Name: 마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 전체 세포 패치 클램프 기법을 이용한 감각 신경원의 심층 전기생리학적 분석 방법. 이 기법은 화학감각 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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FPR-rs3-i-venus 마우스 라인을 생성해 준 Ivan Rodriguez와 Benoit von der Weid에게 건설적인 비판과 유익한 토론에 감사드립니다. 이 연구는 폭스바겐 재단(Volkswagen Foundation, I/83533), 독일 재단(Deutsche Forschungsgemeinschaft, SP724/6-1), 독일 연방 및 주 정부의 엑설런스 이니셔티브(Excellence Initiative)의 보조금으로 지원되었다. MS는 폭스바겐 재단의 리히텐베르크 교수입니다.

모든 동물의 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물의 보호 (지침 6백9분의 86 / EEC)와 함께 추천 유럽 실험 동물 과학 연맹 (FELASA)에 의해 제시에 지역 및 유럽 연합 (EU) 법률을 준수했다. C57BL / 6 마우스와 FPR-RS3 - 난 - 금성 마우스 모두 음식과 물을 가능한 광고 무제한와 12 시간 조명 / 어두운주기에 실온에서 남녀의 그룹에 보관 하였다. 실험을 위해 섹스 중 젊은 성인 (6~20주)를 사용 하였다. 명백한 성별에 따라 차이가 관찰되지 않았다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 세포 외 용액 S 1 준비 : 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (145)의 NaCl, 5 KCl을 1 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 10 HEPES (mm 단위)를 함유하는 세포 외 완충 용액 (HEPES)을; pH가 7.3 (NaOH로 조정) (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm. </li><li> extracellu 준비LAR 용액 S 2 : Carbogen - 산소 (95 % O 2, 5 % CO 2) CaCl2를 1 황산 125 염화나트륨 25 (단위 : mm)의 NaHCO3 5의 KCl, 1을 포함하는 세포 외 용액 5 BES; pH는 7.3; (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm. </li><li> 조직 삽입을 위해 4 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스 용액 (S 3) 준비 : 4 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스를. 2g는 자기 교반기와 함께 100 ㎖ 유리 실험실 병 S (1)의 50 ml의 아가 로스 겔 둘러 녹인다. 아가로 오스를 용융, 약 20 분 동안 또는 솔루션을 교반하면서 투명하게 될 때까지 70 ° C에서 (뚜껑을 밀폐하지으로) 수조에 병을 넣어. 냉각 추가로 사용할 때까지 42 ° C에서 두 번째 물을 욕조에 녹은 아가로 오스를 유지합니다. </li><li> 세포 내 솔루션 S 사를 준비합니다 피펫 솔루션 2 (무료 칼슘 2 + = 110 ㎚) 1 EGTA (143)의 KCl, 2 KOH, 0.3 염화칼슘, 10 HEPES, 2 MgATP (mm 단위)을 포함, 1 NaGTP;pH가 7.1 (KOH로 조정) 삼투압 =이 290mOsm. </li><li> 수정 / S (1)의 조성물을 조정 개별 실험 설계 (예를 들어, 약리학 적 차단제 전압 작동 전류의 특정 유형을 분리하기 위해)에 따라 S 2 및 S (4). </li></ol> 2. 작업 준비 <ol><li> 온도와 pH를 조정하고 지속적 네이트 솔루션 얼음에 S 2 적어도 30 분 전에 해부에, 장소 슬라이스 저장 챔버를 산소로 입력합니다. </li><li> S 2와 설정을 기록에 슬라이스 superfusion에 대한 저장소를 작성하고 지속적으로 산소를. </li><li> 해부하기 전에, S 2 vibratome 챔버를 채우고 실 주위에 얼음 조각을 정렬합니다. 또한, vibratome 챔버에 챔버를 산소로부터 예비 얼음 차가운 산소 솔루션을 전송하고 지속적으로 산소로 유지합니다. </li><li> 수술 도구와 소모품을 정렬합니다. </li><li> 해부 아래에 얼음 젤 팩을 배치현미경, 접시의 바닥에 얼어에서 VNO 조직을 방지하기 위해 종이 타월로 다룹니다. </li><li> 간략 70 % 에탄올과 증류수로 세척하고 vibratome 마운트하여 면도 면도날. 모든 슬라이스 세션에 장착합니다. </li></ol> 3. VNO 해부 및 포함 <ol><li> 2 CO 날카로운 외과 가위를 사용하여 목을 벨에 짧은 노출에 의해 동물을 희생. 참고 : 중요 얼음에 VNO 캡슐 퍼팅에 동물을 희생에서 시간으로,보다 2 분으로 시간을 최소화 할 수 있습니다. 조직의 생존을 유지하기 위해 30 분 이내에서 아가 모두 완전히 해부 VNOs를 포함. </li><li> 큰 수술 가위로 아래턱을 제거합니다. 입 캐비티를 통해 입력하고 개별적으로 각면의 하악 뼈와 근육을 잘라. </li><li> 거꾸로 큰 페트리 접시에 머리의 나머지 부분을 놓습니다. </li><li> 위턱과의 더 나은 액세스하는 매체 집게로 코의 선단 주변의 피부를 끌어낼앞니. </li><li> 주동이의 방향 (그림 1A)에서 ~ 45 ° 각도로 앞니의 가장 큰 부분을 절단하는 뼈 가위를 사용합니다. 이 비강에서 VNO 캡슐의 제거를 용이하게한다. 주 : VNO 캡슐의 선단부의 손상을 방지하기 위해 치아의 뿌리를 절단하지 않는다. </li><li> 중간 집게와의 주동이의 부분에 강성 상부 미각을 잡고 조심스럽게 평평한 각도 (그림 1B)에서 다시 한 조각의 껍질. 참고 : 반복적으로 얼음처럼 차가운 S 2와 린스. </li><li> 보습 뼈의 뼈와 턱의 끝 사이의 뼈 융합을 잘라 마이크로 스프링 가위를 사용합니다. VNO 캡슐에 왼쪽과 오른쪽 측면 모두에서 작은 단계에 뼈를 잘라 바깥쪽으로 멀리 VNO에서 조심스럽게 가리키는 끝의 곡선 부분에 가위 팁을 삽입합니다. </li><li> VNO 캡슐을 제거하려면, 꼬리 부분에 보습 뼈 뼈를 잘라 마이크로 스프링 가위를 사용하여 조심스럽게 N 밖으로 보습 뼈 뼈를 들어 올려매체 집게를 사용하여 ASAL 공동. 즉시 절개의 나머지 단계를 수행 할 것입니다 얼음 젤 팩에 스테레오 현미경으로 작은 페트리 접시에 VNO을 전송합니다. </li><li> 마르지 조직 않도록 빙냉 S (2)의 소량의 VNO 린스. </li><li> 매체 집게와 보습 뼈 뼈의 뒤쪽을 잡아하여 VNO 연부 조직을 포함하는 연골 캡슐을 분리합니다. 모두 VNOs 사이의 분할 (그림 1D ⅰ) 표시가되도록 지느러미보기를 캡슐을 배치합니다. </li><li> 뒷부분에 아래로 고정 보습 뼈 뼈를 유지하면서 중앙 뼈에서 모두 연골을 VNO 캡슐을 분리하는 미세 집게의 끝 부분을 사용합니다. 참고 : 연골 캡슐의 가장자리에 집게를 사용하여 섬세한 감각 상피가 쉽게 손상 될 때 연골 관통하지 않도록 매우주의해야합니다. </li><li> 두 VNOs이 분리되면, 전나무을 캡슐화 연골을 제거 시작t VNO. </li><li> 하나의 미세 집게로 캡슐의 상단 가장자리를 잡고 이전에 보습 뼈 뼈 (내측)에 부착 된 연골 벽을 멀리 분할합니다. </li><li> 연골은 접시의 바닥에 그 곡선 측면과 함께 VNO를 설정하고 안전하게 집게를 사용하여 한 쪽의 연골을 아래로 고정 나머지 제거합니다. 조심스럽게 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 연골과 VNO 사이에 매우 평평한 각도로 뒤쪽에서 두 번째 미세 집게를 이동합니다. </li><li> 천천히 감각 상피 손상을 방지하기 위해, 자사의 꼬리 끝에서 그것을 잡고 멀리 연골에서 VNO 껍질. </li><li> VNO는 캡슐에서 움직여되면, 슬라이스 과정에서 아가로 오스 주변에서 조직을 분리합니다 연골의 나머지 조각으로 남아있는 모든 작은 연골 부분을 제거해야합니다. </li><li> 조직 손상을 방지하기 위해 제 해부 VNO에 빙냉 S (2)의 작은 방울을 놓는다. 측면 줘야에 큰 혈관난 장기가 그대로이고 심하게 해부 (그림 2A ⅱ) 중에 손상되지 않았 음을 나타내는 표시됩니다. 혈관이 손상있어 경우, 여전히 한 전체 형태가 명확하게 손상되지되었을 때 VNO 슬라이스로에 수행 할 가치가있을 것입니다. </li><li> 즉시 두 번째 VNO를 해부하다. </li><li> VNOs을 포함하려면, 녹은 S 3 림에 모두 작은 배양 접시를 작성 (42 ° C에서 물을 욕조에 저장된 1.3 참조). </li><li> 감각 상피의 손상을 방지하기 위해 미세 집게로 넓은 꼬리 끝에있는 VNO를 잡습니다. </li><li> 아가로 오스에 VNO을 담그고 세포 용액의 필름뿐만 아니라, 그 표면에서 기포를 제거하기 전후 수평으로 여러 번 이동. </li><li> 접시의 바닥을 향하게 꼬리 끝이 수직으로 VNO를 놓습니다. 대신 직접 집게로 VNO 곤란의, 가까운 proximi의 집게 팁을 이동하여 방향을 조정VNO에 타이. 참고 :이 실험 기간 동안 감각 뉴런에 조각 평면과 접근성을 결정으로 삽입시 방향이 중요합니다. </li><li> 겔 얼음 팩에 요리를 놓고 아가로 오스가 응고 될 때까지 기다립니다. 참고 : 아가로 오스는이 주변 아가로 오스에서 조직을 분리하는 바와 같이 응고 시작되면 VNO 방향을 변경하지 마십시오. </li></ol> 4. 코로나 VNO 조직 슬라이스 <ol><li> 큰 페트리 접시의 뚜껑에 작은 접시에서 아가로 오스 블록을 제거하는 작은 주걱을 사용하여, 거꾸로 위쪽으로 향하도록 VNO의 꼬리 끝을 떠나 아가로 오스를 뒤집습니다. </li><li> 외과 용 메스 (선단 3-4 mm의 바닥 8-10 mm)를 사용하여 피라미드 형상으로 블록을 잘라. 포함 된 조직이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> vibratome 표본 판의 중앙에 피라미드 모양의 블록을 수정하고 접착제가 완전히 마를 때까지 ~ 1 분을 기다려야 슈퍼 접착제를 사용합니다. </li><li> 슬라이싱 C에 시료 판을 이동hamber 따라, 두 번째 VNO을 준비합니다. 사용까지 4 ° C에서 두 번째 시료 접시를 유지합니다. </li><li> 두께 : 다음 설정을 사용하여 진동 블레이드 마이크로톰 사용하여 150 ~ 200 μm의; 속도 : 3.5 AU = 0.15 mm / 초; 주파수 = 75 Hz에서 7.5 AU. 간단히 해부 현미경 슬라이스 형태를 검사 한 후 사용할 때까지 산소로 챔버에 조각을 전송합니다. 조각은 몇 시간 동안 유지 될 수있다. </li></ol> 5. 단일 세포 전기 생리 레코딩 <ol><li> 녹화 내용 수침 목표 Dodt 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 및 에피 - 형광뿐만 아니라 냉각 CCD 카메라를 구비 한 직립 고정 스테이지 현미경을 사용한다. 데이터 수집, 패치 클램프 증폭기 헤드 단, AD / DA 인터페이스 보드 (기록 소프트웨어 등)를 PC를 사용한다. </li><li> 10 ~ 20 패치 피펫 (4-7 MΩ)의 재고를 준비합니다. 붕규산 유리 모세관에서 풀 피펫 (1.50 mm 외경 / 0.86 mm의 ID) 날기microforge와 조지아 마이크로 피펫 풀러와 화재 - 폴란드어. 참고 : 오히려 작은 VSN을 패치 할 때 화재 피펫 팁을 연마하는 것이 중요하다. 이것은 고 저항의 밀봉을 얻기 위해 부압을인가하는 경우에 세포막을 파열을 방지하는 것을 도울 것이다. 피펫 구멍을 연마 한 후 약 1 ㎛해야합니다. </li><li> 사용할 때까지 손상 및 먼지 축적을 방지하기 위해 피펫 저장 항아리에 피펫을 유지합니다. </li><li> 솔루션 저수지를 채우고 실험 설계에 따라 튜브에 의해 관류 시스템을 준비합니다. 참고 :이 강하게 전기 생리 녹음에 방해가되므로 완전히 튜브에서 공기 방울을 제거합니다. </li><li> ~ 3 ml / 분의 흐름을 달성하기 위해 압력을 조정합니다. 참고 : 높은 압력이 전기 생리 레코딩의 조직 절편의 이동뿐만 아니라 종료의 원인이됩니다. </li><li> 영상 실에 VNO 슬라이스를 전송하고 0.1 mm 두께 SYNT와 유선 스테인레스 스틸 앵커를 사용하여 조각의 위치를​​ 고정hetic 섬유 (그림 2B - C). 참고 : 합성 섬유 스레드 중 하나가 아니라 슬라이스를 둘러싼 아가로 오스와 조직 절편을 포함하지 마십시오. </li><li> 목욕 응용 프로그램을 통해 실온에서 산소 S 2로 설정하고 지속적으로 superfuse 슬라이스를 기록에 전송 영상 실. </li><li> 욕 용액을 일정한 교류 느린 시키되, 용액의 표면에 흡착 모세관을 조정한다. 8에서 1 멀티 배럴 &quot;관류 연필&quot;위 혈관 (그림 2C, 3A) (50)를 포함하는 VNO 슬라이스의 비 감각 부분에 가까운를 조정합니다. 반대 방향에서 슬라이스를 직면 할 재관류 연필 기록 피펫을 주선 도움이 될 것입니다. </li><li> 기준 전극 (150 mM의 KCl을 가득) L 자형 한천 다리를 사용하여 목욕 솔루션을 연결합니다. </li><li> 피펫 솔루션 S 4 패치 피펫을 입력합니다. </li><li> 코팅을 긁어없이 머리 스테이지에 연결된 염화은 코팅 패치 전극 위에 피펫을 탑재 단단히 연결합니다. </li><li> 약간의 긍정적 인 압력을 적용 (약 10 ml의 플라스틱 주사기 1 ml)을 욕조에 들어가기 전에 패치 피펫합니다. </li><li> (그림 2D)을 타격하지 않고 목표를 잠수함 할 수 있도록 충분히 미세 조작기를 이용하여 욕조에 피펫을 낮 춥니 다. </li><li> 머리 단계에 연결된 전기 생리학 소프트웨어를 사용하여 (4-7 MΩ 사이의 R 핍) 피펫 저항을 모니터링합니다. 참고 : R 핍 인 경우 &lt;4 MΩ 유리 팁이 끊어집니다. R의 PIP가&gt; 10 MΩ 인 경우, 팁은 대부분 막혀 상기 피펫은 교체되어야한다. </li><li> 적외선에 최적화 된 미분 간섭 대비 (DIC)을 사용하여 CCD 카메라와 VNO 슬라이스를 시각화하고 형광 조명을 사용하여 FPR-RS3 - 난 - 금성 (유사 표시 뉴런 또는) 발현 세포를 식별적절한 필터 큐브. </li><li> 초점과 목표 형광 또는 비 형광 세포는 실험 설계에 따라 달라집니다. </li><li> 세포체 접근 최대 감도 핸드 휠을 사용한다. 피펫 팁이 가까이에 일단 긍정적 인 압력으로 인해, 셀 소마 막에 작은 함몰이 표시됩니다. </li><li> 정압 놓고 고 저항 시일 (1-20 GΩ)를 얻기 위하여 세포막 빨아 약간 부압을 적용한다. 세포막을 파괴하고, 전체 셀 구성을 설정하는 짧은 부드러운 흡입을 적용한다. </li><li> 실험 기간 동안 지속적으로 액세스 저항을 모니터링합니다. 참고 : 작고 안정적인 접속 저항을 나타내는 신경 세포 포함 (R 입력 ≤3 %를, 변화 &lt;실험의 과정을 통해 20 %) 분석에 있습니다. </li></ol>

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VNO는 semiochemicals을 감지하는 화학 감각 구조입니다. 현재까지, 서 골코 (vomeronasal) 수용체의 대부분은 단지 몇 수용체 - 리간드 쌍은 식별 된대로 deorphanized 일이다. 그 중 V1rb2가 남성 비뇨기 페로몬 2- 헵 타논 (30)에 의해 구체적으로 활성화되도록 설명했다 V2rp5이 남성 특정 페로몬 ESP1 57뿐만 아니라 SYFPEITHI V2r1b과 V2rf2가 MHC 펩타이드에 의해 활성화 될뿐만에 의해 활성화되는 48 SEIDLILGY (58) 각기. 수용체 - 리간드 관계와 신호​​ 전달을 이해하는 전제 조건은 네이티브 환경에서 정의 된 VSN 인구의 생물 물리학 적 특성에 대한 지식이다. 수동 및 능동 막 특성, 전압 - 게이트 이온 전도도 및 활동 전위 방전 패턴 수용체 신경 세포가 자극을 화학 감각에 반응되는 수단과 범위를 정의합니다. 전기 생리 급성 조직 조각에서 녹음하고, 특히, 사람르 셀 ...

대부분의 동물들은 주변 환경과 상호 작용하는 화학적 감각에 크게 의존하고있다. 냄새의 감각은 적합한 상대 파트너를 찾아 음식을 평가, 포식자를 피하고 위치에 필수적인 역할을한다. 주 후각 상피 1,2의 Grueneberg 신경절 3, 4, 5, 6 Masera의 중격 기관 및 골코 (vomeronasal) 기관 : 대부분의 포유 동물에서, 후각 시스템은 적어도 네 개의 해부학 적 및 기능적으로 서로 다른 주변 장치 서브 시스템으로 구성된다. VNO 신원, 성별, 사회적 순위 성적 7-10 상태에 대한 정보를 전달하는 화학적 신호를 검출하기에 중요한 역할을 액세서리 후각 시스템 (AOS)의 주연 감각 구조를 포함한다. VNO는 바로 구개 위의 비중격의 기지에 위치해 있습니다. 마우스에서, 그것은 연골 캡슐 11 ~ 13 안에 양자 블라인드 끝 튜브입니다. 기관은 초승달 모양의 중간 감각 epithe 모두 구성VSN을을 항구와 측면에 비 감각 부분의 lium. 모두 상피 사이 좁은 골코 (vomeronasal) 덕트 (14)를 통해 비강에 연결되어있는 점액 가득한 루멘있다. 비 감각 ​​조직에 큰 횡 혈관 음압 15,16 통해 예 VNO 루멘으로 작은 펩티드 또는 단백질과 같은 비교적 대형, 주로 비 휘발성 분자의 진입을 용이하게하기 혈관 펌핑 메커니즘을 제공한다. VNO의 구성 요소는 출생시 존재하고 장기 곧 사춘기 17 전에 성인 크기에 도달합니다. 그러나, 설치류 AOS 이미 청소년의 작동 여부를 18 ~ 20 토론을 계속 될 수 있습니다. VSN을들은 상피 위치와 그들이 표현 수용체의 종류 모두에 의해 구별된다. VSN을은 수초 축삭과 내강쪽으로 돌출하고 microvillous 돌기 손잡이로 끝나는 하나의 정점 덴 드라이트와 바이폴라 형태를 보여줍니다. VSN 도끼기능 총생의 배측 - 꼬리 끝 부분에있는 연골 캡슐 잎 격막을 따라 상승, 액세서리 후각 망울 (AOB) 21, 22에 소공 질의 판과 프로젝트를 통과 골코 (vomeronasal) 신경을 형성한다. 골코 (vomeronasal) 감각 상피는 두 개의 층으로 이루어져있다 : 꼭대기 층이 내강 측과 항구 V1R- 및 신경 세포를 FPR-RS는 발현의 한 종류지만 모두 모두 가까이에 있습니다. 이 신경 세포는 AOB 23-25의 앞쪽 부분에 G 단백질 α-서브 유닛 G의 αi2와 프로젝트를 같이 발현. G의 αo 함께 더 기저층 명시 V2Rs 또는 FPR-RS1에있는 감각 신경 세포와는 AOB 26 ~ 28의 후방 영역에 자신의 축삭을 보냅니다. 골코 (vomeronasal) 뉴런은 가능성이 소변, 타액 등 다양한 체액으로 분비 및 유체 눈물되어 오히려 작은 semiochemicals 29-33 (V1Rs) 또는 단백질 화합물 34-38 (V2Rs)에 의해 활성화된다 37,39-41 </sup&gt;. 현장 실험에서이 VSN을도 포르 밀화 펩티드 및 각종 항균 / 염증 결합 된 화합물 25,42에 의해 활성화되는 것으로 나타났습니다. 또한, 이종 FPR-RS 단백질 (참조 43 참조) 동종 또는 버릇 음식 소스 (25)의 질병에 대한 검출기 등의 잠재적 인 역할을 나타내는 면역 체계로 표현 FPRs과 효능 스펙트럼을 공유 표명했다. 특정 VSN 집단에서 수용체 - 리간드 관계 및 다운 스트림 신호 계곡을 이해하는 기본은 네이티브 환경에서 기본적인 생물 물리학 적 특성에 대한 자세한 평가입니다. 과거에는, 셀룰러 신호의 분석은 크게 형광 마커 단백질을 30,44-49 coexpressing함으로써 뉴런 정의 집단 표시 유전자 변형 동물로부터 혜택있다. 이 프로토콜에서, 형광 마커와 함께 FPR-RS3를 발현하는 형질 전환 마우스 선 (FPR-RS3는-I-금성)가 사용된다.이 접근법은 급성 관상 VNO 조직 슬라이스 단일 뉴런 패치 클램프 기록을 이용하여 광학적으로 식별 가능한 세포 집단의 전기 생리 학적 분석을 수행하기 위해 이러한 유전자 변형 마우스 균주를 사용하는 방법을 예시한다. 공기 압력 중심의 멀티 배럴 관류 시스템 감각 자극 및 약리 에이전트는 녹음 중, 빠른 가역과 초점 신경 자극하거나 억제 할 수 있습니다. 슬라이스 제제의 전체 세포 레코딩은 셀의 기본 환경에서 고유 특성, 전압 - 활성화 컨덕턴스의 상세한 분석뿐만 아니라, 활동 전위 방전 패턴을 허용한다.

<table><tbody><tr><td><강>화학</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스(저겔화 온도)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP(Mg-ATP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES)</td><td>시그마-알드리치</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 - 알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>51120</td><td></td></tr> <tr><td>(2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소</td>나트륨 <td>시그마-알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td><강>이름</강></td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>수술 도구 및 소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 페트리 접시, 90mm</td><td>VWR</td><td></td><td>참수, VNO 캡슐 해부</td></tr><tr><td>소형 페트리 접시,</td> VNO 해부용 35mm <td>VWR</td><td></td><td>뚜껑, 아가로스에 삽입하기 위한 접시</td></tr><tr><td>날카로운 대형 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>참수, 아래턱 제거</td></tr><tr><td>강한 뼈 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>절단 앞니</td></tr><tr><td>중간 집게, Dumont 핀셋 #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>피부와 입천장 제거</td></tr><tr><td>마이크로 스프링 가위, 8.5 cm, 곡선형, 7 mm 칼날&nbsp;</td><td>VNO를 잘라내는</td> <td>Fine Science Tools</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>두 쌍의 미세한 집게, Dumont 핀셋 #5</td><td>연골 캡슐에서 VNO를 해부하는</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>작은 스테인리스 스틸 주걱</td><td>아가로스 블록과 조직 조각을 다루는</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 블록을 피라미드 모양으로 자르</td>는<td>수술용 메스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>필터 큐브, 여기: BP 450-490, 억제: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>형광 램프</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트 자기 교반기</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터 장치&nbsp;</td><td>루이그 & 노이만</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러, 수직 투스텝</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>소음 제거기 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>오스모미터&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>관류 시스템 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 미터 5개의 쉬운</td><td>메틀러 톨레도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 저장 항아리</td><td>세계 정밀 기기</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>기록 챔버&nbsp;</td><td>루이그 & Neumann</td><td>Slice 미니 챔버</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenating slice 보관 챔버; 대체 상업용 챔버는 다음과 같습니다: 예: , BSK1 Brain Slice Keeper(Digitimer) 또는 Pre-chamber(BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>트리거 인터페이스&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>비브라톰&nbsp;</td><td>라이카 마이크로시스템즈</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>수조&nbsp;</td><td>멤머트</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

대부분의 포유류에서 vomeronasal organ (VNO)은 이종(hetero) 및 conspecific social signals를 모두 감지하는 화학 감각 구조입니다. Vomeronasal sensory neurons (VSNs)는 적어도 3개의 서로 다른 화학수용체 유전자군으로부터 특정 유형의 G protein-coupled receptor (GPCR)를 발현하여 화학감각 단서를 민감하고 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이러한 계열은 V1r 및 V2r 유전자 계열뿐만 아니라 추정되는 화학수용체 유전자의 포르밀 펩타이드 수용체(FPR) 관련 서열(Fpr-rs) 계열로 구성됩니다. vomeronasal receptor-ligand 상호 작용 및 downstream signaling의 생리학을 이해하려면 각 특정 VSN 클래스에 내재된 생물물리학적 특성을 식별하는 것이 필수적입니다.
여기에 설명된 생리학적 접근 방식은 형질전환 마우스 라인(Fpr-rs3-i-Venus)을 사용하여 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜의 사용은 이 특정 계통에 국한되지 않으며, 따라서 다른 유전자 변형 계통 또는 야생형 동물로 쉽게 확장될 수 있다.

정의 된 세포 집단의 생물 물리학 적 및 생리 학적 특성에 대한 통찰력을 얻으려면, 우리는 마우스 VNO (- 2 그림 1)의 급성 관상 조직 조각을 수행합니다. 절개 후, 슬라이스는 몇 시간 동안 빙냉 산소 세포 외 용액 (S 2)에 유지 될 수있다. 녹화 설정에서 신선한 산소 솔루션 일정한 교환 (그림 2D)은 실험을 통해 조직의 생존을 보장합니다. 우리는 여기에 형질 전환 마우스 모델 (FPR-RS3 - 난 - 금성)를 사용한다. 이 변형 같이 발현 FPR-RS3와 형광 마커 단백질, 감각 뉴런의 정의 된 인구의 광학 식별을 가능하게하는 FPR-RS 유전자 가족 (그림 3)의 원형 부재 VSN을. 전기 생리 학적 기록은 단일 세포 수준에서 심층 분석을위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 게이트 전압 전류 분석 ...

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐 서비기관(vomeronasal organ)의 급성 조직 절편 내에서 특정 감각 뉴런 집단의 단일 세포 전기생리학적 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 화학 물질 감지 메커니즘과 같이 화학 감각 분야의 핵심 질문들을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 급성 조직 절편 내의 감각 뉴런으로부터 기록함으로써, 이 세포들을 본래의 환경 내에서 조사할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 동물을 희생시킨 후 입강을 통해 대형 수술용 가위를 삽입하여 하악을 제거하고, 양측의 하악골과 근육을 각각 절단합니다. 다음으로, 절치에 더 쉽게 접근하기 위해 중간 핀셋을 사용하여 상악의 피부와 코끝 주변의 피부를 제거합니다. 그런 다음 골 가위를 사용하여 비강에서 VNO 캡슐을 쉽게 제거할 수 있도록 절치의 대부분을 주둥이 방향으로 45도 각도로 절단합니다.VNO 캡슐의 끝부분이 손상되는 것을 방지하기 위해 치아의 뿌리를 자르지 마십시오. 그 후, 중형 포셉을 사용하여 경구개(rigid upper palate)의 앞부분(rostral part)을 잡고, 평평한 각도로 조심스럽게 한 번에 벗겨냅니다. 비강을 얼음처럼 차가운 S2 용액으로 반복해서 씻어냅니다. 그런 다음 마이크로 스프링 가위를 사용하여 서골(vomer bone)의 끝부분과 턱 사이의 골 유출물을 절단합니다.가위 끝의 곡선 부분이 VNO 반대 방향을 향하도록 삽입하십시오. 그리고 VNO 캡슐의 외측에서 좌우 양쪽의 뼈를 조금씩 조심스럽게 절단하십시오. VNO 캡슐을 제거하려면 vomer bone의 미측 부분을 절단하고, medium forceps를 사용하여 vomer bone을 비강에서 조심스럽게 들어 올리십시오.VNO를 즉시 얼음 젤 팩 위에 놓인 실체 현미경 아래의 작은 페트리 접시에 옮겨 남은 해부 단계를 수행합니다. 다음으로, 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 소량의 ice cold S2로 VNO를 헹굽니다. 그런 다음, 중간 핀셋으로 서골(vomer bone)의 뒷부분을 잡아 VNO 연조직이 포함된 연골 캡슐을 분리합니다.이를 위해, 양측 VNO 사이의 분리 지점이 보이도록 캡슐을 등쪽 뷰(dorsal view)로 배치합니다. 미세 핀셋의 끝을 사용하여 후방 부위의 서골(vomer bone)을 핀으로 고정한 상태에서 양측 연골 VNO 캡슐을 중앙 뼈로부터 분리합니다. 이전에 서골에 부착되어 있던 내측 연골벽이 완전히 제거되었는지 확인하십시오.VNO 주변의 연골을 제거할 때는 포셉을 사용하여 연골 캡슐의 가장자리 부분만 잡으십시오. 이때 섬세한 감각 상피가 손상되지 않도록 매우 주의해야 합니다. 남은 연골을 제거하려면 VNO의 굽은 외측면이 배양 접시 바닥을 향하도록 돌린 후, 포셉을 사용하여 한쪽의 연골을 단단히 고정하십시오.그다음, 두 번째 미세 핀셋을 연골과 VNO 사이의 매우 낮은 각도로 후면에서 조심스럽게 이동시켜 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 합니다. 감각 상피의 손상을 방지하기 위해 VNO의 미측 끝부분을 잡고 연골에서 천천히 벗겨냅니다. VNO를 캡슐에서 들어 올린 후, 남은 작은 연골 조각들을 모두 제거합니다. 연골 조각이 남아 있으면 절편 제작 과정에서 조직이 주변 아가로스에서 분리될 수 있기 때문입니다.다음으로, 조직 손상을 방지하기 위해 처음 적출한 VNO 위에 차가운 S2를 소량 떨어뜨립니다. VNO를 임베딩하기 위해, 두 개의 작은 페트리 접시 가장자리까지 녹은 S3를 채웁니다. 그 후, 각 VNO를 아가로스에 담그고 수평 방향으로 여러 번 앞뒤로 움직여 표면의 세포외액 막과 기포를 제거합니다. VNO의 rostral tip이 접시 바닥을 향하도록 수직으로 배치합니다.그 후, 두 접시를 모두 젤 아이스팩 위에 놓고 아가로스가 응고될 때까지 기다립니다. 아가로스가 응고되기 시작하면 VNO의 방향을 변경하지 마십시오. 방향을 바꾸면 조직이 주변 아가로스에서 분리될 수 있습니다. 이 과정에서 작은 스패출러를 사용하여 작은 접시에서 아가로스 블록을 들어내어 큰 페트리 접시의 뚜껑으로 옮긴 후, VNO의 주측(rostral) 끝부분이 위를 향하도록 아가로스를 뒤집어 놓습니다.다음으로, 수술용 메스를 사용하여 블록을 피라미드 모양으로 절단하되, 내포된 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음, 순간접착제를 사용하여 피라미드 모양의 블록을 바이브라톰 시편 플레이트 중앙에 고정합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 약 1분 동안 기다립니다.시료를 150에서 200 µm 두께의 절편으로 자릅니다. 실체 현미경으로 절편의 형태를 간단히 확인합니다. 그 다음, 사용 전까지 모든 절편을 산소 공급 챔버로 옮깁니다.이 단계에서는 VNO 절편을 이미징 챔버로 옮기고, 0.1 mm 두께의 합성 섬유로 연결된 스테인리스 스틸 앵커를 사용하여 절편의 위치를 고정합니다. 합성 섬유 실로 조직 절편을 덮지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 이미징 챔버를 기록 장치로 옮기고 실온에서 산소가 공급된 S2 용액을 절편에 지속적으로 관류합니다.흡입 모세관을 용액 표면에 맞추어 배스 용액이 지속적으로 교환되도록 조절합니다. 그런 다음, 혈관이 포함된 VNO 슬라이스의 비감각 부위 위쪽 가까이에 8-in-1 멀티 배럴 관류 펜슬을 배치합니다. 그 후 150 mM 염화칼륨으로 채워진 L자형 아가르 브리지를 사용하여 참조 전극과 배스 용액을 연결합니다.그 다음 패치 피펫을 피펫 용액 S4로 채웁니다. 코팅을 긁어내지 않도록 주의하며 헤드 스테이지에 연결된 염화은 코팅 전극 위에 피펫을 장착하고 단단히 고정합니다. 그런 다음 배스(bath)에 진입하기 전에 패치 피펫에 약간의 양압을 가합니다. 피펫의 저항을 모니터링하여 4 MΩ에서 10 MΩ 사이인지 확인하십시오.적외선 최적화 DIC를 사용하여 CCD 카메라로 VNO 절편을 시각화하고, 형광 조명과 적절한 필터 큐브를 사용하여 FPR-rs3 i-Venus 발현 세포 또는 유사하게 표지된 뉴런을 식별합니다. 최대 감도를 얻기 위해 핸드 휠을 사용하여 세포체에 접근합니다. 양압으로 인해 피펫 팁이 근접하면 세포체 막에 작은 함몰이 보이기 시작합니다.그 다음 양압을 해제하고 약한 음압을 가해 세포막을 빨아들임으로써 1~20 gigaohms의 높은 저항 씰을 형성합니다. 이어서 짧고 부드럽게 흡입하여 세포막을 파괴하고 whole cell 구성을 확립합니다. 이 그림의 관상면 VNO 조직 절편 공초점 이미지는 비서각 감각 상피 내의 형광 FPR-rs3 Tau Venus 양성 뉴런의 분포를 보여줍니다.FPR-rs3 Tau Venus 양성 뉴런은 내강 경계에서 노브(knob)와 같은 구조로 끝나는 단일 정단 수지상 돌기를 나타냅니다. 여기에는 VSN 세포체에서 수행된 전체 세포 패치 클램프 기록이 제시되어 있습니다. 다음은 FPR-rs3 양성 VSN의 TTX 민감성 빠른 활성 나트륨 전류에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록의 대표적인 트레이스입니다.대조군 조건에서의 전압 단계 기록 결과, 전압 의존적인 빠르게 소멸하는 내향 전류가 나타납니다. 1 µM의 TTX 처리 시 이 전류가 크게 감소합니다. 그리고 여기에 표시된 디지털 감산 파형은 TTX 민감성 전압 개폐 나트륨 전류를 보여줍니다.대표적인 전류 클램프 기록(current clamp traces)은 단계별 양전하 및 음전하 전류 주입 시 발생하는 탈분극, 과분극 및 일련의 활동 전위를 보여줍니다. 숙련될 경우, 두 서골비강(VNO) 모두에 대한 전체 해부 및 조직 절편 제작 과정은 약 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후, 더 많은 수의 뉴런 집단을 분석하여 처리량을 높이기 위해 세포 외 루즈 패치 기록(extra-cellular loose patch recordings)이나 칼슘 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 구강 서골비기관으로부터 급성 조직 절편을 제작하는 방법과 서골비 감각 신경세포로부터 단일 세포 전기생리학적 기록을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

이 비디오는 쥐 성기 장기(VNO)의 분리 및 진동 절편을 위한 조직 준비에 대해 간략하게 설명합니다. 섹션은 특정 감각 뉴런 그룹의 생물물리학적, 생리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Vibratome Sectioning을 위한 Mouse Vomeronasal Organ의 준비

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

배우세요 마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 전체 세포 패치 클램프 기법을 이용한 감각 신경원의 심층 전기생리학적 분석 방법. 이 기법은 화학감각 메커니즘 연구에 활용됩니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

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