세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

이 절차의 전반적인 목표는 합성 고분자 기반 추가 세포 매트릭스 내에서 세포를 형성, 패턴 및 캡슐화하는 것입니다. 이 방법은 이질적인 미시 환경 내에서 세포 반응을 조절하는 추가 세포 신호의 식별과 관련된 중요한 생물학적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 프로토콜과 접근 가능한 재료를 사용하여 세포 캡슐화 및 배양을 위해 강력한 합성 매트릭스가 생성된다는 것입니다.

이 방법은 제어된 세포 배양 및 체외 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 약물 전달 및 조직 공학을 포함한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하이드로겔 형성을 위한 물질을 준비합니다.

액체로 채워진 light guide의 끝에 collimating lens를 부착하여 모든 샘플에서 비교적 균일한 광도를 보장합니다. 샘플에서 light guide까지의 거리를 조정하여 관심 있는 샘플을 커버할 스폿 크기를 얻을 수 있습니다. 패턴이 없는 하이드로겔을 만들려면 10-20마이크로리터의 겔 전구체 용액을 멸균 절단 주사기의 팁에 피펫팅하여 주사기 팁에 성형된 두꺼운 하이드로겔을 준비합니다.

주사기 당 하나의 젤을 만들어 부피와 주사기 직경에 따라 두께가 약 0.5-1.5mm가 되도록 합니다. 코팅되지 않은 유리 슬라이드의 가장자리 주위에 고무 개스킷을 배치하여 유리 슬라이드 몰드에 얇은 하이드로겔을 준비합니다. 다음으로, 5-10 마이크로리터의 겔 전구체 용액을 코팅되지 않은 유리 슬라이드에 피펫팅합니다.

그리고 젤 용액 위에 안티 접착제로 코팅된 유리 슬라이드를 놓습니다. 유리 슬라이드를 작은 바인더 클립으로 고정하여 안정화합니다. 실린지 팁 몰드 또는 유리 슬라이드 몰드의 젤 표면에서 제곱센티미터당 10밀리와트를 달성하도록 램프 강도를 설정합니다.

방사계를 사용하여 강도를 감지합니다. 그리고 램프 아래에 금형을 놓습니다. 겔이 완전히 중합될 수 있도록 1-5분 동안 빛을 가하십시오.

폴리에틸렌 글리콜 테레프탈레이트 함량이 더 높은 겔의 경우 더 짧은 중합 시간을 사용하십시오. 그리고 함량이 낮은 겔이 연조직 범위 내에서 탄성률을 가진 완전히 중합된 하이드로 겔을 생산하는 데 더 오랜 시간이 걸립니다. 주사기 팁 몰드의 젤을 처리되지 않은 멸균 48웰 플레이트에 넣고 유리 슬라이드를 멸균 접시에 넣습니다.

패턴화된 하이드로겔을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전구체 용액을 준비하고 용액이 균일하게 혼합될 수 있도록 용액을 세게 피펫팅합니다. 다음으로, 미리 형성된 겔을 펜톤 펩타이드로 덮고 인산 리튬 광개시제 용액에 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 여분의 용액을 제거하십시오.

주사기 팁에 겔이 성형된 경우 주걱을 사용하여 48웰 플레이트에서 패터닝을 위한 멸균 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 원하는 패턴의 포토 마스크를 주사기와 유리 슬라이드 성형 젤 위에 직접 놓습니다. 최적의 패턴 충실도를 위해 마스크의 인쇄된 부분이 젤에 닿도록 합니다.

샘플을 램프 아래에 놓고 1분 동안 방사합니다. 패터닝 후 주사기 성형 젤을 멸균 48웰 비조직 배양 처리 플레이트에 넣습니다. 유리 슬라이드에 부착된 유리 슬라이드 성형 젤을 멸균 접시에 넣습니다.

계획된 실험에 따라 배양 배지 또는 적절한 완충액으로 15분씩 총 3번 헹굽니다. 광패턴화된 하이드로겔에서 유리 티올의 검출 및 정량화를 준비하려면 먼저 용액을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 계산을 수행합니다. 이전과 같이 패터닝을 위해 얇은 하이드로겔을 형성합니다.

구체적으로, 과량의 유리 티올로 겔을 만들고 투명 커버 슬립을 사용하여 이러한 샘플의 절반을 펜톤 펩타이드로 패턴화하여 전체 겔을 빛으로 완전히 노출시킵니다. 패턴화된 겔과 패턴이 없는 겔을 48웰 플레이트의 웰에 놓습니다. Ellman의 반응 완충액으로 3회 15분 동안 헹구어 말단 반응 종의 확산이 겔 밖으로 확산되고 평형 팽창이 발생하도록 합니다.

린스 젤에 Ellman의 반응 완충액을 추가로 추가하여 반응 완충액과 함께 팽창한 젤 부피가 20마이크로리터의 배수가 되도록 합니다. 예를 들어, 예측된 팽창 겔 부피가 15마이크로리터인 경우 5마이크로리터의 반응 완충액을 추가합니다. 그리고 예측된 팽창 젤 부피가 30마이크로리터인 경우 10마이크로리터의 반응 완충액을 추가합니다.

sistine 표준물질을 20마이크로리터의 배수로 48웰 플레이트의 개별 웰에 피펫팅합니다. 이전 단계에서 사용된 볼륨에 따라 다릅니다. 예를 들어, 이전 단계에서 겔 부피가 부풀어 오르고 40마이크로리터와 동일한 추가 반응 버퍼가 있는 경우 각 표준물질의 40마이크로리터를 개별 빈 웰에 추가합니다.

다음으로, Ellman의 시약과 반응 완충액을 희석합니다. 희석된 Ellman's 시약을 표준물질과 샘플이 들어 있는 웰에 추가합니다. 20마이크로리터 샘플의 경우 각 웰에 183.6마이크로리터의 용액을 추가합니다.

시간 30분 동안 또는 용액의 색상이 육안 검사에 의한 겔의 색상과 일치할 때까지 배양하거나 셰이커에 올려 Ellman의 시약과 겔의 유리 티올의 반응 시 생성되는 노란색 2-니트로-5-티오벤조산 이안식의 충분한 확산을 보장합니다. 샘플과 표준물질에서 100마이크로리터의 용액을 취하여 96웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 플레이트 리더에서 405나노미터의 흡수성을 읽습니다.

사진 패턴을 시각화하려면 하이드로겔의 가장자리 주위를 티슈로 부드럽게 닦아 과도한 반응 완충액을 제거합니다. 피펫 Ellman의 시약을 젤 표면에 직접 놓습니다. 10x의 광학 현미경 또는 컬러 카메라가 있는 실체 현미경에서 즉시 이미지화할 수 있습니다.

세포를 수집하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 캡슐화를 위해 준비합니다. PBS를 흡인시킨 직후, 전구체 용액에 펠릿화된 세포를 마이크로리터당 5,000개의 최종 농도로 현탁시킵니다. 나중에 펜톤 펩타이드와 반응할 수 있도록 적절한 농도의 유리 티올을 남겨둡니다.

사진 패터닝이 필요한 경우. 이전과 같이 하이드로겔을 성형, 중합 및 패턴화합니다. 패터닝 후 성장 배지에서 10분 동안 3회 겔을 헹구어 미반응 종과 과도한 인산리튬 광개시제를 제거합니다.

추가 분석을 위해 원하는 시점까지 섭씨 37도, CO2 5%의 성장 배지에서 겔을 배양합니다. 48시간마다 또는 응용 프로그램에 따라 배지를 보충하십시오. 캡슐화된 세포 생존 능력을 측정하려면 먼저 겔에서 성장 배지를 제거하고 PBS로 15분 동안 3회 헹궈 겔에서 배지가 확산될 수 있도록 합니다.

마이크로리터의 해동된 2밀리몰 에티듐 호모디머-1과 0.5마이크로리터의 해동된 4밀리몰 칼슘 AN 용액을 1밀리리터의 멸균 PBS에 첨가합니다. 완전한 혼합을 보장하는 소용돌이. 48개의 웰 플레이트에 있는 각 주사기 몰드 젤에 300마이크로리터의 상립 용액을 추가하거나 멸균 접시의 유리 슬라이드에 있는 젤 표면을 덮을 수 있을 만큼 충분히 추가합니다.

그리고 45분 동안 배양합니다. 과도한 서있는 용액을 제거하고 헹구어 젤에서 과도한 염료를 제거합니다. 컨포칼 현미경에서 세포를 이미지화합니다.

또는 10x 기능을 갖춘 상피 형광 현미경에서. 그리고 488 나노 미터 여기 및 525 나노 미터 방출. Ellman's로 정량화한 패턴이 없는 하이드로겔과 패턴화된 하이드로겔의 유리 티올 농도는 초기에 1분 동안 중합체였던 하이드로겔과 5분 동안 통계적으로 유사한 유리 티올 농도를 가짐을 보여주었으며, 이는 빠른 반응과 1분 이내에 완전한 겔화를 나타냅니다.

펜톤 펩타이드로 30분 동안, 그리고 1시간 30분 동안 배양한 겔의 후속 벌크 패터닝은 유리 티올 농도가 60-80% 감소하여 과잉 티올의 효율적인 변형을 나타냅니다. 여기에 선으로 인쇄 된 마스크로 덮인 샘플을 통해 빛을 비추어 형성된 사진 패턴은 Ellman의 시약을 적용하여 2 차원으로 관찰 할 수 있습니다. 또는 후속 이미징에서 형광 펩타이드를 통합하여 3차원으로 촬영할 수 있습니다.

하이로겔 내에 캡슐화된 성체 인간 줄기세포는 생존력 및 수독성 염색으로 처리되었습니다. 그리고 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다. 멤브레인 손상이 없는 생존 가능한 세포는 녹색으로 표시되며 캡슐화 후 하루 후에 세포가 생존했음을 나타냅니다.

세포는 캡슐화 후 6일 후에 기질 내에서 퍼지기 시작합니다. 삽입 이미지에서 볼 수 있듯이. 이 절차를 시도하는 동안 오염 물질 또는 기계적 sheer의 도입을 통한 캡슐화 후 세포 손상을 방지하기 위해 멸균되고 신중한 취급 절차를 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 면역염색 유세포 분석 및 유전자 발현과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 세포 환경에 대한 반응으로 세포 기능과 운명을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 생물학, 생명공학 및 의학 분야의 연구자들이 사용자 정의 특성 제어를 통해 합성 세포 외 매트릭스의 조직 영역 침식 또는 질병 진행을 연구하고 새로운 치료 전략을 개발할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 통제된 세포 배양 연구를 위해 세포를 캡슐화하고 연성 매트릭스를 패턴화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.