마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 조형 기관에서 급성 조직 절편에 있는 정의된 감각 뉴런 집단에 대한 단세포 전기 생리학적 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 see-no 화학물질 검출 메커니즘과 같은 화학 감각 분야의 핵심 질문을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 급성 조직 절편의 감각 뉴런을 기록하여 이러한 세포를 원래 환경에서 조사할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 동물을 희생 한 후 입강을 통해 한 쌍의 큰 수술 용 가위를 삽입하여 아래턱을 제거하고 양쪽의 하악골과 근육을 별도로 자릅니다. 그런 다음 중간 집게로 위턱의 피부와 코 끝 주위의 피부를 제거하여 앞니에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 뼈 가위를 사용하여 앞니의 가장 큰 부분을 윗부분 방향으로 45도 각도로 잘라내어 비강에서 VNO 캡슐을 쉽게 제거합니다.

VNO 캡슐 끝의 손상을 방지하기 위해 치아 뿌리를 자르지 마십시오. 그 후, 중간 집게로 윗부분의 딱딱한 상부 입천장을 잡고 평평한 각도로 한 조각으로 조심스럽게 벗겨냅니다. 얼음처럼 차가운 용액 S2로 해군 구멍을 반복적으로 헹굽니다. 그런 다음 마이크로 스프링 가위를 사용하여 보머 뼈 끝과 턱 사이의 뼈 삼출액을 자릅니다.

구부러진 부분이 VNO에서 멀어지도록 시저 팁을 삽입합니다. 그리고 VNO 캡슐 측면의 왼쪽과 오른쪽 모두에서 작은 단계로 뼈를 조심스럽게 자릅니다. VNO 캡슐을 제거하려면 꼬리 부분의 보머 뼈를 절단하고 중간 집게를 사용하여 비강에서 보머 뼈를 조심스럽게 들어 올립니다.

VNO를 아이스 젤 팩의 실체 현미경 아래 작은 페트리 접시에 즉시 옮기고 나머지 해부 단계를 수행해야 합니다. 다음으로, 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 소량의 얼음처럼 차가운 S2로 VNO를 헹굽니다. 그런 다음 중간 겸자로 보머 뼈의 뒤쪽을 잡아 VNO 연조직을 포함하는 연골 캡슐을 분리합니다.

이를 위해 두 VNO 간의 분할이 보이도록 캡슐을 등쪽 보기로 배치합니다. 가는 집게의 끝을 사용하여 중앙 뼈에서 두 연골 VNO 캡슐을 분리하고 보머 뼈는 뒤쪽 부분에 고정합니다. 이전에 보머 뼈에 부착되어 있던 내측 연골 벽이 제거되었는지 확인합니다.

VNO 주위의 연골을 제거할 때는 연골낭 가장자리에만 집게를 사용하십시오. 그리고 섬세한 감각 상피를 손상시키지 않도록 각별히 주의하십시오. 남아있는 연골을 제거하려면 구부러진 측면이 접시 바닥으로 된 VNO를 돌리고 집게를 사용하여 한쪽 연골을 단단히 고정합니다.

그런 다음 연골과 VNO 사이의 매우 평평한 각도로 뒤쪽의 두 번째 미세한 집게를 조심스럽게 움직여 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 합니다. 감각 상피의 손상을 방지하려면 VNO를 꼬리 끝에 대고 연골에서 VNO를 천천히 떼어냅니다. VNO가 캡슐에서 레버리지로 사용되면 남은 연골 조각이 슬라이스 과정에서 주변 아가로스에서 조직을 분리하므로 남아 있는 작은 연골 부분을 모두 제거합니다.

다음으로, 조직 손상을 방지하기 위해 첫 번째 절개된 VNO에 얼음처럼 차가운 S2 한 방울을 떨어뜨립니다. VNO를 삽입하려면 두 개의 작은 페트리 접시를 녹인 S3로 가장자리까지 채웁니다. 그 후, 각 VNO를 아가로스에 담그고 수평으로 앞뒤로 여러 번 움직여 표면의 기포뿐만 아니라 세포 외 용액의 필름을 제거합니다. VNO를 수직으로 배치하고 로스트랄 팁이 접시 바닥을 향하도록 합니다.

그런 다음 젤 아이스팩에 두 접시를 모두 놓고 아가로스가 굳을 때까지 기다립니다. 아가로스가 응고되기 시작하면 주변 아가로스에서 조직이 분리되므로 VNO 방향을 변경하지 마십시오. 이 절차에서는 작은 주걱을 사용하여 작은 접시의 아가로스 블록을 큰 페트리 접시의 뚜껑에 넣고 아가로스를 거꾸로 뒤집어 VNO의 로스트 끝이 위를 향하도록 합니다.

그런 다음 수술용 메스를 사용하여 블록을 피라미드 모양으로 자르고 박힌 조직이 손상되지 않도록 주의합니다. 그런 다음 슈퍼 접착제를 사용하여 피라미드 모양의 블록을 비브라톰 표본 플레이트의 중앙에 고정합니다. 그리고 접착제가 완전히 마를 때까지 약 1분 정도 기다립니다.

표본을 150-200마이크로미터 두께의 부분으로 자릅니다. 해부 현미경으로 슬라이스 형태를 간략하게 검사합니다. 그런 다음 사용할 때까지 모든 조각을 산소 공급 챔버로 옮깁니다.

이 단계에서는 VNO 슬라이스를 이미징 챔버로 옮기고 포인트 1 마일미터 두께의 합성 섬유로 연결된 스테인리스강 앵커를 사용하여 슬라이스 위치를 고정합니다. 조직 조각을 합성 섬유 실로 덮지 마십시오. 다음으로, 이미징 챔버를 레코딩 설정으로 옮기고 실온에서 산소가 공급된 S2로 슬라이스를 지속적으로 슈퍼퓨징합니다.

용액 표면에 대한 흡입 모세관을 조정하여 수조 용액의 지속적인 교환을 만듭니다. 그런 다음 8 in one multi barrel profusion pencil을 혈관이 포함된 VNO 슬라이스의 비감각 부분에 가깝게 조정합니다. 그런 다음 150밀리몰 염화칼륨으로 채워진 L자형 한천 브리지를 사용하여 기준 전극과 수조 용액을 연결합니다.

그런 다음 패치 피펫에 피펫 용액 S4를 채웁니다. 코팅을 긁어내지 않고 헤드 스테이지에 연결된 은염화물 코팅 전극 위에 피펫을 장착하고 단단히 부착합니다. 그런 다음 욕조에 들어가기 전에 패치 피펫에 약간의 양압을 가하십시오. 피펫을 모니터링하고 4메가옴에서 10메가옴 사이인지 확인합니다.

적외선에 최적화된 DIC를 사용하여 CCD 카메라로 VNO 슬라이스를 시각화하고, 형광 조명과 적절한 필터 큐브를 사용하여 FPR-rs3 i-Venus 발현 세포 또는 이와 유사하게 라벨링된 뉴런을 식별합니다. 최대 감도를 위해 핸드 휠을 사용하여 세포체에 접근하십시오. 양압으로 인해 피펫 팁이 가까이 오면 세포 소세포막의 작은 움푹 들어간 곳이 보이게 됩니다.

그런 다음 양압을 해제하고 약간의 음압을 가하여 세포막을 빨아들여 1-20기가옴의 높은 저항 밀봉을 얻습니다. 그런 다음 짧고 부드러운 흡입을 가하여 세포막을 파괴하고 전체 세포 구성을 확립합니다. 이 그림에서 코로나 VNO 조직 절편의 컨포칼 이미지는 보메로나스 감각 상피에서 형광 FPR-rs3 Tau Venus 양성 뉴런의 분포를 보여줍니다.

FPR-rs3 Tau Venus 양성 뉴런은 내강 경계에서 손잡이와 같은 구조로 끝나는 단일 정점 수상돌기를 나타냅니다. 그리고 여기에 표시된 것은 VSN soma에서 수행된 전체 세포 패치 클램프 기록입니다. 다음은 TTX 민감 고속 활성화 나트륨 전류 및 FPR-rs3 양성 VSN의 도매 패치 클램프 기록의 대표적인 추적입니다.

제어 조건에서의 전압 스텝 기록은 전압 의존적, 빠른 전류 및 과도 내부 전류를 나타냅니다. 1 마이크로 몰에서 TTX 처리는 전류를 크게 감소시킵니다. 그리고 여기에 표시된 디지털 방식으로 뺀 트레이스는 TTX 민감 전압 게이트 나트륨 전류를 나타냅니다.

대표적인 전류 클램프 트레이스는 탈분극 및 초분극과 단계적 양전류 및 음전류 주입 시 생성되는 활동 전위의 트레인을 보여줍니다. 일단 마스터하면 전체 해부 및 조직 절단 과정을 두 VNO에 대해 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 더 큰 뉴런 집단을 분석할 때 처리량을 증가시키기 위해 세포 외 느슨한 패치 기록 또는 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 구강 성기 기관에서 급성 조직 절편을 만드는 방법과 보메로노살 감각 뉴런에서 단일 세포 전기 생리학적 기록을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.