Name: 유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 학습하세요 HIV-1 생산을 표적 RNA 분자의 효능과 독성을 평가하는 방법을. 293T 세포를 이용한 바이러스 생산, 세포 생존율, 면역 활성화 분석을 통해 신속하게 RNA 후보 물질을 선별할 수 있습니다.

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여기에 제시된 작품은 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다 (DCB-120266, PPP-133377와 AG에 HBF-348967을 부여).

1. 세포와 형질 <ol><li> 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 HEK 293T 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 세포 배양 배지에서 2 × 105 세포 / ㎖ 현탁액을 준비한다. 의 각 웰에 세포 현탁액의 500, 100 및 1,000 μl를 추가, 24도, 96도, 12 웰 플레이트, 바이러스 생산, 세포 생존 및 면역 활성 ​​분석, 각각 (그림 2A)합니다. </li><li> 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2와 37 ° C에서 / O N 그들을 품어. 50~70%의 포화 상태로 세포를 성장. </li><li> 형질 전환 계획에 따르면, 1.5 ml의 마이크로 튜브 (예, 그림 2B)에 테스트 RNA를 자신의 컨트롤의 희석을 준비합니다. <ol><li> 바이러스 생산 분석를 들어, HIV-1 발현 플라스미드의 10 NG / μL 희석을 준비하고 각 튜브에 10 μl를 추가합니다. 다음 5 μM 시험의 RNA 희석하여 음성 대조군 RN 준비A. 25 또는 100 nM의 최종 농도에 해당하는 튜브에 각 시험 RNA 및 음성 대조군 희석 2.5 또는 10 μl를 추가합니다. </li><li> C : 세포 생존력 분석을 위해 5 μM 시험의 RNA 희석하고 양성 대조군 RNA, 저 분자량 폴리 I의 10 ㎎ / ㎖의 희석을 준비한다. 각각 100 nm의 또는 200 μg의 / ml의 최종 농도에 해당하는 튜브에 테스트 RNA 또는 양성 대조군 RNA 희석 2 μl를 추가합니다. </li><li> 면역 활성 시험의 경우, 시험 RNA 또는 단계 1.3.2에서 제조 한 양성 대조군 RNA 희석 20 μl를 추가합니다. 각각 100 nm의 또는 200 μg의 / ml의 최종 농도에 해당하는 튜브에. 단계 1.3.1에 ​​대한 ng를 25, 100의 최종 금액을주고, 테스트 RNA 발현 플라스미드를 들어 시험의 RNA의 5 μM 희석 대신에 10 NG / μL 희석을 준비 :합니다. 및 (100)는 단계 1.3.2에 대한 ng를. 및 1.3.3. </li></ol></li><li> 바이러스 성 자극에 대한 각각의 형질 튜브에 DMEM 50, 25 또는 75 μl를 추가각각 uction, 세포 생존 및 면역 활성 분석. 바이러스 생산 분석법 다음 단계 전에 생물학적 안전 수준 3 (BSL3) 실험실 세포 형질 제조 튜브를 가져온다. </li><li> 트랜 튜브에 형질 전환 시약 순차적으로 2 μl를 추가하고 복합체 형성 할 수 있도록 15 ~ 20 분을 품어. 특정 형질 전환 시약 재료의 표를 참조하는 데 사용합니다. </li><li> 적가 세포 배양 플레이트의 상응하는 위치에 각각의 마이크로 튜브에서 전체 형질 전환 혼합물을 추가한다. 부드럽게 소용돌이와 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 세포 배양 판 (그림 2C)에서 HIV-1 생산 (섹션 2), 세포 생존 능력 (섹션 3) 및 면역 활성화 (섹션 4)를 측정한다. </li></ol> 2. 바이러스 생산 분석 <ol><li> 배양기에서 24 웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 BSL3 세포 배양 플레이트의 내부 소용돌이 부드럽게후드. A는 HIV-1 생산을 정량화하는 데 사용됩니다 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 잘 대응하는 각 우물에서 뜨는 150 μl를 전송합니다. 주 : 일반 바이러스 정량 분석은 효소 면역 분석법 (ELISA) (20), 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) (21)에 의한 바이러스 RNA를 정량하여 HIV-1 캡시드 단백질 (P24)의 발현을 측정하여 활성을 측정 포함 에이즈-1 RT 효소. 2.2 2.5은 HIV-1 RT 활동 13,15,16를 정량화하는 방법을 설명하는 단계를 반복합니다. </li><li> 전송 중단 바이러스 칵테일 15 (표 1) 25 μl를 함유하는 96 웰 플레이트에 웰 대응하는 상등액 5 μL. RT에서 5 분 혼합물을 품어하고 방사능 워크 스테이션에 접시를 전송합니다. 참고 : 2.2 단계. 방사능 워크 스테이션이 BSL3 실험실에서 사용할 수없는 경우에만 필요합니다. 플레이트로부터 제거 할 필요가없는 경우BSL3 실험실, 2.3 단계로 진행합니다. 방사성 칵테일의 25 μL 대신 바이러스 / 방사성 붕괴 칵테일 (표 1) 50 μl를 추가합니다. </li><li> 방사성 칵테일 (15) (표 1)를 준비하고, 바이러스 뜨는 및 중단 칵테일의 각 웰에 25 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 스팟 5 유리 섬유 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) filtermat 용지에 해당하는 사각형 상 반응 혼합물의 μL 및 관광 명소가 10 분 동안 건조 할 수 있습니다. 두 개의 샘플들이 직접 서로 보더 없도록 다른 모든 사각형 반응 혼합물 스팟. 이 단계 2.6 분 (CPM) 당 수를 결정할 때 샘플 사이의 크로스 오버를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 종이 95 % 에탄올이 1 분간 세척 한 다음 염수 배 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼 (표 1)을 5 분 동안 5 배 씻는다. 종이 건조 및 샘플 가방을 봉인 할 수 있습니다. </li><li> 클립 샘플 가방 공동카세트에 filtermat 용지를 ntaining 및 마이크로 플레이트 섬광 계수기에 카세트를 삽입합니다. 실험에 사용 [32 P] dTTP를의 일괄 제공 기준 날짜 (32) P에 대한 CPM을 읽고 카운터를 설정합니다. 플레이트지도를 이용하여 판독하고 카운터를 시작하는 샘플을 선택한다. </li><li> 모든 바이러스의 정량 방법, 인접 음성 대조군으로 각각 테스트 RNA에 대해 얻어진 값을 나누어 테스트 RNA를 각 복제에 대한 HIV-1 생산의 억제 백분율을 얻기 위해 (100)에 의해이 값을 곱한다. 다른 농도에서 다른 테스트 RNA를 비교 결과의 일례는도 3에 제공된다. </li></ol> 3. 세포 생존 분석 <ol><li> / ml의 MTT (3- [4.5 디메틸 -2- 티아 졸릴] -2,5- 디 하이드로 -2H- 테트라 졸륨 브로마이드) 둘 베코 인산염 완충 식염수에 희석 (인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고 5 mg의 20 μL를 추가 각 웰에 DPBS). F 번호판을 품어또는 37 ℃에서 3 시간. </li><li> 세제 (1 % NP-40, 이소프로판올 4 mM의 염산)도 각으로 산성화 이소프로판올 150 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 마이크로 플레이트 분광 광도계에서 570 nm에서 흡광도를 결정합니다. </li><li> 인접 형질 전환 제어에 의해 각각의 샘플에 대해 얻어진 값을 나누어 각각 양성 대조군 및 테스트 RNA에 대한 상대 MTT 대사를 계산한다. 다른 테스트의 RNA와 양성 대조군을 비교 한 결과의 일례는도 4에 제공된다. </li></ol> 4. 면역 활성화 분석 <ol><li> 인큐베이터에서 12 웰 플레이트를 제거하고 문화 매체를 대기음. 부드럽게 DPBS로 두 번 세포를 씻어 아니라 각 (프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제, 표 1 포함) 차가운 용해 버퍼 (22)의 70 μl를 추가합니다. 얼음에 10 분 동안 접시를 품어. </li><li> 마이크로 튜브에 세포 용 해물을 전송하고 빠른 침지하여 그들을 동결액체 질소에서 튜브. 샘플은 해동 3의 총이 더 동결 해동 사이클을 반복 할 수 있습니다. </li><li> 세포 파편을 펠렛, 4 ° C, 15,700 XG에서 15 분 동안 해물을 원심 분리기. 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 전송하고 쿠마 블루 (브래드 포드) 메소드 (23, 24)를 사용하여 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 10 % 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에서 각 샘플로부터의 단백질 75 μg의 해결 이전 25,26 바와 같은 니트로 셀룰로오스 막에 옮긴다. </li><li> 막에 전기 및 전송 후, 증류수에 세척 한 다음 1 분 동안 폰소 s (표 1)에서 막을 배양하여 단백질 밴드를 보여준다. 80, 55 kDa의에서 막을 잘라 가이드로 밴드와 단백질 사다리를 사용합니다. 주의 : 단계 4.4 샘플 16 × 18cm 34 kDa의 아래로 2 겔을 실행할 수 있으며,이 지정된 위치에 막을 잘라 통해 절단되지 쉽다 있도록관심의 밴드. 대안 적으로, 몇몇 겔 막을 절단 피하기 위해 동일한 샘플을 실행할 수있다. </li><li> 0.05 % 트윈 20 (TBST, 표 1)를 포함하는 TBS 버퍼로 폰소 s 염색을 세척 할 것. 완전히 막 다루 5 % 무 지방 우유로 TBST를 추가합니다. 1 시간 동안 교반하면서 RT에서 막을 인큐베이션. </li><li> 막 부화 O / N ADAR1 (110 및 150 kDa의) 포스 PKR (62 kDa 이상) 및 포스 IRF3 (47 kDa의)에 대하여 1000 년 1로 희석하고 3 % 소 혈청 알부민 TBST (BSA)과 항체에있어서, 각각 멤브레인의, 상단 중앙과 하단 부분에 대해. </li><li> 멤브레인은 TBST 5 분 동안 5 배 1 시간 동안 (5000 년 1로 희석) 5 % 무 지방 우유와 퍼 옥시 다제 표지 염소 항 - 토끼 보조 항체와 TBST에 품어 씻으십시오. </li><li> TBST 5 분 동안 막 배를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 영화에 밴드를 시각화하는 전기 화학 발광 (ECL) 솔루션을 적용 할 수 있습니다. </li><li> 필름의 단백질 밴드를 가시화 한 결과, 항체 박리 용액으로 10 분 동안 멤브레인의 중간 및 하단 부분을 세척한다. 및 IRF3 (500 1) 총 PKR에 대해 3 % BSA와 TBST에서 세포막 O / N 및 항체를 품어 (1,000에서 1에서) 각각 중앙과 하단 부분에 대해. 반복 4.8 단계를 반복합니다. 4.9. PKR 막 (중간)에 대한 항 - 토끼 이차 항체 대신에 퍼 옥시 다제 표지 된 염소 항 - 마우스를 사용. </li><li> TBST 5 분 동안 막 5 배의 바닥 부분을 세척하고 (5000 년 1로 희석) 굴지에 대한 항체와 1 시간 동안 3 % BSA와 TBST에서 막을 품어. 반복 4.8 단계를 반복합니다. 4.9. 항 - 토끼 이차 항체 대신에 퍼 옥시 다제 표지 된 염소 항 - 마우스를 사용. 다른 테스트의 RNA와 양성 대조군을 비교 한 결과의 일례는도 5에 제공된다. 사용되는 특정 항체 물질의 표를 참조. </li></ol>

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기재된 HIV-1 생산 분석법 HEK293T 셀들 (도 2)를 이용하여 수행하고, 효과적인 리보 자임 (13) shRNA를 10,29, siRNA를 30 및 U1i RNA 11,31 표적 부위를 HIV-1 RNA를 선별하는 데 사용되는 분석 비슷 하였다. HIV-1 생성을 정량화하기 위해 다양한 방법을 사용하여, 대부분의 연구는 후보의 RNA와 HIV-1 발현 플라스미드의 공동 형질 감염 후 바이러스 생산을 48 시간으로 측정했다. HIV-1의 제조 이후, 미성숙 비리 새로운 세포를 감염시킬 성숙한 비리,되기 위해 HIV-1 프로테아제하여 polyproteins의 단백질 분해 절단을 겪는다. 단계 2.2에 기재된 HIV-1 RT 효소 활성 분석 용. 역전사 효소 성숙 비리 만 활성화되어 있기 때문에 2.5., 생산과 성숙의 단계를 모두 평가된다. 반대로, 캡시드 단백질 및 바이러스 RNA 모두 성숙 및 미성숙 비리에 존...

현재 HIV-1 치료의 한계는 만성적 질환의 진행을 방지하기 위해 투여되어야한다는 것이다. HIV-1에 강한 T 림프구 또는 조혈 줄기 세포 이식, 약물 치료 -1,2-의 부재 HIV-1 복제의 장기간 제어를 제공하는 가능성을 가지며 또한 HIV-1 치료를 달성하기위한 효과적인 방법이 될 수있다 3. HIV-1 복제에 대해 내성 세포를 렌더링하기위한 한 가지 방법은자가 이식 동안 4 감염된 개인의 세포에 항 HIV-1 RNA를 또는 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것이다. 여러 후보 항 HIV-1 유전자는 단일 유전자에 HIV-1의 저항 현상을 방지하기 위해, 두 개 또는 세 개의 5 (6)의 조합에 일부 진입하여 임상 시험을 고안 하였다. 항 HIV-1 RNA를 인해 면역 반응을 유도하는 그들의 낮은 전위로하고 있기 때문에 결합 유전자 치료에 대한 상위 후보자들이다매우 짧은 유전자 서열로부터 전사된다. 일부 항 HIV-1 RNA를이 바이러스 항목 및 통합을 목표로 설계되었습니다. 그러나, 대부분의 항 HIV-1 RNA를는 바이러스 라이프 사이클 후 통합 단계 (도 1)을 대상. 후 통합 억제제는 리보 자임 (7), shRNA를 8 U1i RNA를 9로는 HIV-1 조절 단백질 문신 또는 계 1, 및 안티센스 기반의 RNA를 대상으로 HIV-1 RNA에 다른 사이트를 대상으로, 미끼 RNA를 포함. 항 HIV-1 RNA를의 효능을 비교하기 위해 사용 된 방법은 유전자 후보 RNA를 코딩하는 바이러스 성 일시적 후보의 RNA를 발현하는 플라스미드로 형질 감염된 세포에서 생산 및 HIV-1 발현 플라스미드를 측정 형질 세포에서 바이러스 복제를 모니터링 포함 10 -13. 우리는 이전에 새로운 리보 자임 대상 사이트 13 ~ 15에 대한 HIV-1 RNA를 선별하는 HIV-1 생산 분석을 사용했다. 이러한 방법은 RNA 인 이후의 포맷을 최적화하기 위해 정제 된간섭은 분자의 shRNA로 플라스미드 DNA로부터 발현 또는 합성 siRNA를 16로 전달. 상기 분석은 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포로부터 성숙 바이러스의 생산을 측정하고 (도 1) HIV-1 복제 사이클 후 통합 단계를 타겟팅 억제제의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 사전 통합 단계를 타겟팅 억제제를 들면, TZM-BL 세포 감염 분석 (17)와 같은 다른 분석은 항 바이러스 효능을 평가하기 위해 필요하다. 병원에서 항 HIV-1 RNA를의 전달을위한 주요 안전 문제는 인간의 RNA 또는 단백질과 선천성 면역 센서의 작동에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 항 HIV-1 siRNA의 독성을 평가하기 위해 다른 세포주 16 세포 생존력 분석을 이용했다. 우리는 또한 이중 가닥 RNA 면역 센서의 활성화를 측정 RNA 활성화 단백질 키나제 R (PKR) 및 수용체 3 (TLR3) 등 수신자뿐 아니라 전인터페론의 Pression의 유전자, ADAR1의 P150을 자극. 이러한 분석은 항 HIV-1 RNA를 효능은 세포 생존 또는 면역 센서의 활성화에 대한 간접적 인 효과에 기인 아니라는 것을 확인하는데 사용될 수있다. 또한 발전에서 잠재적 인 독성과 후보 RNA를 제외 유용하다. 다음 프로토콜에서, 절차는 새로운 치료의 RNA를 확인하고, 기존의 형식을 설명하는 최적화. 방법은 HIV-1 복제의 심사 RNA 기반 후 통합 억제제에 유용과 같은 바이러스 성 RNA 18 CRISPR의 레브 매개 수출을 대상으로 작은 분자와 같은 다른 후 통합 억제제를 화면에 적용 할 수 / 설계 카스 시스템은 통합 대상으로 HIV-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE 헬스케어</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE 헬스케어</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트, 96 웰, 24 웰, 6 웰.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>저분자량 Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>합성 RNA용 transfection 시약</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>RNA 발현 플라스미드용 transfection 시약</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>poly(A) RNA template&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 DNA 프라이머</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE filtermat 종이&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 섬광 계수기</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 분광 광도계</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer tablets</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>겔 러닝 챔버</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Semi-dry transfer cell</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>항체 스트리핑 솔루션</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PI32106 Dr. B.L. Bass</td>의<td>ADAR1 항체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phospho-T446-PKR 항체</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>phospho-S396-IRF3 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>PKR 항체</td><td></td><td></td><td>Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>IRF3 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Actin 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-labeled 염소 anti-rabbit</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-labeled goat anti-mouse</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 hiv-1 생산을 표적 rna를의 효능 및 독성 평가

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 소형 RNA 치료제는 유전자 치료의 주요 후보 중 하나이며 HIV-1 감염에 대한 약물 치료제로 사용될 가능성이 있습니다. 통합 후 억제제에는 리보자임(ribozymes), 짧은 헤어핀(sh) RNA, 작은 간섭(si) RNA, U1 간섭(U1i) RNA 및 RNA 압타머가 포함됩니다. 이들 중 다수는 HIV-1 발현 플라스미드와 함께 일시적인 co-transfection assay를 사용하여 확인되었으며 일부는 임상 시험으로 진행되었습니다. 효능 측정 외에도 small RNA는 인간 RNA의 발현에 영향을 미치고, 세포 성장 및/또는 분화를 변경하고, 선천성 면역 반응을 유도할 수 있는 잠재력에 대해 평가되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에서는 HIV-1 복제 주기에서 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하기 위해 고안된 일련의 일시적인 transfection assay가 설명됩니다. 당사는 이러한 분석을 사용하여 새로운 리보자임을 식별하고 HIV-1 RNA를 표적으로 하는 shRNA 및 siRNA의 형식을 최적화했습니다. 이 방법은 새로운 항 HIV-1 RNA를 스크리닝하는 데 유용하고 HIV-1 복제의 다른 통합 후 억제제를 스크리닝하는 데 적용할 수 있는 빠른 분석 세트를 제공합니다.

절차의 일반적인 개략도 세 시험 RNA를도 2b에 제공되는 제어 RNA위한 예시 형질 계획도 2에 도시되어있다. 바이러스 생산 및 세포 생존 분석을 위해 각 테스트 구조에 대한 판독은 음성 대조군으로 정규화된다. 각 시험 RNA가 인접 대조군에 정상화되도록 복제가 세트로 형질 감염된다. 이것은 예를 들어, 음성 대조군 모두 제 형질, 경우 발생할 수 착화 및 형질 전환 사이의 시간과 관련된 부정확 한 데이터를 피하기 위해 수행된다. HIV-1 면역 반응 27,28 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 생존 및 면역 활성화 검정법은 HIV-1 발현 플라스미드의 첨가없이 수행된다. HIV-1 RNA의 보존 위치 (위치 ​​1498년에서 1415년까지 타겟팅 간섭 RNA 분자의 최적의 길...

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

본 절차의 전반적인 목적은 HIV-1 생성을 표적으로 하는 새로운 RNA의 효능과 독성을 비교하는 것입니다. 이 방법은 short hairpin 또는 small interfering RNA, ribozyme, RNA decoy와 같이 HIV-1 유전자 또는 약물 치료에 사용할 수 있는 새로운 RNA 분자를 식별하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 가지 새로운 RNA 설계를 빠른 시간 내에 동시에 스크리닝할 수 있다는 점입니다.이 방법은 HIV를 위한 새로운 RNA 약물 또는 유전자 치료제를 평가하기 위해 설계되었지만, 저분자 화합물이나 CRISPR 작업과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 저희는 처음에 항-HIV 효과를 가진 다수의 리보자임을 스크리닝하기 위한 실험을 준비하던 중에 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 먼저, 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 함유된 DMEM에서 human embryonic kidney 293T 세포를 2×10⁵ cells/mL 농도의 현탁액으로 준비하십시오.바이러스 생성, 세포 생존율 및 면역 활성화 분석을 위해 각각 24-well, 96-well, 12-well 플레이트의 각 웰에 500, 100, 1,000 µL의 세포 현탁액을 첨가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞은 후, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 세포 밀도가 50%에서 70%가 되도록 합니다. 바이러스 생성 분석의 경우, HIV-1 발현 플라스미드를 10 ng/µL 농도로 희석하여 준비하고 각 분석 튜브에 10 µL씩 첨가합니다.다음으로, 테스트 RNA와 음성 대조군 RNA를 5 µM 농도로 희석하여 준비합니다. 그런 다음 최종 농도가 25 nM 또는 100 nM이 되도록 각각의 테스트 RNA와 음성 대조군 희석액을 해당 튜브에 2.5 µL 또는 10 µL씩 첨가합니다. 세포 생존력 분석의 경우, 테스트 RNA를 5 µM 농도로 희석하고 양성 대조군 RNA인 저분자 poly(I:C)를 10 mg/mL 농도로 희석하여 준비합니다. 테스트 RNA 또는 양성 대조군 RNA 희석액을 해당 튜브에 2 µL씩 첨가하여 최종 농도가 각각 100 nM 또는 200 µg/mL가 되도록 합니다.면역 활성화 분석을 위해, 세포 생존력 분석을 위해 준비한 테스트 RNA 또는 양성 대조군 RNA 희석액 20 µL를 각각 최종 농도가 100 nM 또는 200 µg/mL가 되도록 해당 튜브에 추가합니다. 그 다음, 바이러스 생산, 세포 생존력 및 면역 활성화 분석용 각 형질전환 튜브에 DMEM을 각각 50, 25 또는 75 µL씩 추가합니다. 바이러스 생산 분석의 경우, 다음 단계로 넘어가기 전 세포와 준비된 형질전환 튜브를 생물안전 3등급(BSL-3) 실험실로 옮깁니다.트랜스펙션 시약을 트랜스펙션 튜브에 순차적으로 2 µL씩 첨가하고, 복합체가 형성되도록 15~20분 동안 배양합니다. 각 마이크로튜브의 트랜스펙션 혼합물 전체를 세포 배양 플레이트의 해당 위치에 한 방울씩 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 섞어준 후, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양합니다.바이러스 생성 분석을 수행하려면, 24-웰 세포 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후 BSL-3 세포 배양 후드로 옮깁니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 섞은 다음, 각 웰의 상층액 150 µL를 HIV-1 생성을 정량하는 데 사용할 96-웰 평저 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 또한, 25 µL의 바이러스 파괴 칵테일이 들어 있는 96-웰 플레이트의 해당 웰에 상층액 5 µL를 옮깁니다.혼합물을 상온에서 5분 동안 배양한 후, 플레이트를 방사능 작업대로 옮깁니다. 다음으로 방사성 칵테일을 준비하여, 바이러스 상청액과 파쇄 칵테일이 들어 있는 각 웰에 25 µL씩 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.반응 혼합물 5 µL를 유리 섬유/DEAE 필터 매트 종이의 해당 칸에 점적하고, 10분 동안 건조시킵니다. 2x SSC 버퍼를 사용하여 종이를 5분씩 5회 세척한 후, 95% ethanol로 1분씩 2회 세척합니다. 종이를 완전히 건조시킨 후 샘플 백에 넣어 밀봉합니다.필터 매트 페이퍼가 들어 있는 샘플 백을 카세트에 고정하고, 카세트를 마이크로플레이트 신틸레이션 카운터에 삽입합니다. 그런 다음 카운터를 작동시킵니다. 모든 바이러스 정량 방법에서, 각 테스트 RNA에 대해 얻은 값을 인접한 음성 대조군 값으로 나누고, 이 값에 100을 곱하여 각 테스트 RNA 반복 실험의 HIV-1 생성 억제 백분율을 구합니다.세포 생존능 분석을 수행하기 위해, 인큐베이터에서 96-웰 플레이트를 꺼낸 후 각 웰에 5 mg/mL MTT와 DPBS 20 µL를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 각 웰에 세제가 포함된 산성 이소프로판올 150 µL를 첨가하고, 플레이트를 상온에서 2시간 동안 배양합니다.그 다음 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 570 nanometers에서의 흡광도를 측정합니다. 각 샘플에서 얻은 값을 인접한 transfection 대조군 값으로 나누어 각 양성 대조군과 테스트 RNA의 상대적 MTT 대사량을 계산합니다. 면역 활성 분석의 경우, 12-well 플레이트를 배양기에서 꺼낸 후 배양액을 흡입 제거하고 DPBS를 사용하여 세포를 부드럽게 두 번 세척합니다.그런 다음 프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 포함된 차가운 용해 버퍼 70 µL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 세포 용해물을 마이크로튜브로 옮기고, 튜브를 액체 질소에 담가 급속 동결시킵니다. 샘플을 해동한 후, 두 번 더 동결-해동하여 총 세 번의 동결-해동 사이클을 수행합니다.다음으로, 세포 찌꺼기를 침전시키기 위해 용해물을 15,700 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 전기영동 및 막 전이를 거쳐, 막을 Ponceau S에 1분 동안 반응시켜 단백질 밴드를 확인합니다. 이후 이중 증류수로 세척합니다.밴드와 단백질 래더를 기준으로 막을 80 및 55 kilodaltons 지점에서 절단합니다. 이제 0.05% TWEEN 20이 포함된 TBS 또는 TBST를 사용하여 Ponceau S 염색액을 씻어냅니다. 5% 탈지분유가 포함된 TBST를 막이 완전히 잠기도록 추가하고, 실온에서 교반하며 1시간 동안 배양합니다.멤브레인을 3% BSA가 포함된 TBST로 옮기고, 멤브레인의 상단, 중단, 하단 부위에 각각 1:1,000으로 희석한 ADAR, phosphor-PKR 및 phosphor-IRF3 항체를 처리합니다. 4°C에서 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, TBST를 사용하여 멤브레인을 5분씩 5회 세척한 후, 5% 탈지분유가 포함된 TBST와 1:5,000으로 희석한 peroxidase 표지 goat anti-rabbit 2차 항체 용액으로 옮겨 1시간 동안 반응시킵니다.필름에서 단백질 밴드를 시각화한 후, 스트리핑 용액을 사용하여 막의 중간 부분과 하단 부분을 10분 동안 세척하고, 이어서 막의 중간 부분은 PKR 항체에, 하단 부분은 IRF3 항체에 배양합니다. 양성 대조군으로서, 텍스트 프로토콜에 따라 하단 막을 Actin 항체로 프로빙합니다. 세 가지 테스트 RNA와 하나의 대조군 RNA에 대한 예시 형질전환 계획이 포함된 분석의 일반적인 도식이 여기에 제시되어 있습니다.바이러스 생성 및 세포 생존율 분석을 위해, 각 테스트 작제물의 측정값은 음성 대조군을 기준으로 정규화되었습니다. HIV-1 strain NL4-3을 발현하는 플라스미드가 형질전환된 세포에서 HIV-1 생성 분석을 수행하여, 여기에 제시된 siRNA 중 하나를 공동 형질전환한 세포의 RT 활성 백분율을 long Dicer substrate nonsense siRNA가 형질전환된 세포와 비교함으로써 HIV-1 RNA의 보존된 부위를 표적으로 하는 RNA 간섭 분자의 최적 길이를 확인하였습니다. 확인된 가장 효과적인 siRNA를 사용하여, 형질전환된 세포의 MTT 대사 백분율을 측정하였습니다.이중 가닥 RNA인 poly(I:C)의 경우, 가장 높은 용량에서만 세포 생존율이 감소했습니다. HIV-1 RNA의 1498 부위를 표적으로 하는 siRNA는 길이에 관계없이 세포 생존율의 유의미한 감소가 관찰되지 않았습니다. Western blot으로 입증한 바와 같이, 동일한 RNA 세트를 면역 활성화 분석에서 평가하였습니다.poly(I:C)가 ADAR1-p150의 발현을 활성화하고 PKR 및 IRF3의 인산화를 유도하는 조건에서, 테스트한 모든 RNA에 대해 어떠한 불활성화 마커에서도 유의미한 영향이 관찰되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 7일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 형질전환을 위해 RNA와 DNA 모두 고품질로 준비하는 것이 중요합니다.또한, 적절한 음성 및 양성 대조군을 포함시키십시오. 본 절차 이후, 형질전환된 세포의 HIV 감염과 같은 다른 방법들을 사용하여 잠재적인 항-HIV 후보 물질의 장기적 효능과 독성을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 HIV RNA 내의 접근 가능하고 보존된 표적 부위를 식별하고, 이를 표적으로 하는 ribozyme, shRNA 및 siRNA의 형식을 최적화할 수 있었습니다.이 영상을 시청한 후에는 바이러스 생성 분석법을 통해 HIV 생성물을 표적으로 하는 새로운 RNA 후보 물질의 효능을 빠르게 스크리닝하고, 면역 활성화 및 세포 생존율 분석법을 통해 잠재적인 독성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. HIV 및 방사성 표지 뉴클레오타이드를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있음을 유념하십시오. 본 절차를 수행할 때는 반드시 인증된 생물 안전 및 방사능 실험실을 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현재 HIV - 1 전략은 바이러스 생활주기를 억제하지만, 효과적으로 감염을 근절하지 행동. 여기, 우리는 입증되는 감염된 세포의 게놈에서 설계 recombinase 수 효율적으로 소비세 통합 HIV - 1 proviral DNA.

인터뷰 : 진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1의 DNA 절단 Proviral

nanomole 친화력과 HIV - 1Ba - L gp120에 대한 몇 가지 2' - 플루오로 RNA의 aptamers는 RNA 라이브러리에서에 의해 고립...

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

HIV-1의 coreceptor 사용의 예측은 antiretroviral 약물, 즉 coreceptor의 antagonists의 새로운 클래스의 관리가 필요합니다. 그것은의 서열 분석에 의해 수행 될...

Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 녹아웃 이상의 많은 장점을 보유하고 광범위하게 유전자 기능 연구의 도구로 사용되었습니다. DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술의 발명은 장기적으로 가능한 inducible 유전자 최저했고, 또한 유전자 입을의 가능성을...

암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

여기에서 우리는 세포 독성을 설명하고 화합물의 신속하고 정확한 검사를 허용 한 라운드 감염의 분석은 세포 독성 (CC 50)을 결정하고, WT 및 약물 HIV-1 저항에 대한 IC 50 값.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

이 연구는 인실리코(in-silico ) 전략을 사용하여 Enumerated Etravirine이 HIV에 대한 유망한 치료제임을 확인했습니다. 분자 상호 작용 및 역학에 대한 우리의 발견은 가능한 HIV 치료 대안으로서 새로운 NNRTI의 합리적인 설계를 뒷받침합니다.

비뉴클레오티드 역전사효소 억제제의 정량적 구조-활성 관계, 활성 예측 및 분자 역학

학습하세요 HIV-1 생산을 표적 RNA 분자의 효능과 독성을 평가하는 방법을. 293T 세포를 이용한 바이러스 생산, 세포 생존율, 면역 활성화 분석을 통해 신속하게 RNA 후보 물질을 선별할 수 있습니다.

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