소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

이 작업의 전반적인 목표는 단일 분자 형광 국소화 현미경을 사용하여 세포 원형질막에서 Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate의 나노 분포를 방출하는 것입니다. 이 방법은 포스포이노시티드 신호전달에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 세포막의 신호 복합체 아래에 있는 포스포이노시티드의 나노 규모 조직은 무엇입니까?

이 기술의 주요 장점은 높은 공간 해상도와 인지질 형태학 연구의 주요 관심사인 세제 처리를 우회한다는 것입니다. 이 방법에는 세 가지 주요 단계가 포함됩니다. 1단계: 살아있는 세포에서 원형질막 시트 준비.

2단계: Phosphoinositide 라벨링 및 단일 분자 형광 이미징. 3단계: 단일 분자 국소화 및 이미징 재구성. 실험 당일, 코트 커버는 1/2에서 1밀리리터의 PDL로 미끄러집니다.

1-2시간 후에 커버 슬립 가장자리에서 티슈로 여분의 PDL을 흡수합니다. 그런 다음 커버 슬립을 섭씨 4도의 금속판에 보관하십시오. 다음으로, 커버 슬립에서 성장한 사전 전형된 INS-1 세포를 1밀리몰 EGTA를 함유한 1/2-1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 세척합니다.

이 세척을 세 번 반복하고 여분의 PBS를 흡수하십시오. 이제 핀셋을 사용하여 배양된 세포와 함께 커버 슬립을 세포 면이 아래로 향하게 하여 PDL 코팅된 커버 슬립에 놓습니다. 식힌 금속판에서 이 작업을 수행합니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 4도에서 7분 내지 10분 동안 옮겨 세포가 부착할 시간을 줍니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 PDL 코팅된 커버슬립에 얇은 세포막 층을 남기는 세포가 로드된 커버슬립을 부드럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 1/2-1밀리리터로 멤브레인 시트를 부드럽게 씻습니다.

이제 PBS에 0.2%의 글루타르알데히드와 함께 약 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 4% PFA로 각 멤브레인 시트를 고정합니다. 멤브레인이 섭씨 4도에서 15분 동안 고정되도록 합니다. 고정 후 즉시 이미징을 진행하거나 얼음처럼 차가운 PBS로 제제를 덮고 섭씨 4도에서 보관하십시오.

pH 프로브를 사용 중인 경우 즉각적인 이미징을 강력히 권장합니다. 이 절차에는 TIRF 현미경 기반 SMLM 시스템이 사용됩니다. 멤브레인을 이미징하기 전에 1마이크로리터의 형광 비드 용액을 10ml의 PBS에 50ml의 염화마그네슘으로 희석합니다.

그런 다음 샘플을 이미징 챔버에 로드하고 희석된 용액 200마이크로리터를 추가한 후 10분 동안 기다립니다. 다음으로 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 이제 PALM 이미징 시스템을 시작합니다.

관련 이미징 소프트웨어에서 iRFP 채널 버튼을 선택합니다. 그런 다음 iRFP 채널에서 pH 프로브를 발현하는 세포막을 찾고 드리프트 보정을 위해 형광 비드를 사용합니다. 일반 TIRF 각도를 TIRF 임계각보다 1.5배 더 깊은 2140으로 설정하며 기본 각도여야 합니다.

그런 다음 캡처 버튼을 사용하여 iRFP 채널의 기존 TIRF 이미지를 참조로 수집합니다. 그런 다음 RFP 채널 버튼을 클릭하여 PAm-Cherry1 채널로 전환합니다. 그런 다음 AOTF 패드의 스크롤 막대를 전체 조명을 위해 오른쪽 끝까지 조정하고 약 10-20초 동안 레이저를 적용하여 배경 멤브레인 형광을 표백합니다.

그런 다음 형식 탭에서 최적의 카메라 설정을 2 x 2 binning으로 설정합니다. 그런 다음 ND 시퀀스 획득 탭에서 빠른 획득 프로토콜을 20헤르츠에서 30,000개의 이미지로 설정합니다. 그런 다음 이미지 획득 중에 405 나노미터 레이저에 0.1-1%의 전력을 적용하여 각 프레임에서 공간적으로 격리된 지점을 쉽게 식별할 수 있도록 합니다.

이제 지금 실행 버튼을 클릭하여 PAm-Cherry1 이미지를 획득합니다. 활성화될 수 있는 분자의 수는 획득 중에 점차 감소합니다. 이에 대응하여 405 나노미터 레이저의 강도를 점진적으로 증가시켜 최적의 신호 밀도를 유지합니다.

모든 PAm-Cherry1 신호가 활성화될 때까지 이미지를 획득합니다. 나중에 이미지 처리 및 재구성을 진행할 때 각 프레임에서 개별 분자 이벤트를 식별하고 지역화합니다. 웨이블릿의 임계값 번호를 사용하여 필터링 강도 임계값을 설정합니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. PIP2 공간 분포는 텍스트에 설명된 적절한 고정으로 다른 고정에 민감하며, PIP2 프로브는 PIP2 항체 또는 특정 pH 도메인으로 라벨링할 때 일관된 분포를 보였습니다. 이에 비해 EGFP 태그가 지정된 pH 도메인으로 표지된 살아있는 세포는 이미지가 크게 다르지 않습니다.

모든 샘플은 프로브의 균일한 분포를 보여주었습니다. 대조적으로, 최적이 아닌 고정은 급격히 조밀한 PIP2 클러스터와 신호 강도의 감소를 초래했습니다. 최적의 고정 조건에서 고정 세포에서 PIP2의 초고해상도 이미지는 제한된 농도 구배만으로 원형질막의 상당 부분에서 프로브의 균일한 분포를 보여주었습니다.

일부 멤브레인 패치는 PIP2 프로브가 풍부하여 드문드문 분포되어 있고 다양한 크기를 가졌습니다. 라이브 셀 PALM 이미지는 고정 세포와 유사한 공간 분포를 보여주었습니다. PIP2 신호에 대한 상세한 분석은 국소적 영역에서 그들의 역학이 빠르다는 것을 보여주었지만 이로 인해 전체 풍부도에 큰 변화가 일어나지는 않았습니다.

이 기술은 인지질 분야의 연구자들이 생리학적 조건에서 다른 포스포이노시티드 아형의 분포 및 활성을 탐구할 수 있는 새로운 방법을 소개합니다.