이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이 모델의 전반적인 목표는 여러 화학주성 분석을 동시에 모니터링하거나 단일 화학과세 세포의 여러 신호 이벤트를 시각화할 수 있도록 하는 것입니다. Overdeck의 세포 생물학자들은 세포의 화학주성 거동을 정량화하기 위해 여러 가지 접근 방식을 개발했습니다. 최근까지 우리는 여러 화학주성 분석을 동시에 모니터링하는 방법과 같은 화학주성 분야의 주요 질문에 답할 수 있었습니다.

이 기술의 주요 장점은 미세유체역학(microfluidics)의 원리를 적용하여 고분해능으로 여러 동시 화학주성 분석을 위한 재현성이 높고 신뢰할 수 있는 성분을 실시간으로 생성하는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사후 연구원인 Xi Wen 박사가 맡을 것입니다. 홀더를 조립하려면 먼저 레버를 사용하여 레버가 사용자 쪽으로 기울어질 수 있도록 베이스를 수직 위치에 배치하십시오.

그런 다음 41mm 유리 표면에 70% 에탄올을 간단히 코팅하고 물티슈를 사용하여 에탄올을 조심스럽게 제거합니다. 유리를 홀더 베이스에 삽입하고 BSA 코팅된 2mm 정사각형 커버 슬립을 유리 위에 놓습니다. 다음으로, 작은 O-링을 웨이퍼 하우징 바닥에 삽입하고 웨이퍼 하우징을 기기 후면에 타원형 구멍이 있는 홀더 베이스에 장착합니다.

홀더 베이스의 내부 수평기를 수평 위치로 앞으로 당겨 웨이퍼 하우징을 제자리에 고정합니다. 에어 더스터를 사용하여 웨이퍼 하우징 내부의 파편을 불어냅니다. 그런 다음 0.1% BSA가 보충된 RPMI 1640 배지 4밀리리터를 하우징에 추가합니다.

이제 BSA 코팅된 셀 이동도 분석 장치 칩을 구조면이 유리와 접촉하고 후면의 포지셔닝 마크가 있는 웨이퍼 하우징 중앙에 장착합니다. 고무 개스킷에 있는 두 개의 돌출부를 구멍에 끼워 개스킷을 웨이퍼 클램프 바닥에 고정하고 대형 O-링을 웨이퍼 하우징 상단에 장착합니다. 그런 다음 센서 구멍이 후면에 있는 웨이퍼 클램프를 장착하고 하우징 베이스의 외부 레버를 수평 위치로 앞으로 당겨 웨이퍼 클램프를 제자리에 고정합니다.

홀더가 조립되면 홀더 바닥을 라이트 박스에 올려 놓고 웰에 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음 덮개를 제거하고 어셈블리를 셀 이동성 분석 장치 장치 상단의 플레이트로 옮기고 센서 블록을 홀더에 부착합니다. 세포 이동성 분석을 수행하기 위해 먼저 BSA가 보충된 RPMI 1640 배지에 분화된 HL60 세포를 현탁시키고 10 - 밀리리터 농도당 6번째 세포의 2배를 현탁시킵니다.

그런 다음 이미지 획득을 위해 셀 이동도 분석 장치 장치를 컴퓨터에 연결하고 두 장치를 모두 켭니다. 그런 다음 셀 이동성 분석 장치 소프트웨어를 엽니다. 카메라 이미지 제어 패널에서 수평선과 수직선을 사용하여 홀더 위치를 실시간으로 조정하고 장치를 카메라 이미지 패널의 중앙에 놓습니다.

그런 다음 채널 1을 선택하여 카메라를 선택한 채널로 이동하고, Move Right(오른쪽 이동)의 Move Right(왼쪽으로 이동)를 사용하여 카메라의 X 좌표를 조정하여 시야를 수평으로 중앙에 배치합니다. 이미지를 화면 중앙으로 수직으로 조정하려면 셀 이동도 분석 장치의 전면 패널에 있는 위치 노브를 돌립니다. 히터 제어판에서 홀더 온도를 섭씨 37도로 설정하고 플레이트 온도를 섭씨 39도로 설정합니다.

홀더에 연결된 온도 센서를 사용하여 온도를 제어하려면 가열을 클릭하여 가열을 시작한 다음 홀더를 클릭합니다. 촬영 패널에서 Interval(간격)에 15초를 입력하고 Time(시간)에 30분을 입력하여 각각 화학주성 분석의 간격과 기간을 설정합니다. 안전을 위해 촬영 상자 끝에 있는 히터를 끄십시오.

그런 다음 파일을 저장하고, 실험의 세부 사항을 메모 패널에 입력하고, 장치가 모든 채널의 중앙에 배치되었는지 확인합니다. 이제 홀더에서 모든 버퍼를 제거하고 첫 번째 채널 상단에서 세 번째 웰에서 8마이크로리터의 버퍼를 제거합니다. 주사기를 사용하여 동일한 채널의 두 번째 웰에 2마이크로리터의 세포를 주입하는 동시에 실시간으로 화면을 모니터링하여 주입 중 세포 수와 흐름을 제어합니다.

세포가 정렬되면 즉시 8마이크로리터의 완충액을 웰에 다시 추가하고 방금 설명한 것처럼 채널 2에서 6까지 세포 주입을 반복합니다. 모든 세포를 추가한 후 2ml의 완충액을 홀더에 다시 추가하고 1마이크로리터의 화학유인제를 적절한 채널의 상단에서 세 번째 well에 추가합니다. 마지막으로 이미지 획득을 시작합니다.

이 대표적인 실험에서 HL60 세포는 화학유인제 주입 직후 직선 경로로 화학탁싱을 시작하며, 그래디언트 안정성 시뮬레이션 결과와 일치하는 60분 동안 분석이 계속되었습니다. 세포의 이동 경로와 형태를 추적하면 세포의 총 경로 길이, 방향성, 속도 및 진원도를 포함하는 화학주성 지수를 사용하여 화학주성 거동을 정량적으로 측정하고 후속 비교를 할 수 있습니다. 화학유인제와 함께 형광 염료를 적용하면 화학유인제 농도와 모니터링된 형광 염료 강도 사이에 선형 관계를 설정할 수 있습니다.

또한, 균일하게 적용된 화학유인제 자극에 대한 반응으로 HL60 세포는 화학유인 구배를 D1.In GFP 촉각 단백질 키나아제의 강력한 막 전좌를 매개하고, HL60 세포는 키나아제를 선두 가장자리의 뒤쪽으로 적극적으로 모집합니다. 이 과정을 마스터하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 홀더 어셈블리에 대한 제조업체의 지침을 엄격하게 따르고 세포 주입을 모니터링하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 화학주성 분야의 연구자들이 단일유전자 딕티오스틸륨 또는 다른 유형의 포유류 세포 시스템과 같은 다중 화학주성 분석의 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 장치를 조립하는 방법, 동시 화학주성 분석을 수행하는 방법 또는 화학탁싱이 있는 세포에서 여러 신호 전달 이벤트를 동시에 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.