Name: 세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 광매개 하이드로겔 형성 및 패터닝을 이용한 3D 세포 배양 기법. 이 방법은 세포 캡슐화와 조직 공학 연구에 활용할 수 있는 견고한 합성 매트릭스를 제공합니다.

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이 작품은 약 발견과 (각각 P20GM104316 및 P30의 GM110758-01) 국민 건강의 국립 연구소에서 장군 의학 연구소에서 제도 개발 수상에 의해 자금 고급 생체 적합 물질, 퓨 자선 트러스트에서 델라웨어 코 브레 프로그램에 의해 지원되었다 (00026178), 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 상 (DMR-1253906)에 버로우즈 웰컴 기금 (1,006,787), 델라웨어 대학의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IGERT SBE2 프로그램 (L. Sawicki 씨에 교제). 저자는 공 초점 현미경에 대한 교육과 액세스를 위해 델라웨어 대학의 델라웨어 생명 공학 연구소 BioImaging 센터 감사, 미스 캐서린 윌 에이 비디오 촬영하는 동안 도움 씨 마태 복음 Rehmann 관대 골수, 교수 크리스토퍼 J에서 분리 된 중배엽 줄기 세포를 제공하는 자동 플레이트 리더를 사용합니다. Kloxin 씨 스티븐 마 관대하게 제공하는 포토 마스크, 그리고 교수 윌프레드 첸. </p&gt;

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여기에 제시된 절차는 티올 - 엔의 클릭 화학에 의해 형성된 하이드로 겔 내에서 세포를 photoencapsulate하는 기술에 대해 설명하고 이후 생화학 적 단서와 젤을 photopattern. 처음 하이드로 겔을 형성하는 광을 이용하여 중합 전에 중합체 용액 내에서 균일하게 혼합하고, 세포 현탁액을 허용한다. 신속한 중합 &quot;잠금&quot;정의 된 몰드의 형상의 겔 및 하이드로 겔 네트워크 내에서 세포를 현탁 캡슐화한다. 젤은 원하는 최종 용도에 따라 여러 가지 형상 (예를 들면, 유리 슬라이드 나 주사기 팁)으로 성형 될 수있다. 광 감쇠가 얇은 시료 내에 한정되어 예를 들어, 유리 슬라이드에 부착 된 하이드로 겔의 3 차원 배양에 캡슐화 된 세포 이미징 애플리케이션에 특히 유용하다. 주사기 금형 단시간에 제조 할 수 많은 샘플을 허용 세포의 빠른 밀봉 사용될 수있다 (유리 슬라이드에 비해이러한 세포 계측법 또는 qPCR에 따라 유동 세포의 다수의 요구 실험에 사용할 수있는 (S)). 그 후,이 젤은 그러한 분화 또는 침공으로 원하는 세포 반응을 유도하는 생화학 적 단서로 패턴 화 될 수있다. (30, 31) 생존 및 대사 활성에 대한 분석은 주어진 자료 시스템 셀 패터닝 상태의 생존을 나타낸다. 신진 대사 활동이 세포 기능에 중합 및 패터닝 조건의 초기 효과를 평가하기 위해 비 분해성 젤에서 3 일까지 (RGKGRK 펩티드 가교)를 모니터링 하였다합니다. 또한, 분해 펩타이드 가교 (GPQGIWGQ) 배합 젤의 후 캡슐은 세포 생존과 문화에 1 주 확산 남아 지원 1, 6 일째 중배엽 줄기 세포의 막 무결성 분석 (라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 염색). 추가 세포주의 생존은 32 것과 유사한 포토 패터닝 조건보고되었다여기에 사용되는 실시간 / 죽은 염색 및 대사 활성 분석을 사용하여 설명 된 하이드로 겔 시스템을 평가할 수있다. 우리는이 재료 시스템과 관련된 프로 시저 (4.2 및 4.3)을 사용하여 세포 생존 문제가 관찰되지 않은 반면, 일부 세포 유형은 유리 라디칼 및 / 또는 광 노출에 민감 할 수있다. 이 경우, 사용자는 아 지드 - 알킨 12 FXIII 31 또는 딜스 - 알더 계 하이드로 겔 형성 화학 비 광 개시 물질 시스템을 쓸 수있다. (33) 손쉬운 기술은 감지하고도 (3.1 및 3.2)을 제시 겔 내에서 생화학 적 단서의 패턴을 정량화한다. 시약은 상업적으로 입수 가능하고 별도의 합성 공정 단계 또는 더 비싼 시약 (예를 들어, 형광 표지 된 펩티드)가 필요 없기 때문에 엘만 (Ellman) 분석법이 특히 중요하다. 엘만 (Ellman) 분석을 정확하게 differe 아래 생화학 단서 자유 티올의 변경을 결정하기 위해 사용될 수있다NT 조건을 포토 패터닝뿐만 아니라 신속하게 패턴을 시각화. 펩티드 결합의 양적 측정으로서, 펩티드 결합 전과 후의 패터닝 티올 관능기 농도를 정량화 직접 엘만 (Ellman) 분석법으로 평가된다. 정량이 유형의 형광 표지 된 펩티드를 사용하여 수행 할 수 있지만, 34 촬상 계 정량 이상의 시간이 걸리는 처리 및 분석 단계가 필요 (예를 들어, 검량선의 형광 표지 된 펩티드 및 생성의 합성 펩티드 농도 형광 관계를 맺기 위해서는 ) 이미지 분석을 사용. 촬상 펩티드 혼입, 엘만 (Ellman) 시약에 직접 샘플에 도포하고 즉시 구상 할 수있다. X 축 및 패턴 시각화, Y 평면에 한정되는 반면,이 기술은 유리 티올기를 함유하는 기질이 패터닝되어있는 경우를 결정하기 위해 간단한 통상적 인 방법으로 사용될 수있다. 은 엘만 (Ellman) 분석법 C 아니라는 것을 유의해야onsidered cytocompatible는 photopatterns 관찰하고 정량화하는데 이용 될 수 있도록하면서, 그것은 세포의 존재하에 수행 할 수 없다. 입체적으로 세포의 존재 패턴을 이미징, 하이드로 겔 매트릭스 내의 형광 펩티드의 결합은 강력하고 널리 사용되는 방법 남아있다. 패턴의 해상도는 Y 축, X 축에서 평가 될 수 있고, Z 평면 공 촛점 현미경을 사용하고, 패터닝 된 영역 또는 비 패턴 영역 내의 셀들이 식별 될 수 있도록이 방법 cytocompatible이다. 함께 찍은, 엘만 (Ellman) 분석 및 이미징 기반 기술은 연구자들이 모두 양적 및 질적 자료 시스템 내에서 생화학 적 단서의 포토 패터닝을 평가하기위한 보완적인 도구입니다. Photoclick 또는 더 넓게 광 개시는 세포의 존재 하에서 하이드로 겔의 형성을위한 화학 및 수정이 많다. 여기에 제시된 성형, 캡슐화, 패터닝 기술은 액세스 제한되지 않습니다전술 한 재료 시스템으로 제한없는 및 그러한 티올 알킨 35 지드 - 알킨, 4 및 기타 티올 - 엔 화학 (예, 티올 넨) 10,13뿐만 아니라와 같은 다른 광 - 기반의 화학 물질에 적용 할 수있다 예컨대, 이르가 큐어 2959, 에오신 Y, 및 캄 포르 퀴논 등의 다른 광개시제. 사용자가 프로 시저 매개 변수를 조정해야 할 수도 있습니다 (예를 들어, 배양 시간, 중합 시간, 세포 밀도는) 조건이 다른 시스템에 대한 cytocompatible 남아 있는지 확인합니다. 패터닝 처리는 하이드로 겔 (2.2.3-2.2.5)로 ALLOC 변성 펩티드 (들)의 확산을 필요로하기 때문에,이 프로세스는 인테그린 - 결합 부분 (예를 들면, 펩타이드 또는 세포 외 기질 단백질의 첨가에 가장 유용 할 수있다 네트워크에 대한 리간드의 부착은 셀 전체 인테그린 활성화에 의해 견인력의 생성에 필요한 하이드로 겔에 단편). 36 주, 생체에 대한 그 수도솔루션 또는 고정 (예를 들면, 성장 인자 또는 사이토 카인)에 유사 활성화, 하이드로 겔에 부분 확산 (~ 1 시간)의 배양 단계는 패터닝 결과를 나선상 이벤트를 신호로 이어질 수 있습니다. 다른 방법은 패터닝 성장 인자 고정화 또는 로컬 격리 확립되었다. 37-39는 또한 패턴 해상도는 노광에 대한 제어에 의해 결정된다. 여기서, 포토 마스크 겔 깊이 통과하여 X 및 Y 평면에 패턴 작성을 허용; 그러나, 겔 내의 생화학 큐 패터닝을보다 공간 제어는 X 방향의 패턴, Y- 및 Z- 평면을 생성하기위한 두 개의 광자 공 초점 현미경의 사용과 같은 방사의 다른 방법으로 달성 될 수있다. 34,40 마지막으로,이 과정에서 사용되는 재료 시스템이 초기에만 생화학 단서로 변형되는 동안, 직교 photoclick 화학은 알테를 허용하도록 사용될 수 있음에 유의해야여기에 제시된 시간에 매트릭스 속성에서 식량. (12) 절차와 기술은 잘 정의 및 시공간으로 제어 특성을 가진 합성 매트릭스를 생성하기위한 현재의 접근 방식에 다양성을 추가 할 수 있습니다. 특히,이 과정에서 사용되는 시약 및 물질의 상업적 유용성은 제어 된 세포 배양에서의 애플리케이션을 위해 하이드로 겔 기반 바이오 물질의 이용에 관심이 연구자의 넓은 범위에서 유용 할 것이다.

클릭 화학은 점점 더 자신의 선택, 효율적으로, 그리고 자주 cytocompatible 반응성으로 인해, 약물 전달, 조직 공학, 제어 세포 배양 등 다양한 생물 의학 응용, 재료의 설계에 사용됩니다. 트리거 빛을 활용 1-3 Photoclick 화학 또는 반응을 개시 (예를 들면, 아 지드 - 알킨, 4- 티올 - 엔, 5, 테트라 졸 알켄 6)는 생체 물질의 형성 또는 수정을 위해 특히 중요하다. 그들은 빛을 발생하는 세포의 존재 생체 재료 특성의 사용자가 직접 제어에 적합. 특히 7, 8 이러한 반응을 온화한 조건과 때의 통제하에 빠른 속도는, 티올 - 엔의 photoclick 화학 물질이 사용되어왔다 없는 견고한 기계적 성질 5,9 함께 포함하지만, 세포 유형의 다양한 밀봉 용 겔 - 기반 생체 물질을 생성또한, 이러한 화학이 주요 측면을 모방하는 생화학 적 단서의 공간적 패턴에 사용 된 t 세포 배양 및 전달을위한 약속, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포), 섬유 아세포, 연골 세포, 췌장 세포, 제한. 10, 11 원시 세포 미세 환경 및 부착, 분화 및 침입는 해당 셀 매트릭스 상호 작용을 촉진한다. 3,12 일반적으로 cytocompatible 조건에서 빠른, 광 개시 중합 아크릴 레이트 또는 노보 넨 ( &#39;엔&#39;)으로 작용 중합체와 반응시킨다. 빛 티올 엔 하이드로 겔, 시스테인 (티올)를 포함하는 펩티드의 건설 (13)이 도구 상자를 확장, 우리는 설정하고자 최소한의 합성 처리를 요구 또는 합성 세포 외 매트릭스 그들의 광범위한 사용을 향해 상업적으로 사용할 수 있었던 새로운 다목적 접근 빌딩 블록과 하이드로 겔 형성 방법에 관한 것이다.[비 분해성 또는 세포 분해 가교를 위해 K를 (세포 부착 [K (ALLOC) GWGRGDS = Pep1Alloc] 또는 둘을 촉진하기 펜던트 하나, 인테그린 결합 그룹 : 14 구체적으로는, 펩티드 (Alloc를) 알릴으로 수정 된이 라이신을 -protected ALLOC) RGKGRKGK (ALLOC) G 또는 KK (ALLOC) GGPQGIWGQGK (ALLOC) K = Pep2Alloc, 각각]. 이러한 순서로, 조건은 네 개의 암 티올 - 개질 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG4SH) 장파장 자외선 (365 nm에서 10 mW의 / cm 2)의 cytocompatible 용량 사용에 신속한 반응 (1-5 분) 확립 된 광개시제 리튬 페닐 -2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate (LAP). 그 결과 하이드로 겔은 주에 대한 세포 배양 조건에서 안정. 셀 기반의 분해 및 리모델링을 활성화하기 위해, 효소 분해성 펩티드 겔 가교 (즉, GPQGIWGQ), (15) 및 모델 차 전지, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포) 내에 설립되어, 두린 캡슐화 및 후 매우 실용적 남아이 행렬에서 g 문화. 또한, 펩티드는 공간적으로 이러한 물질 내에서 패턴 화되어 있고, 중배엽 줄기 세포는 생존과 포토 패터닝 조건에서 대사 활성 상태로 유지됩니다. 다른 펜던트 펩티드 서열이 여기에 도시되지 않은 (예 IKVAV는 YIGSR, GFOGER 등)도 주위의 미세 환경과 추가적인 세포 상호 작용을 조사하기 위해 매트릭스 내에 통합 될 수있다. 이러한 결과는 다양한 종류의 세포에 대한 연구에 3 차원 (3D) 세포 배양 및 전달 이러한 하이드로 겔 계 물질의 도포 직접적인 세포 - 매트릭스 상호 작용을위한 유망한. 여기서, 방법은 세포를 photoencapsulate하고 제안 된 하이드로 겔 시스템 내에서 연속적으로 photopattern 생화학 적 단서 (그림 1)되게됩니다. 관찰하고 이러한 photopatterns을 정량화하는 기술이 입증되어 특히, ⅰ) 엘만 (Ellman) 분석의 양적, 질적 사용이 modifica를 결정하기 위해패턴 화 된 기판과 형광 펩타이드 (AF488Pep1Alloc)의 ⅱ) 보완 질적 사용 내에서 무료 티올의 기 세 가지 차원에서 이러한 패턴을 관찰합니다. 또한, 생존력 분석법 (생균 / 죽은 생존력 / 세포 독성 염색) 및 대사 활성을 측정하기 (MTS 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 설포 페닐) 사용자가 하이드로 겔 매트릭스 내의 다른 세포주 photoencapsulation 및 포토 패터닝 cytocompatibility 조건을 결정할 수 있도록 -2H-졸륨)가 제시된다. 프로토콜이 용이 한 광 기반 photoclick 하이드로 젤 시스템 시연되고 있지만, 기술은 세포의 존재 photoencapsulation 포토 패터닝 및 수많은 다른 라디칼 - 개시 하이드로 시스템에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>맞춤형 펩타이드:</td><td>다양한 공급업체</td><td>----</td><td>펩타이드는 ChemImpex 및 ChemPep을 포함한 공급업체의 재료와 함께 표준 SPPS 기술을 통해 합성될 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>4-arm PEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Multi-arm Homofunctional PEGs에 등재되었습니다. PEG4SH는 또한 이전에 언급된 바와 같이 합성될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이</td>트 <td>콜로라도 포토폴리머 솔루션</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 페닐포스포나이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>149470</td><td>주의, 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킵니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>2,4,6-트리메틸벤조일 클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>682519</td><td>주의, 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킵니다. 보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>리튬 브로마이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-부타논</td><td>시그마 알드리치</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>플라스크, 라운드 바텀, 100&nbsp; ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80ml 필터 깔때기, Buchner, Medium Frit</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>원하는 경우 일반 유리 깔때기 내부에 여과지를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마그네틱 교반 바</td><td>다양한 공급 업체</td> <td>----</td><td></td></tr> <tr><td>마그네틱 교반 및 핫 플레이트</td><td>, 다양한 공급 업체</td> <td>----</td><td></td></tr> <tr><td>진공 데시케이터</td><td>, 다양한 공급 업체</td> <td>----</td><td></td></tr> <tr><td>중수소 산화물</td><td>아크로스 유기물</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>곰팡이존</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>세포 유형에 따라 적절한 배지와 트립신을 선택하십시오.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>다양한 공급업체</td><td>----</td><td>1.5 또는 2ml 크기, 멸균.</td></tr><tr><td>슬립 (루어) 팁이있는 BD 주사기 (바늘 없음)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>여기에 나열된 제품 번호는 1ml 주사기 (16H)이며 다양한 크기를 사용할 수 있습니다 (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 평면 유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>고순도 실리콘 고무, 0.010" 두께, 6" x 8" 시트, 55A 듀로미터 (가스켓)</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 프루프</td><td>데콘 랩스</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, 오리지널</td><td>아마존</td><td>800002243</td><td>다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>Photomask Division은 필요에 따라 다른 디자인을 인쇄할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디티엔비; 엘먼의 시약; 5,5-디티오-비스(2-니트로벤조산)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>, 시그마 Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 펠릿/인증 ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>오르토인산</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>시스테인 하이드로클로라이드 일수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트, 포유류 세포용</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>다양한 공급업체</td><td>----</td><td>90-110 x g의 속도 가능.</td></tr><tr><td>Multiwell Plate Reader</td><td>다양한 공급업체</td><td>----</td><td>96웰 플레이트에서 405nm에서 흡광도를 판독할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Epifluorescent or Confocal Microscope</td>: <td>다양한 공급업체</td><td>----</td><td>하이드로겔 내의 펩타이드 패턴과 세포를 시각화합니다.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo 시리즈 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>대체 조명 시스템을 사용하여 하이드로겔을 중합할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>----</td> <td>zeiss.com 에서 사용 가능; Zeiss 현미경으로 촬영한 이미지와 호환 가능</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>----</td> <td>imagej.nih.gov 에서 사용 가능, 일반 이미지 분석에 적용 가능</td></tr></tbody></table>

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

클릭 화학은 약물 전달체, 조직 공학, 세포 배양 등 다양한 생체 물질 애플리케이션에 사용하기 위해 연구되었다. 이러한 광 개시 티올 - 엔 - 티올 반응 yne 같은 특정 광 매개 클릭 반응에서는, 소재 특성 통해 시공간 제어 수득 사용자 지향 특성 제어의 높은 수준의 시스템 설계를 허용한다. 제조 및 광 이들 티올 photoclick X의 화학적 성질에 의해 제공되는 기능성에 의해 제공되는 정밀도를 이용하여 겔 - 기반 생체 재료의 변형이 특히 잘 정의 된, 생체 모방 미세 환경 내 세포의 배양을 위해, 관심이 높아지고있다. 여기, 우리는 세포와 티올 엔의 photoclick 반응에 의해 중합 다양한 모듈 형 빌딩 블록을 사용하여 하이드로 겔 매트릭스 내에서 생화학 적 단서 후속 포토 패터닝의 photoencapsulation 방법을 설명합니다. 특히, 방법은 공동으로 제공된다알릴에서 nstructing 하이드로 겔 (Alloc를) -functionalized 펩티드 가교 펜던트 펩티드 잔기 빠르게 리튬 acylphosphinate 광개시제 및 장파장 자외선 (UV) 광의 cytocompatible 투여의 존재 하에서 중합 티올 - 관능 화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG). 손쉬운 기술은 포토 패터닝을 시각화하고 설명하는 추가 된 펩타이드의 농도를 정량화한다. 또한, 방법은, 캡슐화 세포 특이 적 인간 중간 엽 줄기 세포의 확립 및 생존력과 활성을 측정한다. 형성 및 티올 ALLOC 하이드로 겔의 초기 패터닝 여기에 도시되어 있지만, 이들 기술은 크게 패터닝 기판을 생성하기 위해 다른 광 라디칼 개시 재료 시스템 (예를 들어, 티올 넨, 티올 레이트)의 개수에 적용될 수있다.

설치 및 절차는도 1에 도시되어 세포와 캡슐화 된 세포를 포함하는 후속 photopattern 겔 photoencapsulate하고, 스톡 용액을 제조 한 예는 10 중량 % 겔은 표 1에 제공된다 형성 하였다. 표 1을 사용하여, 단량체의 양 (PEG4SH을 , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) 및 하이드로 겔을 중합하는 데 필요한 광개시제 (LAP)을 계산한다. 이러한 계산을 바탕으로, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc 및 LAP의 재고 솔루션을 준비하고 함께하고 형성하는 각각 (그림 1A)를 젤, 포토 패터닝을위한 Pep1Alloc없이 혼합. 그 후, 세포를 플레이트에서 수집 계산하고, 캡슐화 (그림 1B) 적절한 양으로 원심 분리된다. 세포 펠렛은 겔 형성 용액 (PBS 펩티드 / 폴리머 / LAP)에서 재현 탁하고, 세포 / 단량체 혼합물은 유리 주사기 몰 전사DS. 세포들은 빛의인가시 하이드로 겔 내에서 (도 1C) (10 mW의 / cm 365 nm에서 2 ~ 5 분)으로 캡슐화된다. (도 1D)을 포토 패터닝 들어 겔 중합 매트릭스 내로 펩티드 및 개시제의 확산을 허용하고, 1 시간 30 분, 30 분 Pep1Alloc 및 LAP에 침지된다. 이 펩티드 함유 겔은 원하는 패턴을 포토 마스크로 덮여 매트릭스 내에서 무료 티올에 펩티드 공역 빛 (1 분)의 두 번째 투여 량에 노출되어있다. 펜던트 사슬은 공유 적절한 세포 - 매트릭스 상호 작용을 촉진하고 체외에서 세포 기능과 운명을 프로빙 방향으로 원시 세포 미세 환경의 주요 기계적 및 생화학 적 특성을 흉내 낸, 빛에 노출 된 지역에서 젤에 연결되어 있습니다. 엘만 (Ellman) 분석은 photopatte 내에서 겔 수정 및 펩타이드 결합을 정량화 할 수있는 손쉬운하고 저렴한 방법을 제공rned 기판. 패턴 및 비 패턴 젤 (즉, 또는 펩티드 수정하지 않고 젤) 엘만 (Ellman) 반응 버퍼 후 중합에 배어있다. 다음으로, 시스테인 표준 및 버퍼에 담가 겔 48 웰 플레이트에 넣고 엘만 (Ellman) 시약 (왼쪽 그림 2A)와 함께 배양한다. 1 시간 30 분 후 샘플의 분취 량을 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 배치하고, 흡광도를 405 nm에서 기록된다. 시스테인으로부터 표준 검량선 (도 2a, 오른쪽) (흡광도 선형 피팅 농도 VS) 플롯하고, 겔의 자유 티올의 금액은 희석 인자에 기초하여 결정될 수있다. 10 중량 %의 겔의 여러 중합 조건에 포토 패터닝이 유리 티올 농도는도 2b에 도시되어있다. (파란색 막대, I = 1 분, II = 5 분) Pep1Alloc없이 1 또는 5 분 동안 중합 젤은 t을 나타내는 통계적으로 유사한 무료 티올 농도가모자 빠른 반응이 발생하고 겔화 1 분 (양측 t 검정, P&gt; 0.05) 내에 완료됩니다. 따라서, 빛에 추가 노출 (2-5분)는 작용기의 추가 전환 발생하지 않습니다. Pep1Alloc없이 1 분간 중합 젤 (30)과 90 분 (3 ㎎ / ㎖) 및 LAP (2.2 mM)을 (녹색 바, II = 30 분, IV = 90 분) Pep1Alloc 적신 빛의 두 번째 투여 량에 노출 1 분. 무료 티올의 감소 (1 분 조건에 대한 60-80%)는 이러한 조건 하에서 펜던트 단서와 젤의 효율적인 변경을 나타냅니다. 높은 변형이 필요한 경우, Pep1Alloc 용액의 증가 된 농도의 펩티드 용액 전환을 제한 할 수있다 희석 이상의 무연 티올로 Pep1Alloc 접근성로서 사용될 수있다; 예를 들어, 우리는 / ㎖ Pep1Alloc 20 mg의 최대 농도는 무료 티올의&gt; 90 % 변환을 생산하는 것으로 나타났습니다. 유일 펩티드의 패턴은 하이드로 겔에 첨가 할 수있다빠르게 엘만 (Ellman) 시약 (5 분 아래 그림 3A)으로 이미지화 될 수있다. 그러나, 패턴의 시각화 시간 (이상 5 분) 겔을 통해 노란색 TNB 2가 음이온의 확산으로 인해 이상 손실됩니다. 영상 해상도 개선 입체적 (X 축, Y 축, Z 평면)과 세포의 존재의 패턴을 관찰, 형광 펩티드 첨가 (AF488Pep1Alloc)가 이용 될 수있다. 그림 (b)의 x 축에서 y 축과 공 초점 현미경으로 촬영 한 이미지 스택의 Z-돌기 패턴 해상도 (μm의 규모)를 보여주는 표시됩니다. 약 (94 ± 2) %와 분해 젤 (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) 내에서 캡슐화 된 중배엽 줄기 세포의 (94 ± 1) %는 빨간색 핵 (몇 죽은 세포로 각각 1, 육일 캡슐화 한 후 실행 가능한 (녹색 세포 기관을) 유지 ) 관찰 (도 4A). 또한, hMSC 포스트 캡슐화 육일 (에서 관찰된다 확산 <st<html> 룽&gt; 그림 4A, 삽입), 세포 개조 및 인테그린 결합 RGDS와 수정이 MMP-분해 행렬과 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다. 비 분해성 젤 (Pep2Alloc = RGKGRK)에 캡슐화 된 세포에서 수행 신진 대사 활동 분석 한 3 일 후 캡슐화 (그림 4B) 세포 생존 능력의 두 번째 측정을 제공하고 세포 테스트 다양한 photoencapsulation 및 포토 패터닝 조건에 대한 활성 상태로 유지 있음을 입증 엘만 (Ellman) 분석 (그림 2B). 특히 Pep1Alloc + LAP (상태 III 및 IV)과의 초기 밀봉 (조건 I 및 II)와 함께 30 분 및 90 분 인큐베이션 간 대사 활성의 유의 한 차이는 절차 포토 패터닝의 응용에 적합한 것을 나타내는 없다 캡슐화 된 세포의 존재는 (t 검정, p&gt; 0.05 양측). 2fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 하이드로 겔 내에서 세포를 캡슐화 이후 생화학 큐와 함께 포토 패터닝을위한 설정 (A) 거대 단량체 및 광개시제의 재고 솔루션이 준비되어 혼합 (PEG4SH = 백본, Pep2Alloc = 가교, Pep1Alloc = 펜던트 접착 부분 (RGDS), LAP = 광개시제 ). (B) 세포 캡슐화를 위해 수집됩니다. (C) 세포 (각각 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP 또는 PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP)없이 또는 인테그린 결합 펩티드와 로머 솔루션을 혼합하고, 빛에 노출시 캡슐화됩니다. 겔 형성시에 과잉의 티올기를 함유하는 (D) 겔 (여기서, 2 mM의 과량의 티올 형성 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP가) 즉 단일 ALLOC 기 (Pep1Alloc로 기능화 펩티드의 후속 첨가하여 생화학 큐 패터닝 될 수 있고, RGDS, IKVAV 등)에 세포 부착을 촉진하기겔의 특정 지역 내에서. 여기, 형광 표지 RGDS와 젤의 패턴이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> 그림 2. 엘만 (Ellman) 정량 분석법 설정 및 결과 패턴 하이드로 겔의 변형을 평가 (A) 겔 및 시스테인 표준은 엘만 (Ellman) 시약과 함께 48 웰 플레이트에서 배양 하였다. 선형 표준 곡선이 겔 샘플에서 시스테인 농도를 결정하기 위해 도시된다. II = 5 분 중합; III = 30 분 배양 Pep1Alloc와 (B) 초과 무료 티올은 펜던트 ALLOC 펩타이드 (I = 1 분 중합와 패턴에 따라 겔 형성하는 동안 하이드로 겔 내에서 통합되어 소비 IV = 90 분 배양 위스콘신<html> 제 Pep1Alloc; III 및 IV 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> 도 3. 엘만 (Ellman) 분석 및 형광 이미지 photopatterned 하이드로 겔을 시각화 (A) 엘만 (Ellman) 시약을 신속 X-의 패턴 (라인) 및 Y 평면 (황색 = 비 패턴 영역 눈금 막대 = 1mm)을 탐지하는데 이용 될 수있다. (B) 형광 펩티드 Y 축, X 축에 패턴을 관찰하기 위해 사용될 수있다, Z 평면 (녹색 패턴 영역 = 200 ㎛의 스케일 바, 10X 물 침지 목적, 예 / 엠 525분의 488 ㎚).large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . 그림 4 : 생존 및 비 분해성 photopatterned 하이드로 겔 내에서 세포의 신진 대사 활동 (A) 예 촛점 Z - 스택 (Z 프로젝션, 10 배 물 침지 목적) 실행 가능한 (녹색, 예 / 엠 525분의 488 ㎚) 및 죽은 중배엽 줄기 세포 (빨강, 예 / 엠 580분의 543 nm의)는 하이드로 겔 내에서 캡슐화 24 시간 후 캡슐화 (스케일 바 = 200 μm의). 육일 캡슐화 (삽입 이미지, 스케일 바 = 50 μm의) 후 이러한 하이드로 겔 내에서 확산 세포. (; II = 5 분 중합 I = 1 분 중합) 및 패터닝 조건 (III = Pep1Alloc 30 분 배양 (B) 세포는 1 3 일 (각각 어둠과 빛 바,) 다양한 중합 후 캡슐화는 대사 활성 ; IV = 90 분 incubatioN Pep1Alloc와; 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> 표 1 : 예 설정이 하이드로 겔을 만들기위한 재고 솔루션의 볼륨을 계산하는 파란색 강조 스프레드 시트 내에서 셀 사용자 정의 매개 변수를 표시하는 단계;. 다른 수량은 이러한 설정을 기반으로 계산됩니다. 겔을 만들기 위해 각각의 원액에 대한 최종 볼륨이 주황색으로 강조 표시됩니다. 백혈구는 사용자 정의 파라미터들에 기초하여 최종 부피를 계산하는 데 사용되는 화학식을 포함한다. 2.2 MM의 LAP의 농도가 0.067 중량 %에 해당합니다.

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

이 절차의 전반적인 목표는 합성 고분자 기반의 세포외 기질 내에 세포를 형성, 패턴화 및 캡슐화하는 것입니다. 이 방법은 불균일한 미세 환경 내에서 세포 반응을 조절하는 세포외 신호를 식별하는 것과 관련된 중요한 생물학적 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 프로토콜과 접근 가능한 재료를 사용하여 세포 캡슐화 및 배양을 위한 견고한 합성 기질을 생성할 수 있다는 점입니다.이 방법은 제어된 세포 배양 및 인비트로(in vitro) 세포 반응 연구에 사용할 수 있습니다. 이는 약물 전달 및 조직 공학을 포함한 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하이드로겔 형성을 위한 재료를 준비하십시오.모든 샘플에 걸쳐 광강도가 비교적 균일하게 유지되도록 액체 충전 광도파로 끝에 콜리메이팅 렌즈를 부착하십시오. 분석 대상 샘플을 모두 덮을 수 있는 스폿 크기가 되도록 샘플과 광도파로 사이의 거리를 조절하십시오. 패턴이 없는 하이드로겔을 제작하려면, 멸균된 컷 시린지 팁에 겔 전구체 용액 10~20마이크로리터를 피펫팅하여 시린지 팁 내에 몰딩된 두꺼운 하이드로겔을 준비하십시오.부피와 시린지 직경을 기준으로 두께가 약 0.5에서 1.5 mm가 되도록 시린지당 하나의 겔을 만듭니다. 코팅되지 않은 유리 슬라이드 가장자리에 고무 가스켓을 배치하여 유리 슬라이드 몰드에 얇은 하이드로겔을 준비합니다. 다음으로, 겔 전구체 용액 5에서 10 µL를 코팅되지 않은 유리 슬라이드 위에 피펫으로 분주합니다.그리고 비접착 코팅이 된 유리 슬라이드를 겔 용액 위에 올립니다. 소형 바인더 클립으로 유리 슬라이드를 고정하여 안정화합니다. 시린지 팁 몰드 또는 유리 슬라이드 몰드의 경우, 겔 표면에서 10 mW/cm²의 강도가 되도록 램프 강도를 설정합니다.방사계(radiometer)를 사용하여 강도를 측정합니다. 그 후 몰드를 램프 아래에 배치합니다. 겔이 완전히 중합될 수 있도록 1~5분 동안 빛을 조사합니다.폴리에틸렌 글리콜 테레프탈레이트 함량이 높은 겔의 경우 중합 시간을 짧게 설정하십시오. 반면 함량이 낮은 겔은 중합 시간을 더 길게 설정하여 연조직 범위 내의 탄성 계수를 가진 완전 중합 하이드로겔을 제조하십시오. 시린지 팁 몰드에서 제작된 겔을 멸균된 비처리 48웰 플레이트에 옮기고, 유리 슬라이드는 멸균 접시에 배치하십시오.패턴화된 하이드로젤을 준비하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전구체 용액을 준비하고 솔루션이 고르게 혼합되도록 피펫으로 격렬하게 섞어줍니다. 그다음, 미리 형성된 젤을 리튬 인산 광개시제가 포함된 펜톤 펩타이드 용액으로 덮고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 과량의 용액을 제거합니다.겔을 시린지 팁에 성형한 경우, 스패튤라를 사용하여 48웰 플레이트에서 멸균된 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮겨 패턴을 형성합니다. 원하는 패턴이 그려진 포토마스크를 시린지 및 유리 슬라이드에 성형된 겔 위에 직접 배치합니다. 최적의 패턴 정밀도를 위해 마스크의 인쇄된 부분이 겔에 닿도록 하십시오.샘플을 램프 아래에 두고 1분 동안 조사합니다. 패턴 형성이 완료되면, 시린지로 성형한 겔을 멸균된 48-well 비세포배양 처리 플레이트에 옮깁니다. 유리 슬라이드에 부착되어 성형된 겔은 멸균 디시에 옮깁니다.계획된 실험에 따라 배양 배지 또는 적절한 완충액으로 15분 동안 3회 헹굽니다. 광패턴화된 하이드로젤 내 유리 티올(free thiol)의 검출 및 정량을 수행하려면, 먼저 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 용액을 준비하고 계산을 수행하십시오. 이전과 같이 패턴 형성을 위한 얇은 하이드로젤을 제작합니다.구체적으로, 과량의 유리 티올(free thiol)을 포함하는 겔을 제작하고, 투명한 커버 슬립을 사용하여 겔 전체에 빛을 완전히 노출시켜 이 샘플들의 절반을 펜톤 펩타이드(penton peptide)로 패턴화합니다. 패턴화된 겔과 패턴화되지 않은 겔을 48웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 말단 반응종이 겔 밖으로 확산되고 평형 팽창이 일어날 수 있도록 Ellman 반응 버퍼로 15분 동안 세 번 헹굽니다.세척된 겔에 Ellman's 반응 버퍼를 추가하여, 반응 버퍼를 포함한 팽창된 겔 부피가 20 µL의 배수가 되도록 합니다. 예를 들어, 예상되는 팽창된 겔 부피가 15 µL인 경우, 반응 버퍼 5 µL를 추가합니다. 또한 예상되는 팽창된 겔 부피가 30 µL인 경우, 반응 버퍼 10 µL를 추가합니다.시스틴 표준 용액을 48-웰 플레이트의 개별 웰에 20 µL의 배수로 피펫팅하십시오. 이는 이전 단계에서 사용된 부피에 따라 달라집니다. 예를 들어, 이전 단계의 팽윤된 겔 부피와 추가 반응 버퍼의 합계가 40 µL였다면, 각 표준 용액을 개별 빈 웰에 40 µL씩 첨가하십시오.다음으로 Ellman's 시약과 반응 완충액을 희석합니다. 표준물질과 시료가 들어 있는 웰에 희석된 Ellman's 시약을 첨가합니다. 20 µL 시료의 경우, 각 웰에 183.6 µL의 용액을 첨가하십시오.Ellman's 시약이 겔의 유리 티올과 반응하여 생성되는 yellow 2-Nitro-5-thiobenzoic dianion이 충분히 확산될 수 있도록, 육안으로 용액의 색상이 겔의 색상과 일치할 때까지 또는 1시간 30분 동안 배양하거나 쉐이커에 둡니다. 샘플과 표준 물질의 용액을 100 µL씩 취해 96-well 플레이트의 웰에 넣습니다. 플레이트 리더기를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정합니다.광패턴을 시각화하기 위해, 티슈로 하이드로겔의 가장자리를 조심스럽게 닦아내어 과량의 반응 버퍼를 제거합니다. 겔 표면에 Ellman's reagent를 직접 파이펫팅합니다. 즉시 10배율 광학 현미경 또는 컬러 카메라가 장착된 실체 현미경으로 이미지를 촬영합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수집하고 캡슐화를 위해 준비합니다. PBS를 흡입하여 제거한 직후, 펠렛화된 세포를 전구체 용액에 현탁하여 최종 농도가 µL당 5,000 cells가 되도록 합니다. 이후 penton 펩타이드와의 반응을 위해 적절한 농도의 유리 티올(free thiol)을 남겨둡니다.광패터닝(photo patterning)이 필요한 경우, 이전과 동일하게 하이드로겔을 성형, 중합 및 패터닝합니다. 패터닝 후에는 반응하지 않은 종과 과잉의 리튬 인산염 광개시제를 제거하기 위해 성장 배지로 10분씩 세 번 헹굽니다.원하는 분석 시점까지 37 °C, 5% CO2 조건의 배양액에서 겔을 배양합니다. 배양액은 48시간마다 또는 실험 응용 목적에 따라 결정된 주기에 맞춰 보충합니다. 캡슐화된 세포의 생존율을 측정하려면, 먼저 겔에서 배양액을 제거하고 PBS로 15분씩 3회 헹구어 겔 내의 배양액이 완전히 확산되어 제거되도록 합니다.해동된 2 mM ethidium homodimer-1 2 µL와 해동된 4 mM calcium AN 용액 0.5 µL를 1 mL의 멸균 PBS에 추가합니다. 완전히 섞이도록 볼텍싱합니다. 준비된 용액 300 µL를 48웰 플레이트의 각 시린지 몰드 겔에 추가하거나, 멸균 디쉬 내 유리 슬라이드 위의 겔 표면을 덮을 수 있을 만큼 충분한 양을 추가합니다.그리고 45분 동안 배양합니다. 남은 용액을 제거하고 겔에서 과잉 염료를 제거하기 위해 세척합니다. 공초점 현미경으로 세포를 이미지화합니다.또는 10x 배율, 488 nanometer 흥분파장 및 525 nanometer 방출파장 기능을 갖춘 형광 현미경에서 관찰합니다. Ellman's 시약으로 정량한 비패턴 및 패턴 하이드로겔의 유리 티올 농도를 분석한 결과, 1분 및 5분 동안 중합된 하이드로겔의 유리 티올 농도가 통계적으로 유사하게 나타났으며, 이는 1분 이내에 빠른 반응과 완전한 겔화가 이루어졌음을 나타냅니다.penton 펩타이드와 함께 30분 및 1시간 30분 동안 배양한 겔의 후속 벌크 패턴 형성 결과, 유리 티올 농도가 60%에서 80%까지 감소하여 과잉 티올이 효율적으로 변형되었음을 나타냈습니다. 선으로 인쇄된 마스크로 샘플을 덮고 빛을 조사하여 형성된 광 패턴은 Ellman 시약을 사용하여 2차원으로 관찰할 수 있습니다. 또는, 후속 이미징 단계에서 형광 펩타이드를 결합하여 3차원으로 관찰할 수 있습니다.하이드로젤 내에 캡슐화된 성인 인간 줄기세포를 생존력 및 하이드로독성 염색으로 처리하였습니다. 그리고 공초점 현미경으로 이미징하였습니다. 막 손상이 없는 생존 세포는 녹색으로 표지되었으며, 이는 캡슐화 하루 후의 세포 생존을 나타냅니다.세포는 캡슐화 6일 후 매트릭스 내에서 퍼지기 시작합니다. 삽입 이미지에서 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 오염 물질의 유입이나 기계적 전단력으로 인해 캡슐화 후 세포가 손상되는 것을 방지하기 위해 멸균 상태를 유지하고 세심하게 취급하는 것이 중요합니다.이 절차를 마친 후, 세포 외 환경에 반응하는 세포의 기능과 운명을 연구하기 위해 면역 염색 유세포 분석 및 유전자 발현 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 생물학, 바이오공학 및 의학 분야의 연구자들이 사용자 정의 특성 제어가 가능한 합성 세포 외 기질 내에서 조직 부위의 침식이나 질병 진행을 연구하여 새로운 치료 전략을 개발할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 세포를 캡슐화하고 제어된 세포 배양 연구를 위해 소프트 매트릭스를 패턴화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

고해상도 광 패터링 도구를 이용하여 세균 세포를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 것이 보고된다. 프로세스의 필수 실험 절차, 결과 및 이점을 검토합니다. 이 방법은 이질적인 지역 사회 또는 인구에서 희귀하거나 독특한 기능을 보여주는 표적 박테리아의 신속하고 저렴한 격리를 가능하게합니다.

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

배우세요 광매개 하이드로겔 형성 및 패터닝을 이용한 3D 세포 배양 기법. 이 방법은 세포 캡슐화와 조직 공학 연구에 활용할 수 있는 견고한 합성 매트릭스를 제공합니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

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