 심장 조직에서 세포 외 기질 기반 스캐폴드를 제작하는 방법을. 이 기술은 재생 심장학 연구에서 세포-기질 상호작용을 탐구하는 새로운 모델을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

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