격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법

본 실험 절차의 전반적인 목표는 분리된 작동 상태의 쥐 심장에서 포도당 산화 및 지방산 산화의 심근 속도와 심장 수축 기능을 동시에 실시간으로 측정하는 것입니다. 이 방법은 심장이 에너지 수요의 급격한 변화에 대사적으로 어떻게 적응하는지, 그리고 병리적 조건에서 이러한 반응이 어떻게 영향을 받는지와 같은 심혈관 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 기질, 약물 또는 심장에 전달되는 호르몬의 성질 및 농도와 같은 환경 변수를 연구자가 완전히 제어할 수 있다는 점입니다. 시연은 미시시피 대학교 의료 센터(University of Mississippi Medical Center) 심혈관 레노 리소스 센터(cardiovascular Reno resource center)의 박사 후 연구원인 Bhavisha Bakrania가 진행합니다. 먼저, 관류 장치를 프라이밍하고 완충액에 산소를 공급하기 위해 펌프를 작동시키십시오.

재료를 준비한 후, 쥐를 마취하고 수술 준비를 합니다. 복부의 털을 깎아내고 측면으로 확장하는 정중선 절개를 실시합니다. 하대정맥에 접근하기 위해 위와 장을 옆으로 밀어내고 Heparin 200 USP units를 주입합니다.

5~10초 동안 기다린 후, 가위를 사용하여 횡격막과 흉곽의 측면을 절개하여 흉강 내부를 노출시킵니다. 다음으로, 손으로 심장을 조심스럽게 잡고 심장과 폐를 함께 적출합니다. 이때 대동맥궁과 상행 대동맥이 손상되지 않도록 주의하면서 하행 대동맥 높이에서 절단합니다.

심장과 폐를 얼음처럼 차가운 KH 버퍼가 채워진 해부 접시로 즉시 옮깁니다. 심장 박동이 멈춘 후, 1~2분 이내에 다시 박동을 시작하게 하려면 신속하게 작업하는 법을 익혀야 합니다. 이제 심장과 폐를 얼음처럼 차가운 KH 버퍼가 담긴 새 접시에 담급니다.

폐 조직의 큰 조각들을 빠르게 제거한 다음, 대동맥궁 바로 위쪽의 하행 대동맥을 절단합니다. 다음 단계들을 수행할 때는 방사성 물질 사용에 따른 필요한 예방 조치를 취하십시오. 이어서 핀셋을 사용하여 대동맥을 조심스럽게 열고 심장을 캐뉼라 위로 밀어 올립니다.

캐뉼라가 대동맥 경로를 지나치지 않도록 매우 주의하십시오. 이는 심장의 저관류 및 대동맥판막 손상을 유발할 수 있습니다. 이제 마이크로 클립으로 접합부를 고정하고 심장의 Lagendorff 관류를 시작하십시오. 서두르지 말고 3 0 silk 봉합사를 사용하여 대동맥을 대동맥 캐뉼라에 고정한 후 마이크로 클립을 제거하십시오.

그런 다음 폐정맥을 찾아 필요에 따라 심장 이외의 조직을 제거합니다. 좌심방을 캐뉼라에 고정할 수 있도록 충분한 조직을 남겨둡니다. 좌심방의 캐뉼라 삽입은 프로토콜에서 두 번째로 중요한 단계로, 캐뉼라가 잘못 삽입되거나 누출이 발생하면 수축력이 약해져 대사율 정량 분석에 영향을 줄 수 있습니다.

다음으로, 오른쪽 캐뉼라와 동일한 방식으로 좌심방 라인 캐뉼라를 준비합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 폐정맥의 입구를 조심스럽게 잡고 심장을 심방 캐뉼라 위로 밀어 올립니다. 대동맥을 굽히거나 심장에 과도한 무리가 가지 않도록 주의하며 필요에 따라 조직을 이동시킵니다.

그 다음 3 0 실크 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다. 마지막으로, 대동맥 라인을 작동 모드로 전환함과 동시에 심방 라인을 엽니다. 만약 좌심방에서 완충액이 누출되면, 심방 라인을 닫고 다시 Lagendorff 모드로 전환하십시오.

그 다음, 캐뉼라를 더 단단히 고정하기 위해 봉합사를 추가로 사용하고 다시 작동 모드로 전환해 봅니다. 실험에 카테터를 이용한 LV 기능의 직접 측정이 포함된 경우, 26 gauge 바늘을 사용하여 LV apex를 천자한 후, 압력-부피 카테터를 삽입하고 샤프트를 LV 종축에 맞춥니다. 이어서 원위 전극 E1을 대동맥판막 바로 아래의 심내막 경계에 인접하게 배치하고, 근위 전극 E4를 심실벽 바로 안쪽에 배치합니다.

이제 심장을 워터 재킷 챔버(water jacketed chamber)에 밀폐합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 기능적 파라미터 모니터링을 시작하십시오. 베이스라인 파라미터가 최소 5분 동안 안정되면 데이터 기록을 시작합니다.

관상동맥 유량을 측정하려면, 유출액 20 milliliters를 수집하는 데 걸리는 시간을 기록하십시오. 그다음 3방향 스톱콕을 통해 유출액 2 milliliters를 주사기로 취하고 나머지는 버립니다. 해당 2 milliliter 샘플을 즉시 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 포도당 산화 속도를 결정하기 위해 0.5 milliliter 분취액을 취하십시오.

나머지는 얼음 위에 보관하십시오. 주기적으로 관상동맥 유출액 샘플 채취를 계속하고, 종료 전 심방 라인에 고장성 식염수 10 micro liters를 주입하십시오. 캐뉼라에 연결되기 직전에 주입합니다.

이 볼루스 투여에 대한 반응을 이용하여 심장 용적을 정확하게 결정하기 위한 평행 전도도를 계산합니다. 다음으로, 심장 챔버의 밀봉을 해제하고 LV에 삽입된 카테터를 제거합니다. 그런 다음 캐뉼라에서 심장을 절단하여 얼음처럼 차가운 KH 완충액에 넣습니다. 이제 종이 타월로 심장의 물기를 빠르게 닦아내고 습중량을 측정합니다.

무게를 측정한 후, 필요한 조직 샘플을 박리하고 드라이아이스로 냉각시킨 집게를 사용하여 남은 조직을 동결합니다. 준비 과정으로, 유리 신틸레이션 바이알에 10x hyamine hydroxide 1 mL를 넣습니다. 각 관상동맥 유출액 샘플당 하나씩, 그리고 대조군용으로 두 개를 준비하십시오.

샘플 바이알을 적재하는 즉시, 이를 적재된 신틸레이션 바이알에 직접 넣습니다. 분석을 위해, 고무 슬리브 스토퍼로 바이알 캡을 조심스럽게 닫고 파라필름을 사용하여 바이알을 밀봉합니다. 이제 23 gauge의 긴 바늘이 달린 1 mL 주사기를 사용하여 60% 과염소산 200 µL를 고무 슬리브를 통해 주입합니다.

모든 샘플 바이알을 하룻밤 동안 그대로 둡니다. 다음 날, 핀셋을 사용하여 각 샘플 튜브를 조심스럽게 꺼내고, 하이드록사이드 하이아민(hydroxide of hyamine)을 모두 회수하기 위해 개방된 바이알 위에 1 mL의 신틸레이션 칵테일을 부어 튜브 바닥을 씻어냅니다. 그 다음, 각 바이알에 신틸레이션 칵테일 9 mL를 추가로 넣습니다.

비활성도를 구하기 위해, 두 개의 바이알에 profusion buffer 0.5 milliliters를 첨가합니다. 이제 바이알을 세게 흔든 후, 측정을 수행하기 전 최소 6시간 동안 바이알을 그대로 둡니다. 심근 올레산 산화 속도를 결정하려면, 먼저 각 샘플에 대해 음이온 교환 수지 컬럼을 준비하십시오.

3 mL 주사기 튜브의 팁 부분에 유리솜을 채웁니다. 그런 다음 트랜스퍼 피펫을 사용하여 각 컬럼의 2 mL 표시선까지 수지 수성 슬러리를 추가합니다. 다음으로 각 컬럼에 2 mL의 초순수를 세 번 통과시켜 수지를 세척합니다.

그런 다음 컬럼 아래에 신틸레이션 바이알을 배치하고, 컬럼에 0.5 mL의 관상동맥 유출액을 로딩합니다. 배경 측정의 경우에는 대신 관류 완충액을 사용하십시오. 이제 초순수를 각각 0.5 mL, 1 mL, 마지막으로 2 mL씩 순차적으로 사용하여 컬럼을 용리합니다.

컬럼을 폐기합니다. 그다지 바이알에 13 milliliters의 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail)을 추가합니다. 비방사능(specific activity) 측정을 위해 13 milliliters의 액체 신틸레이션 칵테일이 채워진 바이알 두 개에 0.5 milliliters의 관류 완충액(perfusion buffer)을 직접 추가합니다.

바이알을 세게 흔든 후 6시간 이상 그대로 두어 가라앉히고 측정값을 측정합니다. 16주 된 쥐 2마리로부터 심장을 분리하여 서로 다른 스트레스 조건에 노출시켰습니다. 심장 하나에 대해서는 후부하를 40% 증가시키고 관류 버퍼에 epinephrine을 첨가하여 급성 작업 부하 증가를 시뮬레이션했습니다.

부하 급증(work jump) 유도 직후 심박수가 50% 이상 증가했습니다. 부하 급증 시 심장 출력(cardiac power)이 40% 이상 증가했으며, 이와 동시에 포도당과 올레산(oleate)의 산화 속도가 모두 증가했습니다. 특히 기저치 대비 포도당 산화의 상대적 증가 폭이 두드러졌습니다.

다른 심장에는 15분간의 전심장 허혈과 30분간의 재관류를 수행하였습니다. 이러한 실험 조건 하에서, 재관류 시작 후 몇 분 이내에 거의 정상에 가까운 맥압이 회복되었습니다. 10분 이내에 심장 출력은 허혈 전 수치 이상으로 빠르게 증가했다가 다시 기저치에 가까운 수치로 돌아왔습니다.

이는 올레산 산화의 증가로 인해 발생한 결과였습니다. 반면 포도당 산화는 허혈 전 수준의 활성으로 빠르게 회복되었습니다. 숙련된 경우, 적절히 수행한다면 심장 적출부터 작동 모드에서의 초기 재관류까지 5분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차 이후에, 약물이나 스트레스 조건이 분자 신호 전달 경로에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 RNA 및 단백질 발현 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 방사성 추적자를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 전체 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.