빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

본 절차의 전반적인 목표는 특정 RNA와 생체 내(in vivo)에서 해당 RNA와 결합한 단백질을 효율적으로 분리하는 것입니다. 이 방법은 특정 전사체에 결합된 뚜렷한 RNA 결합 단백질(RBP) 세트가 무엇인지와 같은 RNA 대사 및 조절의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분리 효율이 높다는 것이며, 이를 통해 새로운 mRNA 결합 단백질의 후속 식별이 가능합니다.

이 신속한 방법론은 MS2 태그가 붙은 MRNA와 MS2 결합 단백질 및 streptavadin 결합 단백질의 융합 단백질을 공동 발현하는 효모 균주를 이용합니다. 합성 덱스트로스 또는 SD 선택 배지에서 30 °C로 효모 세포 500 milliliters를 OD600 0.8에서 1.0까지 배양합니다. 세포 준비가 완료되면, 실온에서 3000 ×g로 4분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.

PBS로 세포를 세척하고 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 methionine이 없는 SD 배지와 동일한 부피로 세포를 재현탁합니다. 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 30 °C에서 45분에서 60분 동안 배양합니다.

45분에서 60분 후, RNA 추출을 위해 세포 10 milliliters를 따로 떼어 두고, 나머지 세포는 신속 정제(rapid purification)에 사용합니다. 이 과정을 시작하려면, RNA-단백질 복합체를 가교하기 위해 37% formaldehyde 1.35 milliliters를 세포에 첨가하여 최종 농도를 0.1%로 맞춥니다. 30 °C에서 10분 동안 계속 배양합니다.

가교 결합을 중단하려면 2.5 M glycine 26.5 mL를 첨가하여 최종 농도를 0.125 M로 맞춘 후, 30 °C에서 3분 동안 배양하십시오. 이후부터는 모든 시료를 얼음 위에 두고 신속하게 작업하여 RNA 분해를 최소화하십시오. 세포를 4 °C에서 3000 ×g로 4분 동안 원심 분리하십시오.

상층액을 버리고 차가운 PBS 45 milliliters를 추가한 후 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 고농도의 Rnase inhibitor가 포함된 rapid lysis buffer 5 milliliters에 세포를 재부유시킵니다. 세포 현탁액을 스크루 캡 마이크로 원심분리 튜브에 500 microliters씩 분주하고, 각 분주액에 냉각된 유리 구슬 약 400 milligrams를 추가합니다.

비드 비터(bead-beater)를 사용하여 3분 동안 세포를 용해합니다. 용해물을 즉시 얼음에 보관하십시오. 용해물을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

5 mL 주사기의 윗부분을 잘라 빈 15 mL 튜브에 끼워 스크류 캡 튜브용 어댑터로 사용합니다. 가열된 바늘을 사용하여 각 튜브 바닥에 작은 구멍을 뚫고, 이를 어댑터가 장착된 15 mL 튜브 위에 올립니다. 튜브 조립체를 4 °C에서 3000 ×g로 1분 동안 원심분리하여 용해물을 15 mL 튜브로 용출시킵니다.

각 15 milliliter 튜브의 통과액을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮기고, 4 degrees Celsius에서 10,000 times G로 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 모든 1.5 milliliter 튜브의 상층액을 하나의 15 milliliter 튜브에 모읍니다. RNA 및 단백질 분리를 위해 각각 용해물 부피의 1/50 및 1/100을 따로 떼어 둡니다.

세포 용해물에 300 micrograms의 Avidin을 첨가하여 RNA 단백질 복합체 분리를 위한 신속 절차를 시작합니다. 지속적으로 롤링하며 4 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다. 세포 용해물을 Avidin과 함께 배양하는 동안, streptavidin 비드를 사전 세척하고, streptavidin 비드 현탁액 약 300 microliters를 1.5 milliliters 마이크로 원심분리 튜브에 옮긴 후, 준비물을 원심분리하고 상층액을 제거하여 250 microliters의 비드를 남깁니다.

비드에 rapid lysis buffer 1 milliliter를 추가하고 4 degrees Celsius에서 660 times G로 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 rapid lysis buffer로 다시 세척합니다. 비드를 블로킹하기 위해 rapid lysis buffer 0.5 milliliters, BSA 0.5 milliliters, 그리고 yeast TRNA 10 microliters를 추가한 후, 4 degrees Celsius에서 지속적으로 회전시키며 1시간 동안 인큐베이션합니다.

rapid lysis buffer 1 milliliter로 비드를 두 번 세척하십시오. 세척된 streptavidin 비드 250 microliters를 avidin이 포함된 용해물에 첨가하고 4 degrees Celsius에서 지속적으로 회전시키며 1시간 동안 배양하십시오. 이 배양 시간은 충분한 결합 시간을 제공하는 것과 RNA 분해 가능성을 최소화하는 것 사이의 절충안입니다.

1시간 후, 4 °C에서 660 ×g로 2분간 원심분리하여 스트렙타비딘 비드를 제거합니다. 상층액을 15 mL 튜브로 옮깁니다. RNA 및 단백질 분리를 위해 각각 용해물 부피의 1/50과 1/100을 따로 보관합니다.

비드에 rapid lysis buffer 1 milliliter를 추가합니다. 피펫팅으로 혼합한 후 새로운 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 4 degrees Celsius에서 660 times G로 2분 동안 원심분리합니다. rapid lysis buffer로 3회 더 세척합니다.

rapid lysis buffer로 마지막 세척을 마친 후, 상층액을 제거하고 rapid wash buffer 1 milliliter를 첨가하여 4 degrees Celsius에서 5분 동안 회전 섞기 합니다. 원심분리하고 rapid wash buffer로 2회 더 세척합니다. PBS 1 milliliter로 비드를 세척하고 이전과 동일하게 원심분리합니다.

상층액을 제거하고, 비드에 PBS 120 µL를 첨가한 후 롤러에서 5분 동안 회전시킨다. 이전과 동일하게 원심분리하고, 모든 상층액을 세척 샘플로서 RNA 및 단백질 추출을 위해 수집한다. RNA 및 RNA 결합 단백질을 용출시키기 위해, 비드에 PBS에 희석한 6 mM biotin 120 µL를 첨가하고, 지속적으로 회전시키며 4 °C에서 45분 동안 배양한다.

비드를 원심 분리하고 용출물을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 용출된 샘플을 다시 한번 원심 분리하고 상층액을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮겨 비드가 섞여 들어가지 않도록 합니다. RNA 또는 단백질 추출을 위한 샘플을 채취합니다.

RNA의 분리 효율과 품질을 결정하기 위해, 두 가지 태그된 RNA인 PMP1 및 FPR1에 대하여 Northern 분석을 수행하였습니다. 분석 대상은 cast cell lysis, rapid cell lysis 및 biotin을 이용한 용출 후의 샘플이었습니다. 리보솜 RNA는 ethidium bromide 염색으로 검출하였으며, 용출 샘플에서 리보솜 RNA가 검출되지 않은 것은 정제 과정의 엄격성을 나타냅니다.

정제 과정의 엄격함과 특이성은 용출 시료에서 태그가 없는 MRNA 신호가 검출되지 않음을 통해 더욱 입증됩니다. FPR1 레인에서 나타나는 ACT1 크기가 아닌 뚜렷한 신호는 이전의 MS2L 프로브 하이브리드화 과정에서 남은 잔여물입니다. 입력 RNA가 Hot Phenol 프로토콜로 정제한 RNA에 비해 다소 분해되었음에도 불구하고, 용출 분획의 강한 신호에서 알 수 있듯이 상당량의 전장 태그 RNA가 특이적으로 분리되었습니다.

단백질 샘플은 프로테오믹스 분석 전에 SDS-PAGE와 은 염색을 통해 분석할 수 있습니다. 화살표로 표시된 MS2-CP-GFP-SBP 융합 단백질은 단백질 로딩 양이 동일함을 보여줍니다. 별표는 나중에 질량 분석 분석을 위해 겔에서 절단한 강도가 서로 다른 밴드들을 나타냅니다.

본 절차를 수행할 때는 장갑을 착용하고, 작업 공간을 청결하게 유지하며, RNA free water로 용액을 준비하고, 프로토콜 소요 시간을 줄이기 위해 신속하고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다. 페놀 및 포름알데히드와 같은 시약은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 항상 화학 흄 후드 내에서 작업하는 등의 주의 사항을 반드시 준수하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 fayn-tress 및 그 관련 조직의 RNA를 효율적이고 효과적으로 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차 이후, 관심 전사체에 결합하는 RNA를 검출하기 위해 RNA-Seq과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.