"Phagosome 폐쇄 분석은"사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Total Internal Reflection Fluescence 또는 TIRF Microscopy를 사용하여 살아있는 대식세포에서 식염색체 형성과 식염색체 분리의 정확한 위치를 3D로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 TIRF 현미경 검사와 에피 형광을 결합하여 pseudopod 확장 및 팁 융합 중에 두 가지 다른 형광 단백질의 단계별 국소화를 모니터링합니다. 이 기술은 임계각을 결정하고 원형질막에 대한 근접에 대한 결론을 도출하는 데 중요한 TIRF 신호를 얻을 수 있는 체계적인 방법을 제공합니다.

TIRF 현미경 세션 전날, 현미경 스테이지의 균일한 가열을 허용하기 위해 가열 챔버를 섭씨 37도까지 켭니다. 다음날 아침, 100 마이크로 리터의 PBS를 사용하여 0.1 % BSA를 보충하여 35mm 유리 바닥 접시 당 6 번째 양 적혈구 또는 SRBC에 7x10을 두 번 씻습니다. 두 번째 원심분리 후, 세포 5마이크로리터당 0.1%BSA가 보충된 PBS에서 하위 응집 농도로 토끼 IGG 항-SRBC 500마이크로리터에 세포를 재현탁하고 느린 회전으로 30분 동안 세포를 배양합니다.

배양이 끝나면 PBS와 BSA에서 SRBC를 두 번 세척하고 접시당 섭씨 37도의 무혈청 현미경 배지 2ml에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 35mm 유리 바닥 접시를 2ml의 0.1%poly-L lysine으로 실온에서 30분 동안 처리한 다음 2ml의 PBS로 2회 세척합니다. SRBC의 비공유 고정을 위해 IGG 옵소니화된 세포 2ml를 폴리리신으로 코팅된 각 접시에 붓고 스윙 로터 원심분리기에서 샘플을 원심분리합니다.

상등액을 버리고 PBS 2ml와 10%BSA로 입자를 한 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 2밀리터의 새 PBS와 10%BSA로 입자를 배양한 다음 2밀리리터의 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 PBS를 섭씨 37도의 무혈청 현미경 매체 2ml로 교체합니다.

SRBC 코팅된 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 그런 다음 배양 접시의 바닥에서 형질 주입된 관심 세포를 긁어내고 세포를 몇 번 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 형질주입된 세포를 SRBC 코팅된 접시에 추가합니다.

실시간 획득 소프트웨어를 시작합니다. 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포를 찾고, 관심 세포가 필드의 중앙에 오도록 접시의 위치를 조정합니다. 하나의 여기 파장에서 0.01도 단위로 0에서 5%까지 다양한 각도로 500개의 이미지를 획득합니다.

입사광이 glass-medium 인터페이스에서 완전히 반사되고 소멸파를 생성하는 임계각을 결정하려면 적절한 이미징 소프트웨어에서 이미지 시퀀스를 엽니다. 균일한 형광을 가진 세포의 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 이미지(Image) 탭에서 스택(Stacks)을 선택하고 Z 축 프로파일을 플롯합니다.

z축을 플롯하려면, 프로파일은 x축의 각도 함수와 함께 관심 영역에서 측정된 평균 형광 강도를 나타냅니다. 임계각보다 우수한 x축의 모든 각도 값을 현미경 세션 중에 사용하여 TIRF 신호를 얻을 수 있습니다. 다음으로, 실시간 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집기를 사용하여 수집의 파라미터를 설정합니다.

루프 획득 시퀀스의 수, 형광 채널 및 레이저 강도, TIRF 각도 및 노출 시간을 포함합니다. 대물렌즈의 Z 이동을 설정하여 epifluorescence mode plane에 도달합니다. 그런 다음 에피 형광 모드에서 TIRF 각도를 1로 설정하고 대물렌즈의 Z가 TIRF 평면으로 다시 이동합니다.

그런 다음 밝은 조명 LED 모드에서 셀의 이미지를 얻습니다. 이제 SRBC로 식세포작용(phagocytosis)에 관여하는 중간 수준의 형광 표지 단백질 발현을 가진 관심 세포를 찾아 세포를 필드의 중앙으로 이동합니다. 이러한 세포는 입자 주위의 확장된 원형질막(plasma membrane)으로 식별될 수 있습니다.

Loop Count 탭에 프레임 수를 입력하여 500에서 1, 000 프레임의 스트리밍 획득을 시작합니다. 필요한 경우 레이저 강도와 노출 시간을 변경하여 세포의 다양한 형광 수준에 적응합니다. 두 채널에 해당하는 두 개의 개별 이미지 시퀀스를 생성하려면 imagine 소프트웨어에서 시퀀스를 열고 이미지 탭을 클릭합니다.

하이퍼스택 메뉴에서 Stack to Hyperstack을 선택합니다. 그런 다음 팝업 창에서 순서에 xyctz를 입력하고, 채널에 사용된 형광 색소 수, z축의 슬라이스 수, 프레임 아래의 채널 수로 나눈 이미지 수, 디스플레이 모드에 대해 그레이스케일을 입력합니다. 그런 다음 채널을 분할합니다.

여기에서는 IGG opsonized SRBC를 삼키는 원시 264.7 대식세포의 식솜 폐쇄 분석에 대한 대표적인 라이브 셀 TIRF 현미경 검사 동영상이 표시됩니다. 유리 덮개와 반대편에 있는 pseudopods의 끝이 SRBC 주위를 미끄러지면서 TIRF 영역에서 F-actin 고리가 감지되고 닫힐 때까지 점진적으로 좁아집니다. 이와 동시에 TIRF 영역보다 3미크론 위로 스테이지를 이동한 후 epifluroescence에 의해 감지된 흐릿한 F-actin 신호는 phagocytic cup 기저부의 탈중합에 해당합니다.

3분 후, SRBC는 투과광 이미징에 의해 확인된 바와 같이 완전히 내재화됩니다. 이러한 방법을 사용하여, phagocytic cup의 기저부에 있는 actin의 세포내 구획의 국소 외포작용이 발생한다는 것을 입증할 수 있습니다. 획득 후, 세포는 상관 전자 현미경을 위해 추가 처리되거나 전체 세포 집단을 고정 및 동결 처리하여 고전적인 면역 형광 현미경 검사를 위해 할 수 있습니다.

식세포작용은 온도에 매우 민감하므로 가열실과 배양 접시 배지 내부의 온도는 절차 내내 섭씨 37도의 온도를 일정하게 유지해야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 입자를 옵소니화하고, 입자로 커버 슬립을 코팅하고, TIRF 현미경 검사에 대한 임계각을 결정하고, 살아있는 세포 식균작용 중 관심 단백질의 국소화를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.