Name: 레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 레이저 보조 세포질 미세주입 기술을 사용하여 가축 수정란에 유전자 가위 도구를 효율적으로 전달하는 방법을. 이 기술은 대형 동물의 유전자 기능 연구와 형질전환 동물 생산에 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.

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이 기술과 관련된 작업은 NIH/NICHD RO1 HD070044 및 USDA/NIFA Hatch 프로젝트 W-3171 및 W-2112에서 지원됩니다.

1. 마이크로 피펫 생산 <ol><li> 사출 마이크로 피펫 <ol><li> 보로 실리케이트 유리 모세관 (1.0 mm, 내경 (ID) : 외경 (OD) 0.75 mm) 배치 마이크로 피펫 풀러에서 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중심을)하고 잠급니다. </li><li> 그것은 긴 캐처 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하십시오. (예 : 열 : 825; 당겨 : 30; 속도 : 120; 시간 : 200; 압력 : 500). </li><li> 조심스럽게 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge에 놓습니다. </li><li> 인출 된 피펫과 초점에 그 유리 구슬과 microforge 히터 필라멘트를 가져옵니다. 원하는 두께를 측정하고 히터 필라멘트 대상 내경 (5 μm의)에 도달 할 때까지 수평으로 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다. </li><li> 약 45 %의 열을 조절하고 필라멘트에 닿을 수 있도록 부드럽게 아래로 피펫을 가지고. 잠시 히터를 활성화합니다. 이 w병 약간 필라멘트에 접착되도록 피펫을 용융 및 냉각시에, 피펫 직선 절단을 생성하는 접촉 지점에서 중단된다. 참고 : 너무 높은 온도가 피펫 벤드를 만들 것입니다 따라서 직선 절단 할 수 없습니다 너무 낮은 온도가 피펫 (그림 1A)를 용융하기에 충분하지 않을 것이기 때문에 적절한 온도를 설정하면이 단계의 핵심이다. </li><li> 히터 필라멘트에서 약 10 μm의 멀리 위치하여 피펫 팁 근처 대략 30 ° 각도를 확인합니다. 60 %의 온도를 상기 히터를 작동. 참고 :이 필라멘트를 통해 피펫을 구부 것입니다. 이 각도는 인젝터 (도 1b)에 장착 될 때 바늘의 선단이 주입 판 표면에 평행하도록 요구된다. </li><li> 그들은 매우 선명하고 깨지기 쉬운만큼주의를 미세 주입 피펫을 처리합니다. </li></ol></li><li> 개최 마이크로 피펫 <ol><li> borosilic 배치(: 1.0 mm, ID : OD 0.75 mm) 유리 모세관 먹었다 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중앙에) 마이크로 피펫 풀러의를하고 잠급니다. </li><li> 이 긴 경우에도 테이퍼 및 병렬 벽 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하여 (: 열 : 예 815; 당겨 : 20; 속도를 : 140; 시간 : 175; 압력 : 200). </li><li> 조심스럽게 끌어 당기는 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge 홀더에 놓습니다. 히터 필라멘트 및 피펫에 초점을 조정합니다. </li><li> 피펫 직경을 측정하고 필라멘트를 통해 직경 180 μm의에 도달 할 때까지 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다. </li><li> 지정된 크기에서, 다이아몬드 팁 펜으로 유리 모세관을 표시 한 다음 부드럽게 유리를 깰 수있는 뽑아 끝에 누릅니다. 이 직선 절단 (그림 1C)가 발생한다. </li><li> 필라멘트에 가까운 그것의 끝이 수직 위치로 피펫을 이동합니다. 온도를 설정<html> 60 %에 microforge의. </li><li> 화재 폴란드어는 40 μm의의 ID에 도달 할 때까지 표준 기술 7을 사용 피펫의 팁. 아이디 (그림 1D)를 확인하기 위해 접안 레티클을 사용합니다. </li><li> 피펫에 각도를 확인합니다. <ol><li> 약 10 μm의 거리에 필라멘트와 거리의 끝에서 5mm에서 다시 수평 위치로 피펫을 가져옵니다. 약 60 %로 온도를 설정하고 필라멘트를 통해 피펫이 구부러 히터를 활성화합니다. (30 O의) 소정의 각도에 도달 할 때까지 가열을 계속한다. 각도 시각 (그림 1E)에서 확인하십시오. 주 : 피펫은 일반적으로 사출 접시의 바닥에 대해 60 (O)의 대략적인 각도에서 마이크로 인젝터에 장착된다. 그것의 중간 평면에서 배아의 정확한 주입에 필요한 접시의 바닥에 평행하도록 피펫의 선단은 절곡되어있다. </li></ol></li></ol></li></ol>제작 &quot;&gt; 2. 미세 조작기 설치 <ol><li> microinjectors가 완전히 기름을 적재되는 시스템에 기포가 없는지합니다 (마이크로 인젝터에 기포가 주입의 미세 제어를 방지) 확인합니다. </li><li> 미세 조작기는 중앙 위치에 있는지 확인하십시오. 이는 피펫의 이동의 넓은 범위를 허용한다. </li><li> 왼쪽 micromanipulator에 홀더에 들고 피펫 오른쪽 미세 조작 홀더에 주입 피펫을 삽입합니다. </li><li> 오일이 모세관 현상에 의해 피펫에 입력하고 시스템이 마이크로 인젝터 컨트롤을 사용하여 피펫 내부 위아래로 오일을 이동하여 제대로 작동하는지 확인할 수 있습니다. 주 : 바늘의 내부에는 오일의 움직임이없는 경우, 막힘이있을 수도있다. 이 경우, 새로운 니들을 사용한다. </li><li> 보기의 현미경의 필드의 중심에 피펫을 가지고하는 미세 조작기 컨트롤을 사용합니다. 4 배의 배율을 사용하여 마이크로 피펫 팁 (올바른 각도로 페이지 있는지 확인접시의 바닥)에 arallel. 참고 : 바늘의 올바른 설치가 성공적으로 주입 및 결과의 일관성을 위해 중요하다. </li><li> 제조자의 설명서 교정 다음 레이저 시스템 교정. </li></ol> 사출 접시 3. 준비 (그림 2) <ol><li> 100mm의 페트리 접시 뚜껑의 중앙에 20 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 가온 (37 ° C) SOF-HEPES (재료 부분에 자세히 조성물)의 50 μL를 떨어 놓는다. 용액 2 μL 드롭 주입 드롭에 가까운 주입 할 - 1이 놓습니다. 배아는 RT 이하로 냉각하지 않았는지 확인합니다. 참고 :이 프로토콜에서 우리는 주사 부위를 시각화하고 나중에 추적 할 수 있도록 주입 용액에 덱스 트란 - 붉은 염료를 추가합니다. </li><li> 미네랄 오일을 약 10 ㎖을 사용하여 사출 접시 방울 커버. </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 주입 접시를 놓고 주사위를 가지고분사 방울로 ettes. 바늘 드롭 내부에 초점이 있는지 확인합니다. micromanipulator에 컨트롤을 사용하여 필요에 따라 자신의 높이를 조정합니다. </li><li> 사출 강하의 상측 - (20 시간 후 수정 (HPF) (17)) 30 접합자 - 마이크로 디스펜서를 사용하여 약 20로드. 사출 강하 배아의 개수가 사람을 주입 할 수있는 속도에 의해 결정되도록 상온에서 주입을 수행한다. 30 분에 주입 할 수있는 것보다 더 많은 배아를 넣지 마십시오. <ol><li> 마이크로 디스펜서에 배아를로드하려면 완전히 플런저를 우울하게하고 배아를 포함하는 용액에 끝을 담가. 터치 배아 유리 모세관의 선단 (시 하나)로 촬상 천천히 플런저 각각의 배아 모세관 체결 해제된다. 모든 배아가 선택됩니다 또는 마이크로 디스펜서의 용량이 가득 찰 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> ,로드 된 배아를 해제 전체 볼륨의 공동 때까지 부드럽게 플런저를 우울하게하려면배아를 ntaining하는 모세관에서 해제된다. </li></ol></li></ol> 4. 미세 주입 <ol><li> 4 배의 대물 렌즈를 사용하여 부압 (흡인)을인가하여 주입 피펫으로 주입 할 수있는 용액을로드. 3 접합자 - 2를 주입 할 수있는 충분한 솔루션을로드합니다. 그런 다음 주입 드롭으로 이동합니다. </li><li> 끝이 접합체에 가까운 얻을 수 있도록 주입 드롭 내에서 유지 피펫을 이동합니다. 수정란은 20 배 목표로 유지 피펫과 변화에 고정되는 있도록 유지 마이크로 인젝터와 부압 (흡인)을 적용합니다. </li><li> 수정란이 유지 피펫에 부착되면, 조심스럽게 분리하지 않고 주위의 배아를 이동 주입 피펫을 사용하여 품질을 확인합니다. 좋은 품질의 접합자는 두 극성 몸이 (하나만 볼 가끔 있지만)과 균일 한 세포질한다. 이상 접합자 (그림 3A)를 주입하지 마십시오. </li><li> 필요한 경우, 적절한 주입 배아 재배치위치. 좋은 위치 결정되는 ZP와 PM 사이에 약간의 공간이 때문에 PM이 레이저에 의해 손상되지 않는다는 것이다. </li><li> 주입 피펫은 부드럽게 주사 부위의 접합자를 터치하여 배아의 중간면에 위치되어 있는지 확인합니다. 그것의 중간면에없는 경우, 바늘 배아 대신 천자 회전하게하는 경향이있다. 필요에 따라 주입 피펫의 높이를 조정한다. </li><li> 레이저 (그림 3B)를 사용하여 ZP에 구멍을 만듭니다. <ol><li> 레이저의 소프트웨어 놓고 구멍 (배아가 유지 피펫에 부착되는 곳의 반대측에) 될 것이다 ZP되는 레이저 레티클 사용. 화재 버튼 레이저 제어 창 클릭을 사용. 구멍의 크기가 PM에 손상을주지 않고 통과 바늘 용 ZP에 개구를 생성하기에 충분히 큰지 확인 (예 : 0.662 msec의 펄스 폭 / 6.9 ㎛의 구멍 크기). </li></ol></li><li> 주사 바늘을 통과상기 ZP 구멍을 통해 PM과의 접촉을 만든다. 바늘이 배아 (그림 3C)에 방법의 ¾ 때까지 앞으로 피펫을 눌러 계속합니다. </li><li> 이것이 일관 주입량을 제어 할 수있는 바와 같이, 솔루션 오일 계면에서의 메 니스 커스의 위치를 ​​관찰한다. </li><li> PM과 세포질이 주사 바늘로 흡입 할 것을 발생합니다 주입 피펫에 부압 (흡인)을 적용합니다. 바늘로 세포질의 움직임이 가속 될 때까지 또는 주사 용액과 함께 혼합 세포질 함량을 알 수있는 경우에 계속. 다음은 PM (그림 3D)의 파손을 나타냅니다. </li><li> 용액 유 계면에서의 메 니스 커스가 시작점 과거 1 접합체의 직경에 상당하는 고급까지 양압 (주입)을인가하여 접합체의 세포질 내로 용액 다음 세포질 콘텐츠를 주입한다. 참고 : 우리의 조건이 파트 :변위량 주입 솔루션 (그림 3E)의 약 7 와줘. </li><li> 4 배 목표로 변경하고 주입 드롭의 하부에 주입 된 배아 / s로 이동합니다. 유지 마이크로 인젝터에 양압을 적용하여 배아를 놓습니다. 분사 / 비 - 주입 된 배아를 추적하고 효율적으로 작업 할 수 있도록 상측의 비 주입 배아 드롭의 하측에 삽입 된 것들을 유지한다. </li></ol> 5. 배아 복구 및 사출 결과 <ol><li> 미리 예열 SOF-HEPES로 새로운 접시에 약 200 ㎕를 3 방울을 확인합니다. 마이크로 디스펜서 (위의 설명 참조)를 사용하여 주입 된 배아를 수집합니다. 3 SOF-HEPES를 통해 방울을 이동하여 주입 된 배아를 씻으십시오. </li><li> 미세 주입 중에 용해 배아를 계산하고이를 폐기합니다. 첫 번째 전체 ZP을 작성, 반투명 나타납니다 보낸 용해 접합자는 그대로 하나 쉽게 구별 할 수 있으며, 일반적으로 세포질을 가지고 참고 :배아의 외부로 누출되는 콘텐츠. </li><li> 선택적으로, 형광 현미경을 이용하여 미세 주입 효율을 확인합니다. 자외선 노출이 후속 개발에 영향을 미칠 수있는 배아의 손상을 유도 할 수 있음을 유의하십시오. </li><li> 38.5 ℃에서의 미네랄 오일 아래 4 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충 칼륨 단면 최적화 배지 50㎕의 방울 (KSOM) 25 주입 배아 배양 기, 포화 5 % 공기 중의 CO 2, 습도. </li><li> 이일 주사 후 5 % FBS와 문화 매체를 보충합니다. </li><li> 주사 후 배반포 (BL) 요금 7 일을 확인합니다. 배반포 배아 / 그 드롭 배양 된 배아의 총 수의 총 수와 BL 속도를 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

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접합체의 미세 주입은 포유 동물의 배아에 솔루션을 도입하기위한 잘 정립 된 방법이다. 종 및 실험 목적에 따라 일부 변형이 기술은 광범위하게 사용될 수있다. 우리는 평활 말단 마이크로 피펫의 입구를 돕기 위해 레이저를 사용하여 세포질 마이크로 인젝션을 수행하는 방법을 보여준다. (예 : 소, 양, 돼지 등) 일부 가축 종의 접합자는 배아의 내부에 한 번 주입 피펫의 시각화를 방해, 어두운 세포질을 가지고있다. 또한, 자신의 세포막이 매우 신축성있는 달성하기 어렵다 (주로 설치류의 접합체를 주입하는 데 사용)를 경사 아군 바늘 그들의 침투하기. 이러한 한계를 극복하기 위해, 세포막 및 배아의 세포질 내부 용액의 방출이 파손되도록하여 투명대 세포질 콘텐츠의 후속 흡입 통해 평활 말단 바늘의 통과를 가능하게하는 레이저를 사용했다. 또한, injecti에 의해바늘 입구의 반대 사이트에서 NG (약 3/4 배아 내부) 우리는 PN을 대체함으로써 자신의 흡입 / 주입을 방지하는 것을 목표로하고 있습니다. 또한,이 이렇게 낮은 용해 속도의...

1 셀 배아의 세포질 미세 주입은 매우 강력한 기술이다. 또, 예를 들면, 유전자 기능을 연구 나 유전자 편집 동물을 생성하는 유전자가 녹아웃을 제조 배아에 어떤 솔루션을 제공에 사용될 수있다. 대부분의 농업 관련 농장 동물 접합자는 세포질이 불투명 한 어두운 만드는 매우 높은 지방산 조성. 또한 상당히 탄성 원형질막 (PM)을 갖는다. 이러한 특성은 설치류 종의 도전과 종종 부정확에 사용되는 기존의 전핵 / 세포질 주입을 사용하여 미세 주입을합니다. 이를 수행하기가 쉽습니다 또한 더 높은 생존 능력이 결과, 주입 된 배아에 덜 손상이 발생하기 때문에 세포질 마이크로 인젝션은 전핵 미세 주입을 통해 이점이있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 농장 동물 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하기위한 성공적인 방법을 설명하는 것입니다. 수행 할 수 있어야합니다가축 배아 고효율 세포질 마이크로 인젝션은 레이저는 평활 말단 유리 바늘이 미세 주입에 사용되는 투명대 (ZP) 다음에 구멍을 생성하는데 사용된다. 이 전략은 주입하는 동안 배아에 각인 기계적인 손상을 감소하는 것을 목표로하고있다. 그리고, 주사 바늘 내부 세포질 콘텐츠 흡인 용액 배아의 세포질 내로 전달되는 것을 보장 PM 효율적 자신감 파괴 할 수있다. 이 기술은 이미 성공적 접합체 세포질 3,4-으로 siRNA를 전달하고 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) / CRISPR 연관된 시스템 (9) (Cas9) 시스템 (5)을 사용하여 돌연변이를 생성 소 태아에서 사용되어왔다. 또한 소 운 동봉 된 난 모세포 (6)를 주입하기 (약간의 수정과)에 적합하다. 여기서, 우리는 우리의 염료를 제공 주입 프로토콜을 설명하는 데 어떤 주입에 적용 할 수있다수정란 내로 IRED 용액 및이 기술을 사용하여 최소한의 용해가 발생 초기 배아 발달에 영향을주지 않는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Sutter 기기</td><td>B100-75-10</td><td>이 모세관은 피펫을 만들고 고정하고 주입하는 데 사용됩니다. 필라멘트가 없는 두꺼운/표준 벽 붕규산 튜빙을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>10X 배율 렌즈 탑재.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>4X, 20X 렌즈 및 레이저 시스템 장착.</td></tr><tr><td>레이저</td><td>연구 기기</td><td>7-47-500</td><td>토성 5 활성 레이저.</td></tr><tr><td>마이크로 디스펜서</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>마이크로 디스펜서는 배아를 이동하는 데 사용됩니다. p10 피펫도 사용할 수 있지만 가능한 한 최소한의 부피로 적재할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>100 x 15mm 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>접시의 뚜껑을 사용하여 주입판을 만들 수 있습니다. 60mm 배양 접시의 뚜껑도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>35mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>이 접시는 50 &mu의 배아를 배양하는 데 사용됩니다. l 미네랄 오일로 덮인 방울. 또는 4웰 접시를 사용할 수도 있습니다. 배아를 배양하기 위해 선택한 요리에 관계없이, 배아를 배아로 이식하기 전에 항상 최소 4시간 동안 인큐베이터에서 평형을 이루어야 합니다.</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>38.5 &deg로 설정할 수 있는 모든 인큐베이터; C, 5% CO2 조건을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>배양 방울 및 세척 중에 배아를 시각화하는 데 사용됩니다. 10X 배율의 모든 실체 현미경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>제어 장치 HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>실체현미경에 부착된 가열 시스템.</td></tr><tr><td>가열식 현미경 스테이지</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>실체현미경에 부착된 가열 시스템.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>멸균 10mg/ml 용액을 사용하여 주입합니다.</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마</td><td>M8410</td><td>미네랄 오일을 실온에 보관하고&nbsp; 호일 종이를 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>BSA 4mg/ml 함유. 배아 배양을 위한 KSOM 플레이트는 사용하기 최소 4시간 전에 인큐베이터에서 평형을 이루어야 합니다.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>줄기세포 자격을 갖춘 FBS를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>접합</td><td></td><td></td>자: <td>접합자는 17 - 20 hpf 주사되며 in-vitro 또는 in-vivo 유래할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S5886</td><td>최종 농도 : 107.7 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P5405</td><td>최종 농도: 7.16 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>최종 농도: 1.19 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>시그마</td><td>M2393</td><td>최종 농도: 0.49 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>나트륨 DL- 젖산</td><td>나트륨 시그마</td><td>L4263</td><td>최종 농도 : 5.3 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C7902</td><td>최종 농도: 1.71 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>D-(&빼기;)-과당&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>최종 농도: 0.5 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>헤페스&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td>최종 농도: 21 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>시그마</td><td>M7145</td><td>최종 농도 : 1x. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>시그마</td><td>B6766</td><td>최종 농도 : 1x. SOF-HEPES 배지의 구성 요소.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>최종 농도: 4mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>시그마</td><td>P4562</td><td>최종 농도 : 0.33 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>최종 농도 : 1 mM. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A-3311</td><td>최종 농도 : 1 mg / ml. SOF-HEPES 배지의 구성 요소.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>최종 농도 : 5 &mu; g/ml입니다. SOF-HEPES 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>배아 이식을 위한 물</td><td>시그마</td><td>W1503</td><td>SOF-HEPES 배지의 구성 요소.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES 매체</td><td>실험실</td><td></td>에서 제작 <td>pH 7.3 - 7.4, 280 &plusmn; 10 mOs. 22 &mu를 통해 살균 된 필터; M 필터는 4 &deg에서 냉장고에 보관할 수 있습니다. C를 1개월 동안 복용합니다. 37 &deg에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.</td></tr></tbody></table>

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

단세포 배아로의 세포질 미세주입은 매우 강력한 기술입니다. 예를 들어, 성체 유기체의 모든 세포에 존재할 유전자 변형을 생성할 수 있는 게놈 편집 도구를 제공할 수 있습니다. 또한 siRNA, mRNA 또는 차단 항체를 전달하여 착상 전 배아의 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 설치류에 사용되는 배아를 미세주입하는 기존의 기술은 배아로 진행될 때 원형질막을 직접 관통하는 매우 얇은 마이크로피펫으로 구성됩니다. 이 기술을 가축 동물에 적용하면 일반적으로 효율성이 떨어집니다. 이는 주로 생쥐 및 쥐와 달리 소, 양 및 돼지 접합자는 매우 어두운 세포질과 매우 탄력적인 원형질막을 가지고 있어 원형질막의 주입 및 침투 시 시각화를 달성하기 어렵기 때문입니다. 이 프로토콜에서는 양과 돼지 배아에도 성공적인 것으로 입증된 소 접합자의 세포질로 용액을 전달하기 위한 적절한 미세주입 방법을 설명합니다. 먼저 레이저를 사용하여 투명대에 구멍을 만듭니다. 그런 다음 뭉툭한 끝의 유리 마이크로피펫을 구멍을 통해 삽입하고 바늘 끝이 배아 안으로 약 3/4에 도달할 때까지 전진시킵니다. 그런 다음, 원형질막은 바늘 내부의 세포질 함량 흡인에 의해 파괴됩니다. 마지막으로, 흡인된 세포질 함량과 관심 용액을 배아 세포질에 다시 주입합니다. 이 프로토콜은 100% 효율, 최소 용해 및 정상적인 배반포 발달 속도로 소 및 양 접합자에 다양한 용액을 전달하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

레이저를 이용한 세포질 미세 주입은 가축 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하는 강력하고 신뢰할 수있는 프로토콜입니다. 3 전 및 사출뿐만 아니라 기술의 전반적인 개요 후 접합자의 일반적인 개요를 보여줍니다. 덱스 트란 레드 주입 및 주입 효율 및 정확도를 추적 사이트 있도록 주입 용액으로서 사용된다. 용액의 성공적인 전송은 염료가 균일 세포질에 분포되어있는 최근 주입 배아를 나타내는도 4에 도시되어있다. 배아의 100 %가 세포질 주입이 기술을 사용. 이 프로토콜은 소 및 양의 접합자 최소한의 용해 속도를 가지고 설명했다. 전용 15.6 ± 5 주입 배아 5.8 ± 3.9 %로 마이크로 인젝션 한 결과, 각각 소와 양에 용해시켰다 <str옹&gt; (그림 5). <stro...

이 프로토콜은 농장 동물 접합자에서 세포질 미세주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 녹아웃 동물을 생성하기 위한 게놈 편집 도구와 같은 단일 세포 배아에 모든 솔루션을 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

이 절차의 전반적인 목표는 레이저의 도움을 받아 둔단 바늘(blunt-end needle)을 사용하여 가축 접합자의 세포질 내로 용액을 효과적으로 전달하는 것입니다. 이 방법은 연구 및 동물 형질전환 분야에서 사용되며, CRISPR Cas9 시스템과 같은 게놈 편집 도구와 결합하여 유전자 기능을 연구하기 위한 새로운 소나 형질전환 동물을 매우 간단하고 신뢰할 수 있는 방식으로 생성할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대동물 접합자의 세포질 내로 어떠한 용액이든 전달하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.숙련된 작업자의 주입 효율은 동물 간의 로모틸(lomotil) 수치를 최소화합니다. 먼저, 붕규산 유리 모세관을 마이크로피펫 풀러(micropipette puller)에 넣고 고정하여 주입용 마이크로피펫을 준비합니다. 적절한 프로그램을 사용하여 모세관을 당겨, 테이퍼(taper)가 길고 팁이 얇게 형성되도록 합니다.그런 다음, 장치에서 뽑아낸 피펫을 조심스럽게 제거하여 마이크로포지 위에 수평으로 놓습니다. 뽑아낸 피펫과 유리 비드가 달린 마이크로포지 가열 필라멘트의 초점을 맞춥니다. 접안렌즈 레티클을 사용하여 원하는 두께를 측정하고, 가열 필라멘트가 목표 내경인 5 µm에 도달할 때까지 피펫을 수평으로 이동시킵니다.열량을 약 45%로 조절하고 피펫을 천천히 내려 필라멘트에 닿게 합니다. 그런 다음 히터를 짧게 작동시킵니다. 이렇게 하면 피펫이 약간 녹으면서 필라멘트에 부착되며, 냉각 시 접촉 지점에서 피펫이 끊어지면서 직선 절단면이 생성됩니다.이 단계에서는 적절한 온도를 설정하는 것이 핵심입니다. 온도가 너무 높으면 피펫이 휘어지며, 온도가 너무 낮으면 피펫을 절단하기에 충분하지 않습니다. 다음으로, 피펫 팁을 히터 필라멘트에서 약 10 µm 떨어진 곳에 위치시켜 팁 근처에 약 30도 각도를 형성하십시오.온도를 60%로 설정하고 가열기를 활성화하여 피펫이 필라멘트 위로 원하는 각도만큼 굽어지게 합니다. 여기에 표시된 설정을 사용하여, 길고 고른 테이퍼와 평행한 벽면을 가진 얇은 팁의 마이크로 피펫이 되도록 유리 모세관을 당깁니다. 당겨진 피펫을 당김 장치에서 조심스럽게 꺼내 마이크로포지 홀더에 수평으로 배치합니다.접안렌즈 레티클을 사용하여 피펫 직경을 측정하고, 필라멘트 위의 직경이 180 micrometers에 도달할 때까지 피펫을 이동시킵니다. 다이아몬드 팁 펜으로 유리 모세관에 표시한 다음, 당겨진 팁 부분을 살짝 눌러 유리를 절단합니다. 이렇게 하면 직선으로 절단됩니다.다음으로, 피펫 팁이 필라멘트에 가깝게 위치하도록 피펫을 수직 방향으로 이동시킵니다. 마이크로포지의 온도를 60%로 설정하고, 표준 기술을 사용하여 피펫의 내부 직경이 목표 크기에 도달할 때까지 팁을 화염 연마(fire-polish)합니다. 피펫의 내부 직경을 측정하며, 이때 직경은 40 µm가 되어야 합니다.이전과 동일한 절차를 사용하여 팁을 30도 각도로 구부립니다. 홀딩 피펫을 왼쪽 마이크로 조작기 홀더에, 주입 피펫을 오른쪽 마이크로 조작기 홀더에 삽입합니다. 그런 다음, 주입 피펫을 오일로 채웁니다.마이크로 조작기 컨트롤을 사용하여 피펫을 현미경 시야의 중심으로 이동시킵니다. 4배율 배율에서 마이크로 피펫 팁이 배양 접시 바닥과 평행하도록 적절한 각도로 위치해 있는지 확인합니다. 20% FBS가 첨가된 37 °C SOF-HEPES 용액 50 µL 방울을 100 mm 페트리 접시 뚜껑의 중앙에 떨어뜨립니다.그 다음, 주입할 용액 1~2 µL 한 방울을 주입 방울 가까이에 놓습니다. 이어서, 약 10 mL의 미네랄 오일을 사용하여 방울들과 주입 플레이트를 덮습니다. 플레이트를 현미경 스테이지 위에 올리고 마이크로디스펜서를 사용하여 약 20~30개의 접합자를 주입 방울의 위쪽에 로딩합니다.4X 대물렌즈를 사용하여 마이크로인젝터로 음압을 가해 주입할 용액을 주입 피펫에 충전합니다. 수정란 2~3개를 주입하기에 충분한 양의 용액을 충전한 다음 주입 방울로 이동합니다. 주입 방울 내에서 홀딩 피펫을 이동시켜 팁이 수정란에 가까워지게 합니다.홀딩 마이크로인젝터로 음압을 가해 접합자가 홀딩 피펫에 고정되도록 합니다. 접합자가 안정적으로 고정되면 20X 대물렌즈로 변경하십시오. 주입 피펫을 접합자의 주입 부위에 살짝 접촉시켜, 피펫이 배아의 중앙 평면에 위치해 있는지 확인합니다.바늘이 중간 평면에 위치하지 않으면, 배아를 천자하는 대신 회전시키는 경향이 있습니다. 다음으로, 소프트웨어를 사용하여 구멍을 낼 투명대에 레이저를 수직으로 배치하십시오. 올바르게 위치가 잡혔다면, 레이저 제어 창에서 FIRE 버튼을 클릭하십시오.바늘이 세포막을 손상시키지 않고 통과할 수 있도록 투명대(zona pellucida)에 충분한 크기의 구멍이 형성되었는지 확인하십시오. 주사 바늘을 투명대의 구멍을 통해 통과시켜 세포막에 접촉시킵니다. 바늘이 배아의 3/4 정도 들어갈 때까지 피펫을 계속해서 앞으로 밉니다.용액-오일 계면에서 메니스커스의 위치를 관찰하십시오. 이는 주입 부피를 일정하게 제어하는 데 사용됩니다. 주입 피펫에 음압을 가하여 세포막과 세포질을 주입 바늘 속으로 흡입하십시오.바늘 내의 세포질 이동이 가속화되거나, 주입액과 섞인 세포질 내용물이 보일 때까지 계속합니다. 이는 세포막이 파열되었음을 나타냅니다. 용액-오일 계면의 메니스커스가 시작 지점에서 수정란 지름의 1배만큼 전진할 때까지 양압을 가하여, 세포질 내용물에 이어 용액을 수정란의 세포질 내로 다시 주입합니다.그런 다음, 4X 대물렌즈로 변경하고 주입된 배아를 주입 방울의 아래쪽으로 이동시킵니다. 홀딩 마이크로 인젝터에 양압을 가하여 배아를 방출합니다. 마이크로 디스펜서를 사용하여 주입된 배아들을 수집합니다.동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 주입된 배아를 세 방울의 SOF-HEPES로 옮겨 세척한 후 배양합니다. 용액의 성공적인 전달은 형광 이미지에서 확인할 수 있으며, 여기서는 주입 부위, 주입 효율 및 정확도를 추적하기 위해 dexion red를 사용하였습니다. 이 이미지에서 염료가 세포질에 균일하게 분포되어 있는데, 이는 본 기술을 사용할 때 나타나는 전형적인 모습입니다.이 프로토콜은 소 및 양의 접합자에서 최소한의 용해율을 보입니다. 미세주입의 결과로 용해된 소 또는 양의 주입 배아는 거의 없었습니다. 또한, 소와 양의 배아 모두에서 대조군과 주입군 간의 배반포 발달률에 통계적으로 유의미한 차이는 없었습니다.이 기술을 숙달하면 분당 2개의 배아를 처리하는 속도로 수행할 수 있습니다. 숙련된 작업자의 주입 효율은 동물 배반포 형성률을 최적화합니다. 이 영상을 시청한 후에는 가축 수정란에서 레이저 보조 세포질 내 미세주입을 수행하는 방법을 이해하게 될 것입니다.또한 효율적인 전달을 위해 양성 및 음성 흡입 압력을 사용하여 형질막의 파열을 보장하는 방법입니다.

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Research

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JoVE Journal

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