Name: 디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 디지털 홀로그램 현미경을 이용한 장내 염증 및 상피 상처 치유 평가 방법을. Caco-2 세포 배양과 자동화된 정량적 위상 대비 이미징으로 염증성 장 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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원고를 교정해 주신 Faekah Gohar에게 감사드립니다. Sonja Dufentester와 Elke Weber의 전문적인 기술 지원에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 독일어 동물 보호법에 따라 지역 윤리위원회합니다 (Landesamt 대 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, LANUV, 독일)에 의해 승인되었다. 뮌스터 대학의 지역 윤리위원회는 조직 학적 및 현미경 분석을위한 인체 조직의 사용을 승인했다. 1. 동물 및 재료 <ol><li> 지역 동물 보호 법률에 따라 여성 또는 20g (25)에 무게 필요한 DSS 감수성 균주의 수컷 마우스, 집을 사용합니다. 설치류 특별한 차우을 제공하고, 임의 량의 물을 마시는 멸균. </li><li> 멸균 된 수돗물 5 일 : 덱스 트란 황산 나트륨 (36,000-50,000 다 DSS, 분자량) V / 승 3 %를 투여하여 급성 DSS 대장염을 유도한다. 참고 : DSS의 힘 제조 업체 및 배치에 따라 매우 다양하다. 질병 활성의 유도를 위해 먼저 공급 업체에서 제공하는 DSS를 테스트하는 다에 대한ILY 체중은 신뢰할 수있는 객관적 지표입니다. </li><li> 결장 조직 샘플의 조직 학적 평가를 위해 실험 끝에 CO 2 통기 (또는 국가 기관 가이드 라인을 지정)에 의해 마우스를 안락사. </li></ol> 2. 실험 설정 DSS-대장염과에서 시험관 상처 치유 분석 실험 <ol><li> 세포 배양 및 상처 치유 분석의 설립. <ol><li> 37 ° C에서 95 % 습도 및 5 % CO 2 환경의 카코 -2 세포를 성장한다. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 RPMI 배지를 사용한다. </li><li> 높은 문화 인서트 35mm 배양 접시에 4 × 10 5 세포 / cm 2의 밀도 씨 카코 2 세포 (그림 4A 참조). 참고 : 삽입은 상처 영역을 나타내는 정의 된 셀 여유 공간을 분석하기로 분리 된 두 개의 셀 적용 영역을 생성합니다. </li><li> 이일 seedin 후 매체 변경지. 먼저 자동 피펫을 사용하여 세포 파편과 잔류 매체를 흡입에 의해 수행, 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎕ (PBS)로 세척하고 신선한 RPMI 매체 또는 혈청 박탈 매체를 추가합니다. </li><li> 상처 치유 행동의 변화를 감지하는 20 ng를 EGF / ㎖의 혈청 또는 2 μg의 마이 토마 이신 C / ㎖의 혈청 혈청 박탈 매체 (0.1 % FBS)에서 24 시간 동안 배양 세포. 24 시간 동안 세포를 제어하는​​ 정상 RPMI 매체를 추가합니다. </li><li> 문화의 24 시간 후, 제거하고 단계 3.4에 설명 된대로 문화 삽입을 취소하고 DHM을 수행합니다. </li></ol></li><li> 급성 DSS 대장염의 유도 <ol><li> (w / v)의 DSS 솔루션을 3 %를 얻기 위해 물을 멸균 100 ㎖에 DSS의 3g을 녹인다. 7 일간 쥐 광고 무제한에 물을 마시는 대신에이 솔루션을 제공합니다. 마우스 / 하루 DSS-용액 5 ㎖를 계산합니다. 제어 마우스 광고 임의로위한 DSS없이 멸균 된 물을 제공합니다. </li></ol></li><li> 쥐와 인간의 결장의 저온 유지 섹션의 준비<ol><li> 실험의 끝에 CO 2 취입 마우스 안락사. </li><li> 개복술 (23)에 의해 동물의 복부를 해부하다. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 전체 대장을 제거하고 수술 가위를 사용하여 회장 및 직장 끝을 잘라. 직장 끝까지 맹장에서 길이 방향 가위로 결장을 잘라 콜론을 엽니 다. PBS (24)로 세척 한 다음 핀셋을 사용하여 표본에서 모든 배설물을 제거합니다. </li><li> 안쪽으로 곡선 점막과 직장 끝으로 맹장에서 길이 방향으로 새싹 목화와 전체 대장을 감아 스위스 롤을 준비합니다. 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물에 결장 샘플을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오. </li><li> 최적의 절삭 온도 10월 화합물 수술 표본에서 인간의 대장 조직을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오. </li><li> cryoto의 도움으로 OCT의 화합물 내장 표본의 7 μm의 두께의 컷 섹션시험에 날 직전. 주 : 최적 샘플 두께는 조사중인 지속성 및 조직 유형의 분산 특성에 따라 달라진다. 인한 양적 DHM 위상 콘트라스트 영상에서 빛의 산란에 결장 조직 노이즈&gt; 10 ㎛의 원인이 크게 증가 슬라이스 두께를 사​​용하여 설명 된 실험에 대한 두께의 샘플을 &lt;5 ㎛의은 크라이 절단 공정 손상 유도 된 인공물에 대한 높은 위험을 표시하는 동안. </li><li> 유리 개체 캐리어의 슬라이드에 섹션을 전송합니다. </li></ol></li></ol> 3. 기술 장비, 디지털 홀로그램의 수집 및 평가 용 소프트웨어 및 절차 <ol><li> 양적 세포 및 조직의 영상을위한 디지털 홀로그램 현미경 <ol><li> 도 1에 나타낸 바와 같이, 생균 촬상 25 축외 마하 젠더 디지털 홀로그램 현미경 시스템을 사용한다. 현미경이 장착되어 있는지 확인10X 현미경 렌즈 35 mm의 직경을 갖는 유리 물체 운반기 슬라이드와 배양 접시의 홀더와 현미경 단계는 가열 챔버 정량적 위상 촬상 25 생리 37 ° C의 온도 및 소프트웨어를 보존한다. 참고 : 예를 들어, 켐퍼 등 26 Langehanenberg 등 27에 설명 된대로... 주 : 또는 시야 현미경 살아있는 세포의 양적 위상 이미징 해부 조직 슬라이드를 수행 할 수있는 유사한 시스템을 사용한다. </li><li> 면도 현미경 렌즈와 렌즈 클리닝 용지 먼지 또는 기타 오염물을 제거하기 위해 현미경의 제조자가 권장하는 세정제 (예, 에탄올)와 콘덴서. </li><li> 백색광 조명 &quot;의&quot; &quot;시야&quot;영상 모드 스위치를 선택 DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 쾰러 - illumin 확인(다르게는, 표준 화상 취득 소프트웨어가이 단계에서 사용될 수있다), 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창에서 샘플을 관찰하면서 현미경 제조사 권장 샘플 ATION. 주 : 이미지 세기가 시야에 균일하게 분산되어야하며 샘플 위치는 현미경의 초점 거리를 가진 광학 재 집속 중 조작해야한다. </li><li> 레이저 빛 &quot;의&quot;백색광 조명 및 스위치 &quot;OFF&quot;설정 &quot;DHM&quot;영상 모드를 선택합니다. 레이저 광 조명을 균질인지 확인 (즉, 광 강도가 균일 DHM 현미경 영상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창에 분포된다) 및 오프 액시스 캐리어 간섭 줄무늬 패턴이있는 충분한 콘트라스트 나타나는지 관찰 촬영 한 이미지 (디지털 홀로그램). </li></ol></li><li> 이미징을위한 저온 유지 부의 제조DHM와 <ol><li> (두께, 유리 개체 캐리어에 그라 이오 스탯 섹션 : 7 μm의, 2.3에 설명 된대로) 샘플을 냉장고에서. RT 정상 대기에서 약 5 분 동안 샘플을 해동. </li><li> 그 버퍼가 완전히 피복 될 때까지 피펫을 이용하여 조직 절편 상에 매체를 삽입 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS) - (50)를 추가한다. 깨끗한 유리 커버 슬립 (유리 두께 170 μm의)와 샘플을 커버. 주 : 동안 건조 굴절률의 상당한 변화와 샘플의 산란 특성을 유도 할 수있다. </li><li> 유리 캐리어와 커버 슬립의 바닥은 빛의 산란을 유도 할 수 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플은 밝은 필드 현미경 및 DHM와 조사에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> DHM와 조직 절편의 정량적 인 위상 이미지 <ol><li> 디지털 홀로그램 현미경에 스위치 이미징의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. 제 i 시작마법사 수집 상기 DHM 현미경의 소프트웨어와 밝은 파일 영상 모드를 선택합니다. </li><li> 현미경 대물 렌즈에 대향하는 커버 슬립, 현미경 슬라이드 홀더) (2)에 기술 된 바와 같이, 조직 슬라이드를 놓는다. </li><li> DHM 현미경의 시야 조명 &quot;의&quot;전환합니다. 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 관심의 조직 영역은 실시간 감시 창에 표시되는지 확인합니다. 현미경의 초점 거리를 사용하여 이미지의 선명도 향상. 주 :뿐만 아니라 관심 영역이없는 조직 슬라이드의 영역도 시야에 존재한다. </li><li> 화상 획득 소프트웨어를 사용하여 크게 집중 샘플의 명 시야 이미지를 캡처. </li><li> 선택 &quot;DHM&quot;영상 모드, 레이저 광 조명 &quot;의&quot;백색광 조명 &quot;OFF&quot;로 설정하고 전원을 켭니다. 3 밀리 초 이하 홀로그램 기록에 대해 &quot;노출 시간&quot;을 선택하여 그 hologr을 관찰aphic 축외 간섭 줄무늬는 촬상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 디지털 홀로그램을 포착. </li><li> 명 시야 이미지와 다른 샘플 영역 디지털 홀로그램 충분한 수를 기록 할 때까지 3.3.5 - 반복 단계 3.3.3. 홀로그램 인수가 완료되었습니다. </li></ol></li><li> DHM 영상에 대한 상처 치유 분석의 준비 <ol><li> DHM 측정시 안정적인 온도 조건을 보장하기 위해 3 시간 전에 실험의 시작 - 약 1 DHM 현미경의 페트리 접시 가열 챔버에 전환합니다. </li><li> 필요한 장비 (2.3에서 설명하는 상처 치유 분석을위한 배양 접시)와 작업대 준비 : 피펫, 핀셋, 페트리 접시 용 유리 뚜껑, 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)은 생리 학적으로 세포 배양 배지를 버퍼링 무균 환경에서 샘플 준비를위한 온도 (37 °의 C). 참고 : </stroNG&gt; 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 10 % 태아 새끼를 낳다 혈청 (FCS), 20 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) 및 850 ㎎ / ℓ의 NaHCO3로 구성된다. </li><li> 페트리 접시에서 플라스틱 뚜껑을 제거하고 피펫으로 세포 배양 배지를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 배양 접시 바닥에서 삽입물을 제거합니다. </li><li> 사균 상처 영역에 남아있는 세포 성분 (예, 혈청)을 제거하기 위해 버퍼링 한 ML HEPES 세포 배양 배지로 2 회 - 샘플 1을 씻는다. 2 ml의 HEPES를 버퍼링 세포 배양 배지를 추가하고 유리 뚜껑 페트리 접시를 캡. </li><li> 유리 뚜껑과 배양 접시 바닥 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플 DHM와 시간 경과 관찰을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> DHM와 체외에서 상처 치유의 연속 멀티 모드 모니터링 <ol><li> 이전에 3 시간 - DHM 현미경 약 1의 페트리 접시 가열 챔버에 전환실험의 시작에 DHM 측정 중에 안정된 온도 조건을 보장한다. </li><li> 디지털 홀로그램 현미경 &quot;의&quot;스위치, 영상의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 &quot;시야&quot;영상 모드를 선택합니다. 페트리 접시의 가열 챔버는 생리적 온도 (37 ° C)를 작동하는지 확인합니다. </li><li> DHM 현미경의 가열 실 (4)에 기재된 바와 같이 제조 된 상처 치유와 분석 페트리 접시), 놓는다. </li><li> 명 시야 촬상 모드를 선택하고 DHM 현미경 화상 취득 소프트웨어를 실시간 감시 창을 보면서 현미경 스테이지 샘플 위치. 샘플의 원하는 영역이 크게 백색광 조명 아래에 초점을 맞춘 나타납니다 것을 관찰한다. </li><li> 흰색에서 샘플의 서로 다른 영역의 명 시야 이미지 (상처 영역과 합류 세포와 주변 지역을) 캡처화상 획득 소프트웨어 및 문서 모양 세포 밀도와 균일 광 조명과. </li><li> DHM 현미경의 &quot;시야&quot;영상 모드를 선택합니다. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어를 실시간 감시 창 백색광 조명 하에서 적절한 상처 영역을 선택한다. 상처 영역은 죽은 세포없이 혈청 유적에서 무료로 확인하고 양측이 바람직 직선 테두리가 하나의 균일 한 세포 층을 포함 있는지 확인합니다. </li><li> DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 시야 촬상 모드의 초기 창상 면적 백색광 이미지를 캡처. </li><li> 레이저 조명 &quot;의&quot; &quot;DHM&quot;모드 스위치를 선택, 백색광 조명 &quot;OFF&quot;로 설정합니다. 홀로그램 기록 다음 3 밀리의 노광 시간 (간섭 줄무늬가 t의 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 홀로그램 축외 관찰 선택그는 현미경을 DHM)와 디지털 홀로그램을 캡처합니다. </li><li> 화상 획득 소프트웨어 DHM 모드 샘플 홀로그램을 포착하여 화상 품질을 확인하기 위해 DHM 현미경 재구성 소프트웨어 정량적 위상 이미지를 재구성. </li><li> DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 경과 홀로그램 취득 - (5 분 예 3) 적절한 시간 지연을 선택한다. </li><li> 샘플 만 홀로그램 취득 중에 레이저 광이 조사되는 화상 취득 소프트웨어의 시간 경과 획득 모드를 선택한다. </li><li> 상처 치유 분석의 시간 경과 DHM 관찰을 시작합니다. </li><li> , 의도 한 시간 후 시간 경과 수집을 중지 시야의 영상 모드를 선택하고 백색광 영상에서 샘플의 마지막 모습을 문서화합니다. </li></ol></li><li> 해부 조직 디지털 홀로그램을 재구성하고 정량화 파라미터로서 평균 굴절률을 결정조직 밀도 <ol><li> 켐퍼 외. 26 Langehanenberg 외. (27)에 기술 된 바와 같이, 예 DHM 현미경의 소프트웨어 해부 조직의 디지털 홀로그램 양적 위상 이미지를 재구성. </li><li> 관심 (로아) (19)의 적절하게 선택 지역에서 다른 조직 층 (상피 세포, 점막하, 기질)의 평균 위상차 Δφ를 결정합니다. </li><li> 굴절계를 사용하여 또는 대안 문헌 적절한 값을 이용하여 상기 매립 매체의 굴절률을 결정한다. (일반 매립 매체 굴절률 값 : 물 = 1.334 N 28 N 인산염 식염수 (PBS) = 1.337 29 없음 세포 배양 배지 = 1.337-1.339 29,30 버퍼링). </li><li> 평균 위상차 19 값과 다른 조직의 층의 굴절률을 계산 <img alt="식 (1)"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54460 / 54460eq1.jpg&quot;/&gt; (1) 참고 : 식으로. 상기 해부 조직의 두께 D (여기서는이 7㎛) 한 λ는 (λ = 532 nm의 여기) 레이저 광의 파장이고, n은 매질 여기 매립 매체 (굴절률이다 매체 = N PBS N 아베 - 굴절계에 의해 결정 = 1.337). </li></ol></li><li> 재구성과 일련의 관찰 상처 치유 시간 경과에서 디지털 홀로그램을 평가 <ol><li> DHM 현미경 소프트웨어 (26, 27)와 상처 치유 관찰하는 동안 얻은 시간 경과 홀로그램 시리즈에서 양적 위상 이미지를 재구성. </li><li> 최대 위상 콘트라스트 이미지에 양적 위상 이미지의 각 시리즈를 정상화. </li><li> 당 될 수 영상 분할하여 정량적 DHM 위상 이미지의 셀에 의해 커버되는 영역 S의 C를 결정자유 소프트웨어 셀 프로파일을 사용하여 형성 (www.cellprofiler.org 31). </li><li> 면적 S C가 세포 Δφ 셀의 평균 위상차를 계산한다. </li><li> 면적 S의 15 ℃에서의 평균 위상차 Δφ 셀로부터 셀룰러 건조 질량 DM 검색 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" /> (2) 주 :이 DM 셀룰러 건조 질량을 나타내고, 수학 식에서, S C는 세포 및 α = 0.002 ㎡ / kg에 의해 점유되는 영역을 제공한다. </li><li> 적분 셀룰러 굴절률 n 개의 셀 및 세포 배양 배지 N 매질의 굴절률을 결정한다. (30)에 기술 된 바와 같이 부유 세포는 별도로 실험적으로 n 개의 셀을 결정하고 굴절계와 n 개의 매체를 측정한다. 알터상대적으로 n 개의 셀 (30)과 중간 29, 30 N에 대한 문헌 값을 사용합니다. </li><li> λ, Δφ 셀, 셀 N 및 N 매체 26,32으로부터 평균 셀 두께 d 셀 계산 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" /> (삼) 참고 : 식으로. 세 파라미터 D 셀 λ는 레이저 광의 파장 평균 셀 두께를 나타내고있다, Δφ 전지는 평균 위상차를 나타내고, 셀 및 N 중, N은 정수 셀룰러 굴절률과 주위 매체의 굴절율이다. </li></ol></li></ol>

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우리는 DHM은 쥐 대장염 모델에서 조직 학적 손상과 인간의 대장 조직 샘플 생체의 정확한 평가를 제공한다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 DHM 지속적 동시에 세포 변화에 대한 복합 정보를 제공하는 동안 상피 상처 치유를 모니터링 할 수 있습니다 표시. DHM에서 디지털로 촬영 된 홀로그램의 재건 수치 (32)이 수행된다. 따라서, 명 시야 현미경 제르 니케 위상차 미분 간섭 현미경 대조에 비하여, DHM은 선택적 후속 숫자 포커스 보정 (다 초점 화상)와 양적 위상차 (27)를 제공한다. 정량적 인 위상 이미지는 광로 길이의 변화의 판정에 기초하여 이에 이용되는 측정 장치의 매우 독립적이다. 이는 다른 수단에 취득 된 측정 데이터의 비교를 단순화시킨다. 또한, DHM은 OBJE 만 낮은 조명 강도를 필요코네티컷 조명. 이 흠 해부 조직의 침습적 분석을 가능하게하고 살아있는 세포의 장기간 경과 관찰 중 필요한 샘플의 상호 작용의 양을 최소화한다. </p...

염증성 장 즉 질환 (IBD), 궤양 성 대장염 (UC) 및 크론 병 (CD)은 위장관 (1)의 특발성 염증성 질환이다. IBD의 기본 병태 생리 및 잠재적 신약 또는 새로운 진단 방법의 평가에 대한 연구는 특히 중요하다. 모두 기초 연구 및 IBD 환자의 임상 관리에서, 장 점막 관심 2,3의 초점이되었다. 점막은 공생 박테리아, 상피 세포 및 장 면역계의 다양한 세포 구성 요소 간의 상호 작용을 직감 4,5 항상성 조율하는 해부학 적 경계를 나타낸다. 그러나, IBD 환자, 조절되지 않는 영구 장 염증은 결국 자체가 지역의 염증 (6)을 악화 상피 장벽 기능의 고장 절정에 달하다 수 있습니다 궤양이나 협착 등의 검출 손상, 점막 연결됩니다. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 상피 치유 염증 다음 상피 재생을위한 따라서 중요하다뿐만 아니라 위장 수술 7 일 후 위장관 궤양 또는 문 합부 누출의 치유의 핵심 요구 사항입니다 상처. 상피는 치유 검정 치료 시험 관내 상처 시뮬레이션 장내 염증 8,9의 뮤린 모델 수 권취. 두 시험 관내 및 생체 내 접근법 실험 평가의 정확성을 제한하는 문제점을 가지고있다. 시험관 분석법을 고전 스크래치 분석처럼 형광 발색단와 장기화 염색 절차 또는 형질 전환이 필요합니다. 이들은 종종 10을 자동화 할 수없는 세포 증식 및 이동의 그 불연속 모니터링에 의해 제한된다. 이러한 덱스 트란 황산나트륨 (DSS)에 의해 유도 성 대장염과 같은 생체 내 모델을 자주 인해 나타나는 심각한 변화에 부분적으로 강력한 리드 아웃 부족 실험실 마커에, 엄마부적절한 왕 같은 마커는 대장염 심각도 11, 12을 평가한다. 염증 점막의 조직 학적 분석은 여전히 현재 대장염의 심각도를 결정하는 가장 유효한 방법이지만이, 시험 관내 상피 창상 치유의 분석처럼, 염색을 필요로하고 연구자의 ​​전문성 (13)에 따라 달라집니다. 최근 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 정량적 인 위상 현미경 (14)의 변형이 시험 관내 및 생체 내 15 상피 상처 치료의 평가에 유용한 도구로 확인되었다. DHM은 (OPD)의 광로 길이의 지연을 측정함으로써 조직 농도의 평가를 허용 어느 전망 소설 암 진단 16 ~ 18과 염증 관련 조직 변화 (19)의 정량화. 또한, DHM은 셀 두께, 셀 커​​버 표면적 세포 (단백질) 함량의 양을 측정함으로써 세포 형태 역학의 모니터링을 허용 <sup&gt; 15, 20. 생체 외 분석에서, DHM은 생리 학적 과정, 예를 들면, 세포 부피 및 두께 (21, 22)의 변화를 평가함으로써 셀룰러 투수의 분석을 가능하게한다. 또한, DHM 측정 조사원 관련된 샘플 바이어스를 방지하는 자동화 될 수있다. 여기서는 장내 염증의 뮤린 모델 DHM의 사용을 설명하고, 또한, 라벨없는 시험 관내 분석과 같은 상처 치유 정량적 모니터링 인체 조직 시료의 분석을 적용 DHM. 첫째, 우리는 IBD와 인간의 대장염 마우스 및 조직 섹션에서 다른 대장 벽 층의 염증 변화를 평가한다. DHM 정량적 위상 촬상 절차를 기술 한 결과 취득한 정량적 위상 이미지에 대한 평가를 설명도 현미경 성분, 조직 절편의 제조 및 사용에 대한 자세한 설명을 제공한다. 다음으로, DHM은 요로 감염 될 수 있다는 것을 보여시험관 내에서 상피 상처 치유 복합 지속적인 모니터링하게 안정적 및 세포 막 두께, 건조 질량 및 부피 등 셀룰러 세포의 특성 분석을 서술 약물 유도 세포 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxymethane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulphate sodium (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, 웁살라, 스웨덴</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (2-Methylbutane)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>머크, 다름슈타트, 독일</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>시그마 - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Germany</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 티슈 텍 컴파운드&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, 네덜란드</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amphotericin B</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>표준 다이어트</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, 테닝겐, 독일</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &마이크로;-접시 35mm, 배양 인서트 포함, high</td><td>ibidi GmbH, 뮌헨, 독일</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC 뚜껑 &마이크로;-접시용 뚜껑, 유리 인서트 포함</td><td>ibidi GmbH, 뮌헨, 독일</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>디지털 홀로그램 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Component</td><td>Model</td><td>Company</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Germany</td><td></td></tr><tr><td>현미경 렌즈</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, 괴팅겐, 독일</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, 브레멘, 독일</td><td></td></tr></tbody></table>

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

즉, 염증성 장 질환의 발생 빈도는, 크론 병과 궤양 성 대장염은 상당히 지난 10 년간 증가했다. IBD의 원인은 알 수없는 남아 있고 현재 치료 전략은 면역 시스템의 불특정 억제를 기준으로합니다. 특히 현저 IBD의 관리를 향상시킬 수있는 장내 염증과 상피 상처 치유를 표적 치료의 개발은, 그러나 이것은 염증성 변화의 정확한 검출을 필요로한다. 현재 잠재적 인 약물 후보는 일반적으로 생체 내 또는 시험 관내 세포 배양 기술을 기반으로, 동물 모델을 이용하여 평가된다. 조직 학적 검사는 일반적으로 샘플 특성을 변경할 수 있으며, 또한, 연구 결과의 해석은 연구자의 전문성에 따라 다를 수있는 세포 또는 관심의 조직 염색 할 필요합니다. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)는 광로 길이 지연의 검출에 기초하여 허용얼룩없는 양적 위상차 영상. 이 결과는 직접적으로 절대 생 물리적 파라미터와 상관 될 수있다. 우리는 굴절률 측정을 기반으로 DHM와 조직 밀도의 변화 측정, 대장염 쥐와 인간의 대장 조직 표본의 다른 레이어에, 염색하지 않고, 염증성 변화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 건조 중량 및 마이그레이션 세포의 층 두께로 부상 면적과 형태 학적 매개 변수의 동시 결정 간단한 자동 결정을 통해 DHM을 사용하여 체외 가능 상피 상처 치유의 연속 복합 라벨없는 모니터링을 보여줍니다. 결론적으로, DHM은 가치, 소설, 양적 도구 가능한 매개 변수에 대한 절대 값과 장 염증의 평가, 시험관 내에서 상피 상처 치유의 단순화 정량을 나타내고, 따라서 번역 진단 유 높은 잠재력을 가지고있다그 자체.

디지털 홀로그램 현미경에 대한 DHM 이미지에 대한 일반적인 설정 (DHM) 도 1b에 도시 된 바와 같이 명 시야 촬상 정량적 DHM 위상차 촬상을 수행하기 위해 거꾸로 현미경을 적용 하였다. (25) 상술 한 바와 같이 시스템이하는 DHM 모듈을 부착시킴으로써 변성시켰다. 마하 젠더 구성 (도 1 A)에 YAG 레이저 λ = 532 ㎚) : 디지털 홀로그램을 조명함으로써 주파수의 Nd 배의 빛으로 샘플을 생성 하였다. 해부 조직 유리 캐리어 슬라이드 생체 분석 하였다. .도 <str...

염증성 장질환 치료를 위한 잠재적 신약의 평가에는 항염증 효과의 정확한 평가가 가장 중요합니다. 디지털 홀로그램 현미경은 쥐 및 인간 결장 조직 샘플의 염증 평가뿐만 아니라 상피 상처 치유의 체외 자동 다중 모드 평가를 제공합니다.

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

이 연구의 전반적인 목표는 디지털 홀로그램 현미경 또는 DHM을 사용하여 상피 상처 치유의 시험관 내 다중 모드 평가를 위해 장 염증 결장 조직 샘플의 자동화된 염색 없는 정량적 위상차 이미징을 제공하는 것입니다. 이 방법은 인간과 해양에 염증을 일으킨 질병 활동에 대한 위장 염증 및 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 얼룩이 없고 객관적인 방식으로 물리적 매개변수에 의해 세포와 조직을 검출하고 정량화할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 Biomedical Technology Center의 기술자인 Fittest Ketelhut입니다.세포 배양을 설정하고, 4 번 10에서 5 번째로, 95 %의 습도와 5 %의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 FBS와 항생제가 보충 된 RPMI 배지에 높은 배양 삽입물이 장착 된 35mm 페트리 접시에 2 개의 세포를 제곱 센티미터당 2 개 배양합니다. 이틀 후, 관심 물질로 세포를 처리하고 추가로 24시간 동안 배양액을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음날 상등액을 흡인하고 핀셋을 사용하여 삽입물을 제거합니다.1 밀리리터의 HEPES 완충 세포 배양 배지로 배양액을 1-2 회 세척하여 상처 부위에서 죽은 세포와 남아있는 세포 성분을 제거합니다. 그런 다음 2 밀리리터의 신선한 HEPES 완충 매체를 넣고 접시를 닫습니다. 이제 페트리 접시를 디지털 홀로그램 현미경에 놓고 10 x 대물렌즈를 선택합니다.이미지 획득 소프트웨어를 열고 명시야 이미징 모드를 선택합니다. 가열 챔버를 섭씨 37도로 설정하고 배양액을 가열 챔버에 넣습니다. 다음으로, 하나의 거대한 세포층과 죽은 세포나 혈청이 없는 양쪽의 직선 경계가 있는 적절한 상처를 실시간 모니터링 창에서 시각화할 수 있을 때까지 시야를 이동합니다.초기 상처 부위의 백색광 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 백색광 조명을 끄고 디지털 홀로그램 현미경 모드를 선택합니다. 레이저 조명을 켜고 홀로그램 녹화를 위해 3밀리초 미만의 노출 시간을 선택합니다.홀로그램 오프 액세스 간섭 무늬가 적절한 대비로 나타나면 샘플 홀로그램을 캡처하고 재구성 소프트웨어로 정량적 위상 이미지를 재구성하여 이미지 품질을 확인합니다. 그런 다음 상처에 대한 시간 경과에 따른 DHM 관찰을 시작하여 적절한 종점에서 기록을 중지하고 백색광 조명 아래에서 샘플의 최종 이미지를 얻습니다. 급성 덱스트런 황산나트륨 또는 DSS 대장염 유도의 경우, 100밀리리터의 오토클레이브 물에 용해된 DSS 3g을 마우스 ablibidim에게 제공합니다.7일 후, 대조군과 처리한 동물로부터 7마이크로미터 두께의 스위스 압연 결장 샘플을 얻습니다. 각 섹션을 50-100 마이크로 리터의 PBS에 담그고 개별 유리 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 슬라이드 바닥에 먼지 및 기타 오염이 없는지 확인하십시오.그런 다음 첫 번째 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 관심 조직 영역이 보일 때까지 시야를 조정합니다. 샘플에 선명한 초점을 맞추고 이미지 획득 소프트웨어에서 명시야 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 DHM 이미징 모드를 선택하고 레이저 조명으로 전환합니다.노출 시간을 3밀리초 미만으로 설정하고 홀로그램 오프 액세스 간섭 무늬가 라이브 이미징 창에서 적절한 대비로 나타나는지 확인합니다. 그런 다음 조직의 디지털 홀로그램을 캡처합니다. 내시경적으로 중등도에서 중증의 대장염의 증거에는 결장 벽이 두꺼워짐, 혈관 패턴의 변화, 섬유 결손 및 점막 표면 세분화가 포함됩니다.결장 단면에 대한 기존의 조직학적 평가는 주로 점막하층에 위치한 대조 동물에 비해 DSS 치료의 결장 벽에 현저한 부종을 보여줍니다. 해당 정량적 DHM 위상차 이미지 및 관련 굴절률 맵은 또한 상피 월경의 밀도에 눈에 띄는 차이가 없는 이러한 조직 변화가 염색되지 않은 천연 조직 샘플에서 특히 분명하다는 것을 보여줍니다. 대장이 있는 마우스의 상피, 점막하 및 기질에서 굴절률은 건강한 대조군에 비해 현저히 감소했으며, 이는 실험 동물의 체중의 상대적 손실과 굴절률 사이에 상당한 상관관계가 있습니다.여기에서는 45시간 동안 디지털 홀로그램 현미경으로 상처 치유 분석의 대표적인 연속 모니터링을 보여줍니다. 치유 과정 동안 세포가 덮인 표면적, 평균 세포 두께 및 세포 건조 질량을 계산할 수 있습니다. 우리는 DHM이 상피 상처 치유를 지속적으로 모니터링하는 동시에 사이토카인 유도 세포 변형에 대한 생체 핵심 정보를 제공한다는 것을 보여주었습니다.또한, 굴절률 변화 측정을 통해 DHM에 의한 대장염 모델 및 인간 결장 조직 샘플의 조직학적 손상에 대한 정확한 평가를 입증합니다. DHM은 광학 경로 길이 지연의 감지를 기반으로 하기 때문에 조직 밀도, 건조 질량 또는 세포 두께와 같은 절대 생물물리학적 매개변수를 염색 없는 정량적 위상차 이미징으로 분석할 수 있습니다. 일반적인 연구용 현미경을 사용한 DHM의 정점과 이 기술의 견고성은 세포 생물학 및 디지털 병리학에서 이 방법을 일상적으로 적용할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 생물 의학 실험실 환경에서 살아있는 세포 배양 조직을 분석하기 위해 디지털 홀로그램 현미경을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 결론적으로, DHM은 염증 절대 매개변수를 평가할 뿐만 아니라 중개 진단 사용 가능성이 높은 상피 자발적 체외의 단순화된 정량화를 위한 가치 있고 새롭고도 정량적인 도구를 만듭니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

약하게 산란 물체의 3 차원 위치를 고유 표준 현미경에 사소한 변형을 수반 인라인 디지털 홀로그램 현미경 (DIHM)를 사용하여 식별 될 수있다. 우리의 소프트웨어는 삼차원 위치 및 미세한 위상 객체의 형상을 수득 레일리-펠드 역 전파 결합 촬상 간단한 휴리스틱을 사용한다.

약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

명시야와 미분 간섭 대비 이미지의 조합을 통해 세포 질량, 부피 및 밀도의 정량적 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

작은 동물 이미징 기술은 직렬 진단 시험 및 생체 내에서 치료 적 개입을 허용한다. 최근, 응용 프로그램의 범위가 크게 확대하고 현재 대장 종양 발생의 평가, 상처 치유 및 염증의 모니터링이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 내시경 검사의 이러한 다양한 응용 가능성을 보여줍니다.

에 대한 쥐의 내시경 생체 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

여기에서는 레이저로 인한 상처 시 장의 이미지를 얻는 방법을 제시합니다. 마우스 장을 다광자 레이저에 노출시킴으로써, 단일 또는 다중 crypt(들)의 손실이 국소적으로 유도된다. 수개월에 걸쳐 손상된 부위를 반복적으로 이미징하여 장 회복의 실시간 역학을 캡처합니다.

장 리모델링을 연구하기 위한 레이저 절제 및 생체 내 현미경 검사

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

본 연구는 전체 마운트 장 조직과 다광자 현미경을 사용하여 분비된 점액을 정량화하여 카르바모일콜린 클로라이드와 같은 자극에 대한 점액 역학의 정밀한 체적 분석 및 시각화를 가능하게 하는 3D 이미징 방법을 제시합니다.

전체 마운트 조직 이미징을 사용한 장 점액의 3차원 정량화

학습하세요 디지털 홀로그램 현미경을 이용한 장내 염증 및 상피 상처 치유 평가 방법을. Caco-2 세포 배양과 자동화된 정량적 위상 대비 이미징으로 염증성 장 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

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