Name: 철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 학습하세요 철 염화물로 유도한 쥐 경동맥 혈전증 모델을 통해 혈소판 활성화와 혈전 형성 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 항응고제 및 항혈소판 약물 평가에 민감하여 혈관 생물학 연구에 유용합니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, NHLBI)의 지원을 받았으며 수상 번호는 R01 HL121212(PI: Sen Gupta, Co-I: Li) 및 R01 HL129179 HL098217(PI: Nieman)입니다. 이 출판물의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

모든 절차와 동물의 조작은 미국 공중 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 및에 따라 클리블랜드 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 실험 동물의 사용. 1. 준비 : <ol><li> 라벨 혈소판에 대한 형광 염료 <ol><li> 식염수에, 로다 민 6G 솔루션, 0.5 ㎎ / ㎖를 준비하고 0.22 μm의 필터 솔루션을 소독. </li></ol></li><li> 50ml을 해결 <ol><li> 30 % 50ml을의 신선한 원액 확인 순수한 물 (무수을, 1.85 M와 동일), 0.45 μm의 필터로 필터링 할 수 있습니다. 5 ml의 신선한 50ml을 원하는 농도로 3 솔루션 [예를 들어, 2.5 % (0.154 M), 5 % (0.308 M), 7.5 % (0.463 M), 10 % (0.617 M)와 12.5 % (0.771 M)]에 의해 준비 물 난으로 30 % 50ml을 솔루션을 희석NA 6cm 조직 배양 접시 뚜껑을 유지 폐쇄. 참고 : 배양 접시를 사용하여보다 쉽게 이러한 1.5 ml의 microcentrifuge 관으로, 좁은 컨테이너에서 그것을 선택하는 것보다 50ml을 용액으로 포화 여과지를 선택 할 수 있습니다. FeCl3를 매우 위험합니다 및 입고 장갑 등 실험실 코트, 개인 보호 장비 등의주의 사항은 항상주의해야한다있다. </li></ol></li><li> 필터 논문 <ol><li> 1mm X 2mm 크기로 필터 종이를 잘라. 같은 접시에 50ml을 용액에 차단 필터 종이의 충분한 조각을 만끽 해보세요. </li></ol></li><li> 파파 베린 염산염 솔루션 <ol><li> 물 파파 베린 하이드로 클로라이드 용액 (25 ㎎ / ㎖)을 준비하고, 0.22 μm의 필터로 살균 용액. </li></ol></li><li> 아가로 오스 젤 <ol><li> 6 웰 조직 배양 플레이트에서 2 % 아가 로스 겔에서 PBS 또는 식염수를 준비 ~ 1cm 두께 및 C~ 3cm 지름 반원에 유타. </li></ol></li></ol> 2. 50ml을 유도 경동맥 동맥 손상 혈전증 모델 <ol><li> 혈전증 모델에 대한 외과 적 치료 <ol><li> 12 주 오래 된 C57BL6 마우스 (또는 다른 균주 필요) - 8을 사용합니다. 복강 내 주사를 통해 케타민 (100 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 쥐를 마취. 발가락 끼에 의한 마취의 깊이를 확인합니다. 참고 : 케타민 / 자일 라진의이 금액은 최소 1 시간 동안 안정 마취에서 동물과 고통 (곤란 발끝까지 응답)을 유지하기에 충분하다. </li><li> 작은 동물 전기 깎기와 목, 가슴 위쪽에 모피를 제거합니다. 탈모 크림은 필요하지 않습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 중립 석유 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 15cm 조직 배양 접시의 뚜껑에 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 힌을 확보하기 위해 하나의 긴 테이프 (~ 10cm)를 사용D 사지와 하체, 그리고 앞다리를 확보하기 위해 작은 테이프 (2 cm X 0.5 cm)의 두 조각. , 앞니의 주위에 포장을 4-0 봉합사를 사용하여 마우스 목 직선 (그림 2)을 유지하기 위해 뚜껑에 봉합의 두 끝을 테이프. </li><li> 수술 광원에서 작업자 방향으로 마우스 머리 판을 놓습니다. </li><li> 알코올 패드로 수술 부위를 소독. 피부를 유지하기 위해 마이크로 Adson 집게를 사용하여 작은 절개하기 위해 수술 가위를 사용 (2-3mm)를. </li><li> 포셉과 절개의 피부를 잡고 턱은 절개로 폐쇄와 수술 가위를 삽입합니다. 피하 층으로부터 피부를 무료로 가위를 열고 다음 흉골 또는 턱으로 피하 가위를 밀어합니다. </li><li> 설골의 수준 (그림 3a 및 3b)에 흉골에서 중간 선 절개를하는 수술 가위로 피부를 잘라. 퉁명스럽게 얇은 근막 (점선에서 해부 <stroNG&gt; 좋은 지혈과 턱밑 샘과 Graefe 씨 집게 (그림 3B 및 3C와 그림 3B), 파란색 화살표). 참고 : 흉골 (그림 3C에서 검은 색 화살표) 및 기관 (그림 3C에서 T)이이 단계 이후에 볼 수 있습니다. </li><li> 를 무료로 지혈의 턱을 열고 (그림 3C 노란색 점선) 2시 방향을 향해 근막 아래에 지혈을 삽입, 연조직 및 Graefe 씨 집게로 흉골의 오른쪽에 보이는 피부를 잡아 주변 조직으로부터 경정맥. </li><li> 오른쪽 경정맥 (그림 3D, 화살표)를 노출시키는 수술 가위와 2시 방향 (그림 3C)을 향해 근막, 연부 조직과 피부를 잘라. </li><li> 다음 22 G 바늘, 변화와 1 ML의 주사기를 사용하여 300 μL의 로다 민 6G 솔루션 - 약 200 그리기그것은 30 G 바늘. 참고 :이 그 좋은 팁의 손상으로부터 30 G 바늘을 보호합니다. 직접 팁을 손상되지 않습니다 30 G 바늘로 로다 민 6G 솔루션을 그리기; 그러나 주입하지 않을 수 있습니다 손상을 일으킬 것입니다 실수로 용기 벽을 터치. </li><li> 천천히 로다 민 6G 솔루션을 밀어 30 G 바늘을 세척, 공기 방울이 주사기 나 바늘에 남아 있는지 확인하십시오. 주입을위한 100 μL의 로다 민 6G 솔루션을 유지합니다. </li><li> 벤드 2 - 경정맥에 너무 깊이 삽입 바늘을 방지하고보다 용이하게 (도 3D)을 제어 분사하게된다 니들 홀더 90 ° 각도로 바늘 3mm 팁. </li><li> 라벨 혈소판에 대한 권리 경정맥에 로다 민 6G 솔루션을 주입한다. injection.Af 동안 다른 손으로 Graefe 씨 집게와 한 손으로 주사기와 바늘을 잡고 주사기를 안정 위치에 바늘을 유지하려면터 주입은 출혈을 방지하기 Graefe 씨 집게로 주사 부위 클램프. </li><li> 지혈의 턱을 열고 주사 부위의 혈관 벽을 고정하기 위해 Graefe 씨 집게 아래에 삽입 한 다음 6-0 봉합과 주사 부위를 결찰. 주의 : 단계 2.1.15의 대안으로서, 출혈을 중지 2 분간 손가락으로 주사 부위에 압력을인가하는 단계; 그러나,이 방법은 또한 유발 주사 부위에서의 응고 실수 제거되면 출혈의 위험이있다. </li><li> 퉁명스럽게 지혈과 Graefe 씨 집게와 왼쪽 턱밑 글 랜드 주변의 연부 조직 및 근막을 해부하고 왼쪽 흉쇄 근육 (그림 3E에서 파란색 화살표)를 노출 7시 위치 (그림 3E) 방향으로 선을 빼냅니다. </li><li> 퉁명스럽게 왼쪽 흉쇄 근육과 omohyoid 근육 또는 sternohy 사이의 근막 (그림 3E, 점선)를 해부지혈과 기관의 왼쪽 사이트에있는 OID 근육 (그림 3E, 녹색 화살표). </li><li> 흉쇄 근육 (그림 3E에서 파란색 화살표)의 중간에서 6-0 실크 봉합사 (약 15cm 길이)로 바늘을 통과, 함께 봉합의 두 끝을 넣고 10시 방향으로 옆으로 봉합사를 당겨 . 참고 :이 절차는 흉쇄 근육의 외부에있는 왼쪽 경정맥의 부상을 방지하기 위해주의 깊게 수행해야합니다. </li><li> 퉁명스럽게 얇은 sternohyoid 근육 및 / 또는 흉쇄 근육을 떼어 후 경동맥 (CA) (그림 3 층 화살표)를 노출 omohyoid 근육을 구분합니다. 필요에 따라 sternohyoid 근육 및 / 또는 omohyoid 근육을 잘라. CA를 건드리지 않고 CA의 부드러운 조직을 분리 지혈을 사용하여 참고 : CA는 미주 신경을 동반, 흰색 구조에서 볼 <strong&gt;도 3G (초록색 화살표)과 씬 sternohyoid 근육 및 / 또는 (도 3f에서 황색 점선 사이) omohyoid 근육하에 대부분. </li><li> 미주 신경과 CA를 피하면서 CA 주변의 측면 밴드를 데리러 좋은 팁 집게를 사용하여 는 CA와 미주 신경 사이의 근막에 구멍을 펀치 또 다른 좋은 팁 집게를 사용합니다. </li><li> 구멍을 통해 후크를 전달하고 부드럽게 CA를 들어 올린 후 캘리포니아에서 미세 팁 집게를 배치 외막 연부 조직을 제거하기 위해 CA 따라 반대 방향으로 후크와 집게를 이동합니다. 주변 조직에서 CA (그림 3H, 파란색 화살표)의 무료 적어도 ~ 5mm 길이. </li><li> 평면에 검은 색 플라스틱 커피 교반기의 끝을 눌러 배경 형광을 차단하기 위해, 3mm 조각에 커피 교반기를 샛길 한 다음 &quot;U&quot;모양 플라스틱 (그림 3H, 녹색의 두 조각을 얻을 수있는 배 가장자리를 따라 길이 방향으로 절단 ) 화살표. </li><li&gt; 염분이 &quot;U&quot;모양 플라스틱의 한 조각을 씻어 집게로를 잡고 부드럽게 후크 (그림 3H, 녹색 화살표)와 CA를 해제하는 동안 CA 아래에 배치합니다. 즉시 CA를 건조 방지하기 위해 식염수 2 ~ 3 방울을 적용 </li></ol></li><li> 실시간 녹화 비디오 <ol><li> 10 배의 물을 렌즈에 따라 적절한 위치에 현미경 무대와 장소에 함께 마우스와 접시 뚜껑을 전송합니다. 10 배 렌즈와 식염수와 CA 사이의 공간을 채 웁니다. </li><li> 디지털 비디오 레코딩 소프트웨어 응용 프로그램을 시작하고 새 파일을 실행하고 그에 따라 이름을 지정합니다. 정상 혈관 영상을 녹화하고 녹화 정지시의 프레임 번호를 기록. 주 : 기록 용 컴퓨터에 녹화 소프트웨어를 참조. 우리는 디지털 비디오 기록 소프트웨어를 사용하여 다음의 설명은 본 출원에 기초한다. 참고 : 기계 TRA 이후UMA는 내피 손상 및 혈전 형성 (20)으로 이어질 수 있으며, 50ml을 부상 전에 용기 벽에는 외과 적 손상이 없다는 것을 확인하는 것이 필요하다. 50ml을 유도 된 손상의 효과가 장벽을 형성하고있다 감쇠 CA 주위에 남아있는 조직이 없다는 것을 확인할 필요가있다. 쉽게 후 경과 시간에 따라 동영상을 분석 할 수 있도록 할 레코드의 프레임 번호를 기록합니다. </li><li> 10 배 렌즈에서 접시 뚜껑 마우스를 이동합니다. 얇고 미세한 끝을 조심스럽게 CA 주변의 식염수를 지워하는 데 사용하는 종이 타월의 모서리를 접어 수술 분야에서 다른 장소뿐만 아니라 (CA 손이​​ 닿지 않도록). 이것은 사용의 FeCl3 용액의 희석을 방지하는 것이 중요하다. </li><li> 좋은 팁 집게를 사용하여 50ml을 용액으로 포화 필터 종이를 픽업하여 CA에 직접 배치하고 1 분 동안 사이트에 보관하십시오. 참고 : TO 혈류 수확 정확한 데이터의 처치 시각화, 근접 노출 CA (도 3I)의 선단부에 여과지를 놓고 후반에서 혈액 흐름을 관찰 (도 3I 녹색 화살표) 근위 부위에 짧은 세그먼트를 남겨 단계 (아래 참조). </li><li> 여과지를 제거 (이 시점을 시작으로 정의 &quot;손상 후&quot;) 및 식염수 (적어도 2 ㎖)와 CA를 헹군다. </li><li> 다시 10 배 렌즈 플레이트 뚜껑 마우스를 넣어; 혈관을 관찰하고 기록 영상으로 시작합니다. 기록 제 분의 마지막 비디오 프레임 번호를 기록. 주 : 혈전 형성은 컴퓨터 스크린이나 현미경 실시간 영상에서 관찰되는 형광 혈소판의 축적에 의해 식별된다. 녹화 영상 바로 현미경 위로 마우스를 붙여서. f를 제거한 후 상기 제 분의 말미에 기록 유지ilter 종이. 부상에 대한 정보를 얻기 위해 근위 사이트 선단부에서 전체 용기를 관찰하고 관심 영역에 초점을 상기 촬상 용 (일반적으로 손상된 영역의 중심). </li><li> 10 초 처음 10 분 실험이 끝날 때까지 (예를 들어, 3시 5분부터 2시 55분까지) 후 10 초마다 다른 분 분마다 녹음 영상. 각 기록이 중단 될 때 프레임 번호를 기록합니다. 참고 모델의 마지막 포인트는 1)의 혈류가&gt; 30 초 동안 중단 된 경우; 2) 폐쇄는 손상 후 30 분에 볼 수없는 경우. 이러한 경우, 통계적 분석을 위해 30 분을 사용한다. 처음에 10 밀리 초와 같은 동영상 기록의 노출 시간을 설정하므로는 혈전을 통해 혈액의 흐름을 관찰하기 쉬운 것이다. 혈전이 커질 및 형광 카메라의 센서를 포화 할 때, 혈전을 통해 혈류를 식별하기 어려워진다. 이 문제를 해결하기 위해, 촬상 CE 이동혈액의 흐름이 아직 명확하게 관찰 할 수 근위 손상되지 않은 사이트 (그림 3I, 녹색 화살표)에 nter. 근위 않은 부상 사이트에 초점을 때 혈액의 흐름이보다 명확하게 관찰 할 수 있도록 우리는 또한, 15 또는 20 밀리 초에 노출 시간을 증가시킨다. 혈류가 중단 할 때, 더 많은 세포 (백혈구) 혈전의 근위 부위에 혈관 벽에 롤 시작한다. 큰 세포의 모양 후 3 분 - 흐름은 보통 2에서 멈 춥니 다. 이 변경된 경우, 기록 시트 상에 노광 시간 써라. 통상 야생형 C57BL6 마우스가 사용 된 경우는 일반적으로, 실험의 끝에 마취에서 약 30 분 걸린다. 주의 참고 : 정확한 데이터를 제공하지 않습니다 혈액 흐름 중단의 표시로 흰색 집계 된 혈소판 응고를 사용하지 마십시오과는 노출 시간에 의해 영향을 받는다. 흰색 응고하십시오 (대표 비디오 1) 중단 혈액의 흐름을 의미하지 않는다 혈관 내강이 덮여있다. </li><li&gt; 실험의 끝에, 생기 및 하트 비트 확인되지 후 경추 탈구이어서 과량 케타민 / 자일 라진 (20분의 200 ㎎ / ㎏)을 사용하여 마우스를 안락사. </li></ol></li></ol> 3. 50ml을 유도 장간막 동맥 / 정맥 혈전증 모델 <ol><li> 섹션 2.1.1에서 언급 한 바와 같이 12주 오래된 C57BL6 마우스 - 8 마취. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다. </li><li> 복강 내 창자의 연동 운동을 억제하는 파파 베린 솔루션 (총 0.4 밀리그램 / 마우스)를 주입한다. </li><li> 동물 전기 깎기와 목과 복부에 모피를 제거합니다. 탈모 크림은 필요하지 않습니다. </li><li> 15cm 조직 배양 접시의 뚜껑에 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 모든 다리를 보호하는 작은 테이프 (2 cm X 0.5 cm)의 네 가지를 사용합니다. 앞니의 주위에 포장 4 -0 봉합사를 사용하여 목 ​​직선 (그림 2)을 유지하기 위해 뚜껑에 봉합의 두 끝을 테이프. </li><li> 절차 2.1.4를 따라 -2.1.15 라벨 혈소판에 로다 민 6G의 주입을위한 경정맥을 노출. </li><li> 수술 가위 (그림 4A)를 사용하여 복부 이하로 칼 모양으로부터 피부를 통해 중간 선 절개를 수행합니다. (또한 원격 교육 알바는 그림 4A, 화살표) 명확하고 더 혈관이없는 Graefe 씨의 집게로는, 약 2 올려 중간 복막 픽업 - 절단 선 아래에는 대장을 확인하지 3mm 높은 오픈 복막을 잘라 길이 방향으로 미세 가위 (그림 4B)와 함께. </li><li> 오른쪽 측면 위치로 마우스를 다시 고정합니다. 복부에 가까운 반원 아가로 오스 겔을 배치하고 부드럽게 장을 외면 화하다하고 Graefe 씨 집게 (그림 4C)와 젤의 상단에 확산. 혈전증 실험 (그림 4C, 화살표)에 대한 두 번째 지점을 사용합니다. 참고 : 창자를 외면 화하다하는 데 도움이 지혈 또는 마이크로 Adson의 집게를 사용합니다. 을 아프게하지 마십시오장 및 용기. </li><li> 창자와 용기의 수분을 유지하기 위해 6 방울 식염수 - 5를 놓습니다. 현미경 스테이지에 함께 접시 뚜껑 마우스를 전송하고 10 배 건조 렌즈에 따라 적절한 위치에 배치합니다. 참고 : jejunoileal 막 식염수 솔루션을 보유 할 수 없기 때문에 마른 렌즈를 사용합니다. 습기를 유지하기 위해 노출 된 조직에 생리 식염수를 삭제해야합니다. </li><li> 치료 전 장간막 동맥과 정맥 주위의 식염수를시킨다. </li><li> 12.5 % 50ml을 용액으로 포화 필터 종이를 선택하고 1 분 (그림 4D)에 대한 장간막 동맥과 정맥에 직접 배치 좋은 팁 집게를 사용합니다. 여과지를 분리하고 식염수로 부상 장간막 동맥 및 정맥 린스 (적어도 2 mL) 중 (이 시점 &quot;은 손상 후&quot;의 시작으로서 정의된다). </li><li> 다시 10 배 건조 렌즈 아래 판 뚜껑 마우스를 넣어; 혈관을 관찰하고 레크 리 에이션 시작2.2에서 언급 ORD 영상). 참고 :이 실험의 엔드 포인트는 1) 혈액의 흐름은&gt; 30 초 동안 중단 한 경우; 또는 2)의 폐색은 손상 후 30 분에서 볼 수없는 경우,이 경우 통계 분석을 사용하여 30 분. </li><li> 실험의 끝에, 생기 및 심장 박동이 확인되지 않은 후에 경부 전위이어서 과량 케타민 / 자일 라진 (20분의 200 ㎎ / ㎏)을 사용하여 마우스를 안락사. </li></ol>

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<li>Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%2C+historical+context%2C+and+clarifications+of+the+NINDS+rt-PA+stroke+trials+exclusion+criteria%3A+Part+1%3A+rapidly+improving+stroke+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms.</a> Stroke. 44, 2500-2505 (2013).</li>
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<li>Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+anionic+region+of+human+protease-activated+receptor+4+inhibits+platelet+aggregation+and+thrombosis+without+interfering+with+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis.</a> J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).</li>
<li>Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platelet-inspired+paradigm+for+nanomedicine+targeted+to+multiple+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases.</a> Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).</li>
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50ml을 유도 된 모델은 혈소판 기능 및 혈전증 7,8,16,19,31-33의 유전자 변형에 대한 유용한 정보를 제공 할뿐만 아니라, 가장 널리 사용되는 혈전 모델의 하나이며, 또한 유용한 도구가 될 수있다 죽상 혈전증 질환 11,17,34-37의 치료 및 예방을위한 치료 화합물과 전략의 평가. 여기에서 우리는 우리의 수정이 모델의 개선을 표시하고 항응고제 (TPA) 및 항 혈소판 약물 (PAR4 항체)의 효과를 결정하기에 충분히 민감이 기술의 유틸리티의 추가 증거를 보여왔다. 혈전증의 기전 연구에 더하여,이 모델은 나노 기반 타겟팅 혈전 약물 전달을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 또한 형광 ROS 표시기 (21)의 주사에 의해 혈관벽 활성 산소 종 (ROS) 형성의 검출에 사용될 수있다. 꼼꼼기술이 모델을 수행하는 데 필요한. 운영자는 충분한 수술 기술뿐만 아니라 혈관과 혈액 세포 생물학에 대...

동맥 혈전증 (혈전)는 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 비만, 암,자가 면역 만성 류마티스 질환을 포함한 만성 염증과 관련된 다양한 전신 질환의 일반적인 합병증이다. 부적절한 혈소판 활성화, 집계 이후 coagulatory 메커니즘에서 동맥 순환 줄기에 발생하며 혈전은 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 ​​손실에 연루되어있다. 혈관벽은 혈관벽에 혈액 세포, 호르몬 및 사이토킨뿐만 아니라 항산화 단백질의 발현을 순환하는 다수의 세포 유형을 포함하고, 전단 응력을 포함 외적 요인의 다수에 의해 영향 복잡한 시스템이다. 시험 관내 실험에서 복제 할 수없는 이 복잡한 환경 때문에 동물 모델을 이용한 생체 내 연구는 혈전 성 질환에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록하는 것이 중요하다. 마우스는 SIM이 밝혀졌다혈전증, 동맥 경화, 염증과 당뇨병 1,2의 관점에서 인간 ILAR 메커니즘. 또한, 유전자 녹아웃 마우스는 복잡한 생리 학적 또는 병리학 적 환경에서 특정 유전자 산물의 기능을 테스트하기 위해 생성 될 수있다. 이러한 연구는 인간의 병리를 모방하고 새로운 경로 및 치료법의 발견에 관한 중요한 기계론의 정보를 제공 할뿐만 아니라 혈전증에 약물 효과를 특징 짓는 중요한 정보를 제공 할 수있다. 병적 동맥 혈전은 피하 매트릭스 3,4에 층을 손상 또는 기능 장애와 혈류의 노출을 내피로 인해 발생합니다. 다양한 혈전증 모델 기계적 손상, 광 반응성 화합물 로즈 벵갈 계 산화 적 손상 및 레이저 손상이 5로 내피 세포의 손상을 유도하기 위해 개발되었다. 이 스펙트럼에서는, 철 클로라이드 (50ml을 3) 혈관 손상은 혈전증 널리 사용 유도 된 모델이다. 이 시약 때용기의 외 측면에인가 된 혈소판 및 응고 캐스케이드의 요소를 순환에서 내피 세포의 보호 상실, 혈관 세포 6-8에 산화 손상을 유발한다. 50ml을 모델은 간단하고 모두 항응고제 및 항 혈소판 약물에 민감하고, 쥐, 쥐, 기니피그와 토끼 6-15에서 경동맥과 대퇴 동맥, 경정맥 및 장간막과 cremasteric 세동맥과 세정맥에 수행되었습니다. 이 모델에서 하나의 측정 매개 변수는 도플러 유량계 또는 생체 내에 현미경 6,7,9 직접 관찰에서 혈류의 중단으로 측정 혈관 폐색을 완료 부상에서 경과 된 시간입니다. 5 ~ 30 분 사이의 시간의 범위를 제안 C57BL6 마우스 7-10,16 다른 연구에서보고 된 50ml을 그 농도 마취 수술 기법 마우스 연령, 게놈 배경 B의 측정 방법의 종류흐름들 (100d), 및 기타 환경 변수는이 모델에서 중요한 효과를 가지고있다. 이 넓은 다양성 어려운 다른 연구 그룹에서 연구를 비교하고 미묘한 차이의 검출이 어려워 질 수 있습니다. 이러한 변화 성을 최소화하고 생체 내 모델 시스템에서 균일하게 재현을 확립하는 시각과 함께, 우리는 최소의 변형 6-10,16-19 매우 재현성있는 데이터를 만든다 50ml을 유도 된 경동맥 모델을 정제했다. 본 논문에서는 설명하고 기술을 공유하고이 모델에서 혜택을 누릴 수있는 몇 가지 대표적인 실험 예를보고한다.

<table><tbody><tr><td>수술용 가위 - 텅스텐 카바이드</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>14502-14</td><td>컷 앤 홀드</td></tr><tr><td>스킨 마이크로-애드슨 펜치 - 톱니형/스트레이트/12cm</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>11018-12</td><td>컷 앤 홀드 스킨</td></tr><tr><td>Metzenbaum Fino 가위 - 텅스텐 카바이드/곡선/블런트-블런트/14.5 cm</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>14519-14년&nbsp; &nbsp;</td><td>연조직을 절개하고 분리하기 위해</td></tr><tr><td>울트라 파인 지혈제 - 매끄럽게/곡선형/12.5cm</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>13021-12</td><td>연조직을 해부하고 분리하는</td></tr><tr><td>Graefe 집게 - 톱니모양/직선형/10cm</td><td>세밀한 과학 도구&nbsp;</td><td>11050-10</td><td>연조직을 해부하고 분리하기 위해</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps - 생물학 팁/스트레이트/이녹스/11 cm</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>11254-20년&nbsp;</td><td>주변 조직으로부터 혈관 분리</td></tr><tr><td>Dumont #5XL 펜치 - 표준 팁/스트레이트/이녹스/15cm</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>11253-10</td><td>주변 조직에서 혈관 분리</td></tr><tr><td>블런트 훅- 12 cm/0.3 mm 팁 직경</td><td>미세 과학 도구&nbsp;</td><td>10062-12</td><td>주변 조직에서 용기를 격리</td></tr><tr><td>Castroviejo 마이크로 바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12061-02</td><td>바늘 홀더</td></tr><tr><td>봉합사 4-0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-40</td><td>앞니를 플레이트에 고정하기 위해</td></tr><tr><td>봉합사 실 6-0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-60</td><td>모든 수술 및 결찰을 위한</td></tr><tr><td>Kalt 봉합 바늘</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>로다 민 6G&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83697-1G</td><td>Lebel 혈소판</td></tr><tr><td>FeCl3 (무수)</td><td>Sigma</td><td>12321</td><td>혈관 손상 유도</td></tr><tr><td>파파베린 염산염</td><td>Sigma</td><td>P3510</td><td>장 연동 운동을 억제합니다.</td></tr><tr><td>Medline 수술 기구 살균 증기 오토클레이브 테이프</td><td>Medline</td><td>111625</td><td>플레이트에 마우스를 고정하기 위해</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; 주사기 필터 - 멸균 0.22 &마이크로; m</td><td>Fisher</td><td>09-720-004</td><td>마우스에 주입된 용액의 살균을 위해</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; 주사기 필터 - 멸균 0.45 &마이크로; m</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td>FeCl3 용액을 필터링하려면</td></tr><tr><td>멸균 알코올 준비 패드</td><td>Fisher</td><td>06-669-62</td><td>수술 부위를 살균하기 위해</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>겔 스테이지</td></tr><tr><td>Leica DMLFS 형광 현미경</td>, <td>Leica</td><td></td><td>Intravital 현미경</td></tr>, <tr><td>GIBRALTAR 플랫폼 및 가열판이 부착된 XY 스테이지 시스템을 만듭니다.</td><td>npi electronic GmbH</td><td></td><td>http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html</td></tr><tr><td>Streampix 버전 3.17.2 소프트웨어</td><td>NorPix</td><td></td><td>https://www.norpix.com/</td></tr></tbody></table>

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

동맥 혈전증(혈전)은 죽상동맥경화증, 당뇨병, 비만, 암, 만성 자가면역 류마티스 질환 등 만성 염증과 관련된 많은 전신 질환의 흔한 합병증입니다. 혈전은 대부분의 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 상실의 원인이며, 혈전증은 매우 중요한 공중 보건 문제입니다. 이러한 혈전은 부적절한 혈소판 활성화와 그에 따른 응고로 인해 발생하기 때문에 이러한 시스템을 치료적으로 표적으로 삼는 것은 보다 안전한 치료법을 개발하는 데 중요한 임상적 의의가 있습니다. 지혈계의 복잡성으로 인해 시험관 내 실험은 혈액과 혈관 벽의 상호 작용을 복제할 수 없습니다. 따라서 생체 내 연구는 혈전 형성의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이를 위해 마우스에서 다양한 혈전증 모델이 개발되었습니다. 그 중 염화제이철(FeCl3) 유도 혈관 손상은 널리 사용되는 폐색성 혈전증 모델로, 무균 폐쇄 혈관 시스템의 맥락에서 혈소판 활성화 및 응집을 보고합니다. 이 모델은 산화환원 유도 내피 세포 손상을 기반으로 하며, 이는 항응고제 및 항혈소판 약물 모두에 간단하고 민감합니다. 혈류를 막는 혈전이 발생하는 데 필요한 시간은 혈전성 질환과 관련된 혈관 손상, 혈소판 활성화 및 응집을 정량적으로 측정합니다. 우리는 이 FeCl3 유도 혈관 혈전증 모델을 크게 개선하여 최소한의 변동으로 데이터의 재현성을 높였습니다. 여기에서는 모델을 설명하고 혈전증 연구에서 이 모델의 유용성을 입증하는 여러 실험 설정의 대표 데이터를 제시합니다.

경동맥의 동맥 혈전증 모델 C57BL6 배경으로 마우스에서 우리는 출발점으로 1 분 동안 혈관을 치료하기 위해 7.5 % 50ml을 사용하는 것이 좋습니다. 7.5 %의 치료 50ml을에서 부상 영역과 정상 혈관 벽의 경계는 쉽게 (참조 온라인 비디오 1) 현미경으로 식별, 내피 층이 크게 손상되었음을 시사한다. 혈전은 50ml을 처리 즉시 형성하고, 손상 후 모든 WT C57BL6 마우스 1 분에서 관찰된다. 초기 형성된 혈전이 불안정하며, 그 부분은 일반적으로 얻어 혈류 세정되므로, 형성된 혈전을 2 작아짐 - 손상 후 3 분. 필터 용지를 제거한 후 4 분,이 이후 형성된 혈전은 안정적이며 일반적으로 씻어되지 않습니다 - 혈전 3에서 확대하기 시작합니다. 평균 폐색 시간 (N = 14)을 C57BL6 마우스에서 11.3 ± 3.16 ...

우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 생체 내 현미경(intravital microscopy)으로 분석했을 때 재현성이 높은 결과를 얻기 위해, 마우스 경동맥 모델에서 염화 철(ferric chloride)로 유도된 혈전증을 생성하는 것입니다. 이러한 마우스 모델은 혈소판 활성화 및 폐쇄 혈관계의 응집과 관련된 다양한 질병이나 유전적 장애에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방법이 간단하고 항응고제 및 항혈소판제 모두에 민감하며, 다른 기술들과 결합하여 사용할 수 있다는 점입니다.이 방법은 혈전증의 병태생리학에 대한 귀중한 통찰을 얻고, 새로운 메커니즘과 치료법을 발견하며, 표적 나노 의약품을 포함한 신약이 혈전증에 미치는 영향을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 정확한 혈류 정지 시간을 얻기 위한 전략을 학습하는 데 있어 이 방법의 시각화는 매우 중요합니다. 발가락 꼬집기 반응이 없음을 확인한 후, 소형 전기 동물용 클리퍼를 사용하여 8~12주령 마우스의 목과 상흉부 털을 제거하십시오.동물의 눈에 중성 페트롤리움 안연고를 바르고, 15cm 조직 배양 플레이트 뚜껑 위에 마우스를 앙와위로 고정하여 테이프로 붙입니다. 4-0 봉합사를 절치에 감고, 목이 곧게 유지되도록 봉합사 끝을 뚜껑에 테이프로 고정합니다. 그런 다음 동물을 수술용 광원 아래로 옮기고, 알코올 솜을 사용하여 수술 부위를 소독합니다.다음으로, Micro-Adson 포셉을 사용하여 피부를 잡고, 수술용 가위로 2~3mm 정도 절개합니다. 포셉으로 절개 부위를 잡은 상태에서 가위 날을 닫은 채로 삽입하고, 가위를 피하 조직을 통해 흉골병 방향으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 가위 날을 벌려 피하층으로부터 피부를 분리합니다.이제 흉골병에서 설골까지 정중선 절개를 가한 후, 미세 지혈집게와 Graefe 포셉을 사용하여 악하선 사이의 얇은 근막을 둔성 박리합니다. 기관이 보이면 포셉으로 흉골병 우측의 연조직을 잡고, 지혈집게를 근막 아래 2시 방향으로 삽입합니다. 지혈집게의 집게 부분을 벌려 주변 조직으로부터 경정맥을 분리합니다.그런 다음, 우측 경정맥이 노출될 때까지 근막, 연조직 및 피부를 통해 2시 방향으로 절개를 계속합니다. 이제 100 µL의 rhodamine 6G 용액이 들어 있는 1 mL 주사기에 30-gauge 바늘을 부착하고, 니들 홀더를 사용하여 바늘 끝의 2~3 mm 부분을 90도로 구부립니다. 그런 다음, 한 손으로는 주사기를 잡고 다른 한 손으로는 Graefe 포셉으로 경정맥 원위부의 연조직을 잡은 상태에서 바늘을 혈관 내로 삽입합니다.포셉으로 바늘을 고정한 후, rhodamine을 주입합니다. 혈소판 표지 용액을 모두 투여하면, 지혈 집게(hemostat)를 벌려 포셉 아래로 삽입하여 주입 부위의 혈관벽을 집어 출혈을 방지합니다. 그 다음, 6-0 봉합사를 사용하여 주입 부위를 결찰합니다.좌측 악하선 주변의 연부 조직과 근막을 둔하게 박리하고, 선을 7시 방향으로 당겨 좌측 흉쇄유돌근을 노출시킵니다. 그런 다음, 좌측 흉쇄유돌근과 견갑설골근 및 흉설골근 사이의 근막을 기관의 좌측까지 둔하게 박리합니다. 근막이 제거되면, 15cm 길이의 6-0 silk 봉합사가 달린 바늘을 흉쇄유돌근 중앙 아래로 통과시킨 후, 봉합사의 양 끝을 10시 방향의 외측으로 당깁니다.흉골설골근과 견갑설골근을 둔탁하게 분리하여 경동맥을 노출시킵니다. 그런 다음, 지혈집게를 사용하여 경동맥에 닿지 않도록 주의하며 경동맥 주변의 연부 조직을 분리합니다. 미세 팁 핀셋을 사용하여 미주신경과 동맥을 피하면서 경동맥 주변의 외측 근막을 들어 올립니다.그 다음, 또 다른 미세 핀셋을 사용하여 경동맥과 미주신경 사이의 근막을 천공합니다. 이제 둔한 갈고리를 구멍으로 통과시켜 경동맥을 조심스럽게 들어 올리고, 미세 핀셋을 동맥 아래로 밀어 넣습니다. 갈고리와 핀셋을 동맥을 따라 서로 반대 방향으로 움직여, 혈관 주위 조직으로부터 외막 연조직을 약 5mm 정도 벗겨냅니다.그다음, U자형 플라스틱 조각을 식염수로 헹구고, 갈고리를 사용하여 동맥을 부드럽게 들어 올려 동맥 아래에 플라스틱을 배치합니다. 이 플라스틱은 배경 형광을 차단하여 염화철 용액이 주변 조직으로 확산되는 것을 방지하며, 현미경 하에서 경동맥만 보이도록 합니다. 즉시 경동맥에 식염수 두세 방울을 떨어뜨려 수분을 공급합니다.그 후, 마우스를 10X 수침 렌즈가 장착된 형광 현미경 스테이지 위로 옮기고, 렌즈와 동맥 사이의 공간을 식염수로 채웁니다. 이제 디지털 비디오 녹화 소프트웨어 애플리케이션을 실행하여 정상 혈관의 이미지를 획득합니다. 혈관벽이 통합되어 있고 손상이 없다면, 마우스를 Gibraltar 플랫폼으로 옮기고, 페이퍼 타월의 모서리를 사용하여 동맥에 닿지 않도록 수술 부위의 경동맥 주변 식염수를 조심스럽게 닦아냅니다.그 다음, 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 염화철(ferric chloride)이 포화된 여과지를 노출된 경동맥의 원위단 근처 상단에 직접 옮겨 놓습니다. 여과지를 노출된 경동맥의 원위단 가까이에 배치해야 하며, 손상 후 단계에서 혈류를 관찰할 수 있도록 근위측에 짧은 분절을 남겨둡니다. 1분 후 여과지를 제거하고, 최소 2 mL의 식염수로 동맥을 헹굽니다.마우스를 현미경 스테이지로 다시 옮기고, 혈관의 이미지를 획득합니다. 형광 혈소판의 축적을 통해 혈전 형성을 확인할 수 있습니다. 처음 10분 동안은 매분 10초씩 혈관 이미징을 수행하고, 이후 실험 종료 시까지 2분마다 10초씩 이미징을 계속합니다.염화철 유도 손상 5분 후 조직 플라스미노겐 활성제(Tissue-type plasminogen activator)를 주입하면 처치 약 4분 후 혈전 용해가 시작됨을 확인할 수 있습니다. 형성된 혈전은 30분의 관찰 기간 동안 크기가 반복적으로 변화하는 것이 관찰되었으나, 혈소판 매개 혈전이 완전히 제거되지는 않았습니다. PAR4 절단을 유의하게 지연시키는 다클론성 PAR4 항체로 처치하면 염화철 유도 경동맥 혈전증 모델에서 폐쇄성 혈전이 형성될 때까지 걸리는 시간이 상당히 연장됩니다.혈소판이 아닌 적혈구 표지 실험에 따르면, 염화철로 유도된 혈전은 전적으로 혈관벽 부착 혈소판으로 구성되지만, 적혈구 또한 혈전 내에 갇히게 되며 시간이 지남에 따라 혈전의 형태와 폐쇄 특성에 기여하는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 장간막 동맥과 정맥의 손상 후 약 15초 이내에 초기 혈전이 시각화되는 반면, 장간막 혈관 내 혈전 형성 속도는 장간막 정맥에서 약 17분, 장간막 동맥에서 거의 24분까지 크게 지연되는데, 이는 최소한 부분적으로는 장간막 혈관 주변의 지방 조직을 통한 염화철의 확산 때문입니다.숙련도에 따라 다르지만, 이 염화제이철 유도 혈전증 모델을 적절하게 수행한다면 약 30분에서 60분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 중요한 점은, 이 측정법이 손상 발생 시점부터 완전 폐쇄까지 경과된 시간을 측정한다는 것이며, 정확한 결과를 얻기 위해서는 혈류에 대한 정밀한 관찰이 필수적이라는 점을 기억하는 것입니다. 이 모델은 외인성(ex-vivo)으로 처리된 야생형 혈소판 수혈과 결합하여 혈소판 특이적 결손(knockout)을 모방함으로써, 조절 경로와 혈소판의 기능을 정의하는 데 활용될 수 있습니다.이 기술은 혈관 생물학 분야의 연구자들이 혈전증에서 혈소판의 역할뿐만 아니라, 다양한 다른 혈관 내피 염증 상태에서의 역할까지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는, 생체 내 현미경을 사용하여 매우 재현성 높은 결과를 얻기 위한 마우스의 염화철 유도 경동맥 혈전증 모델 구축 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 염화철은 매우 위험할 수 있으므로, 이 모델을 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

ferric-chloride-induced-murine-thrombosis-models

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스의 FeCl3 유도 혈전증 모델이 여기에 설명되어 있습니다. 장간막 혈관에 대한 생체 내 현미경 관찰과 경동맥의 혈류 측정을 통해 혈전 성장을 모니터링하는 방법이 제시됩니다.

철 염화물에 의한 경동맥 및 장간막 용기에 혈전증 마우스 모델

여기, 우리는 큰 동물 혈관 손상 모델에서 잘 특징이 고 일반적으로 사용 되 작은 동물 제 2 철 염화 유도 (FeCl3) 경 동맥 상해 모델에 사용 하기 위해 필요한 수정 제시. 결과 모델은 예방 및 thrombolytic 약리 및 기계적 개입의 전 임상 시험 평가 위해 활용할 수 있습니다.

제 2 철 염화 유도 개 경 동맥 혈전 증: 혈관 손상의 큰 동물 모델

본 프로토콜은 동맥 혈전증을 유도하기 위해 FeCl3 매개 손상을 사용하는 방법, 및 전자 현미경 분석을 위해 혈전증의 다양한 단계에서 동맥 손상 샘플을 수집하고 준비하는 방법을 설명합니다.

염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집

본 연구는 실크 봉합법과 레이저 반점 조영 영상 및 고해상도 초음파를 결합하여 평가를 위해 실크 봉합법과 레이저 반점 조영 영상 및 고해상도 초음파를 결합하여 상시상동 혈전증을 재현 가능하고 최소 침습 모델로 확립하는 프로토콜을 제시합니다.

수정된 염화철 유도 상시상동 혈전증 형성

내피 활성화 및 일부 혈액 스테이시, Virchow의 깡패의 두 가지 구성 요소로 인해 정맥 혈전 형성 유형의 하부 대정 맥 결과의 내부 표면에 내피 활성화 전해 유도.

정맥 혈전증의 전해 하부 대정 맥 모델 (EIM)

하부 대정 맥 혈전증의 마우스 전체 스태시스 모델은 정맥 벽 조직 및 혈전의 같지는 금액을 산출. 이것은 정맥 벽과 occlusive 혈전 사이에 만성 염증으로 급성에서 진행을 평가 상호 작용을 평가하기위한 유용한 입증되었습니다.

하부 대정 맥 혈전증의 마우스 완전한 스테이 시스 모델

지방 콘텐츠 분석은 정기적으로 murine 비만 모델을 이용한 연구를 실시하고 있습니다. 작은 동물 중부 표준시 이미징 및 분석의 신흥 방법은 종방향 세부 풍부한 지방이 콘텐츠를 분석 제공하고 있습니다. 작은 동물 중부 표준시 이미징, 분석 및 시각화를 수행하기위한 단계 절차에 의해 여기 세부 단계.

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조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

뇌내출혈의 전임상 모델은 임상 질환의 특정 측면을 모방하는 데 사용됩니다. 따라서 부상의 메커니즘과 잠재적인 치료 전략을 탐구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 뇌내 출혈의 두 가지 모델, 자가 혈액의 선조체내(기저핵) 주사 또는 콜라겐분해효소에 대해 설명합니다.

뇌출혈의 쥐과 모델로자가 혈액이나 클로스 트리 디움 콜라게나 제의 줄무늬 체 주입

암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

학습하세요 철 염화물로 유도한 쥐 경동맥 혈전증 모델을 통해 혈소판 활성화와 혈전 형성 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 항응고제 및 항혈소판 약물 평가에 민감하여 혈관 생물학 연구에 유용합니다.

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

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