디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

이 연구의 전반적인 목표는 디지털 홀로그램 현미경 또는 DHM을 사용하여 상피 상처 치유의 시험관 내 다중 모드 평가를 위해 장 염증 결장 조직 샘플의 자동화된 염색 없는 정량적 위상차 이미징을 제공하는 것입니다. 이 방법은 인간과 해양에 염증을 일으킨 질병 활동에 대한 위장 염증 및 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 얼룩이 없고 객관적인 방식으로 물리적 매개변수에 의해 세포와 조직을 검출하고 정량화할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 Biomedical Technology Center의 기술자인 Fittest Ketelhut입니다.

세포 배양을 설정하고, 4 번 10에서 5 번째로, 95 %의 습도와 5 %의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 FBS와 항생제가 보충 된 RPMI 배지에 높은 배양 삽입물이 장착 된 35mm 페트리 접시에 2 개의 세포를 제곱 센티미터당 2 개 배양합니다. 이틀 후, 관심 물질로 세포를 처리하고 추가로 24시간 동안 배양액을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음날 상등액을 흡인하고 핀셋을 사용하여 삽입물을 제거합니다.

1 밀리리터의 HEPES 완충 세포 배양 배지로 배양액을 1-2 회 세척하여 상처 부위에서 죽은 세포와 남아있는 세포 성분을 제거합니다. 그런 다음 2 밀리리터의 신선한 HEPES 완충 매체를 넣고 접시를 닫습니다. 이제 페트리 접시를 디지털 홀로그램 현미경에 놓고 10 x 대물렌즈를 선택합니다.

이미지 획득 소프트웨어를 열고 명시야 이미징 모드를 선택합니다. 가열 챔버를 섭씨 37도로 설정하고 배양액을 가열 챔버에 넣습니다. 다음으로, 하나의 거대한 세포층과 죽은 세포나 혈청이 없는 양쪽의 직선 경계가 있는 적절한 상처를 실시간 모니터링 창에서 시각화할 수 있을 때까지 시야를 이동합니다.

초기 상처 부위의 백색광 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 백색광 조명을 끄고 디지털 홀로그램 현미경 모드를 선택합니다. 레이저 조명을 켜고 홀로그램 녹화를 위해 3밀리초 미만의 노출 시간을 선택합니다.

홀로그램 오프 액세스 간섭 무늬가 적절한 대비로 나타나면 샘플 홀로그램을 캡처하고 재구성 소프트웨어로 정량적 위상 이미지를 재구성하여 이미지 품질을 확인합니다. 그런 다음 상처에 대한 시간 경과에 따른 DHM 관찰을 시작하여 적절한 종점에서 기록을 중지하고 백색광 조명 아래에서 샘플의 최종 이미지를 얻습니다. 급성 덱스트런 황산나트륨 또는 DSS 대장염 유도의 경우, 100밀리리터의 오토클레이브 물에 용해된 DSS 3g을 마우스 ablibidim에게 제공합니다.

7일 후, 대조군과 처리한 동물로부터 7마이크로미터 두께의 스위스 압연 결장 샘플을 얻습니다. 각 섹션을 50-100 마이크로 리터의 PBS에 담그고 개별 유리 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 슬라이드 바닥에 먼지 및 기타 오염이 없는지 확인하십시오.

그런 다음 첫 번째 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 관심 조직 영역이 보일 때까지 시야를 조정합니다. 샘플에 선명한 초점을 맞추고 이미지 획득 소프트웨어에서 명시야 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 DHM 이미징 모드를 선택하고 레이저 조명으로 전환합니다.

노출 시간을 3밀리초 미만으로 설정하고 홀로그램 오프 액세스 간섭 무늬가 라이브 이미징 창에서 적절한 대비로 나타나는지 확인합니다. 그런 다음 조직의 디지털 홀로그램을 캡처합니다. 내시경적으로 중등도에서 중증의 대장염의 증거에는 결장 벽이 두꺼워짐, 혈관 패턴의 변화, 섬유 결손 및 점막 표면 세분화가 포함됩니다.

결장 단면에 대한 기존의 조직학적 평가는 주로 점막하층에 위치한 대조 동물에 비해 DSS 치료의 결장 벽에 현저한 부종을 보여줍니다. 해당 정량적 DHM 위상차 이미지 및 관련 굴절률 맵은 또한 상피 월경의 밀도에 눈에 띄는 차이가 없는 이러한 조직 변화가 염색되지 않은 천연 조직 샘플에서 특히 분명하다는 것을 보여줍니다. 대장이 있는 마우스의 상피, 점막하 및 기질에서 굴절률은 건강한 대조군에 비해 현저히 감소했으며, 이는 실험 동물의 체중의 상대적 손실과 굴절률 사이에 상당한 상관관계가 있습니다.

여기에서는 45시간 동안 디지털 홀로그램 현미경으로 상처 치유 분석의 대표적인 연속 모니터링을 보여줍니다. 치유 과정 동안 세포가 덮인 표면적, 평균 세포 두께 및 세포 건조 질량을 계산할 수 있습니다. 우리는 DHM이 상피 상처 치유를 지속적으로 모니터링하는 동시에 사이토카인 유도 세포 변형에 대한 생체 핵심 정보를 제공한다는 것을 보여주었습니다.

또한, 굴절률 변화 측정을 통해 DHM에 의한 대장염 모델 및 인간 결장 조직 샘플의 조직학적 손상에 대한 정확한 평가를 입증합니다. DHM은 광학 경로 길이 지연의 감지를 기반으로 하기 때문에 조직 밀도, 건조 질량 또는 세포 두께와 같은 절대 생물물리학적 매개변수를 염색 없는 정량적 위상차 이미징으로 분석할 수 있습니다. 일반적인 연구용 현미경을 사용한 DHM의 정점과 이 기술의 견고성은 세포 생물학 및 디지털 병리학에서 이 방법을 일상적으로 적용할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 생물 의학 실험실 환경에서 살아있는 세포 배양 조직을 분석하기 위해 디지털 홀로그램 현미경을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 결론적으로, DHM은 염증 절대 매개변수를 평가할 뿐만 아니라 중개 진단 사용 가능성이 높은 상피 자발적 체외의 단순화된 정량화를 위한 가치 있고 새롭고도 정량적인 도구를 만듭니다.