마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐 서비기관(vomeronasal organ)의 급성 조직 절편 내에서 특정 감각 뉴런 집단의 단일 세포 전기생리학적 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 화학 물질 감지 메커니즘과 같이 화학 감각 분야의 핵심 질문들을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 급성 조직 절편 내의 감각 뉴런으로부터 기록함으로써, 이 세포들을 본래의 환경 내에서 조사할 수 있다는 점입니다.

이 절차를 시작하려면, 동물을 희생시킨 후 입강을 통해 대형 수술용 가위를 삽입하여 하악을 제거하고, 양측의 하악골과 근육을 각각 절단합니다. 다음으로, 절치에 더 쉽게 접근하기 위해 중간 핀셋을 사용하여 상악의 피부와 코끝 주변의 피부를 제거합니다. 그런 다음 골 가위를 사용하여 비강에서 VNO 캡슐을 쉽게 제거할 수 있도록 절치의 대부분을 주둥이 방향으로 45도 각도로 절단합니다.

VNO 캡슐의 끝부분이 손상되는 것을 방지하기 위해 치아의 뿌리를 자르지 마십시오. 그 후, 중형 포셉을 사용하여 경구개(rigid upper palate)의 앞부분(rostral part)을 잡고, 평평한 각도로 조심스럽게 한 번에 벗겨냅니다. 비강을 얼음처럼 차가운 S2 용액으로 반복해서 씻어냅니다. 그런 다음 마이크로 스프링 가위를 사용하여 서골(vomer bone)의 끝부분과 턱 사이의 골 유출물을 절단합니다.

가위 끝의 곡선 부분이 VNO 반대 방향을 향하도록 삽입하십시오. 그리고 VNO 캡슐의 외측에서 좌우 양쪽의 뼈를 조금씩 조심스럽게 절단하십시오. VNO 캡슐을 제거하려면 vomer bone의 미측 부분을 절단하고, medium forceps를 사용하여 vomer bone을 비강에서 조심스럽게 들어 올리십시오.

VNO를 즉시 얼음 젤 팩 위에 놓인 실체 현미경 아래의 작은 페트리 접시에 옮겨 남은 해부 단계를 수행합니다. 다음으로, 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 소량의 ice cold S2로 VNO를 헹굽니다. 그런 다음, 중간 핀셋으로 서골(vomer bone)의 뒷부분을 잡아 VNO 연조직이 포함된 연골 캡슐을 분리합니다.

이를 위해, 양측 VNO 사이의 분리 지점이 보이도록 캡슐을 등쪽 뷰(dorsal view)로 배치합니다. 미세 핀셋의 끝을 사용하여 후방 부위의 서골(vomer bone)을 핀으로 고정한 상태에서 양측 연골 VNO 캡슐을 중앙 뼈로부터 분리합니다. 이전에 서골에 부착되어 있던 내측 연골벽이 완전히 제거되었는지 확인하십시오.

VNO 주변의 연골을 제거할 때는 포셉을 사용하여 연골 캡슐의 가장자리 부분만 잡으십시오. 이때 섬세한 감각 상피가 손상되지 않도록 매우 주의해야 합니다. 남은 연골을 제거하려면 VNO의 굽은 외측면이 배양 접시 바닥을 향하도록 돌린 후, 포셉을 사용하여 한쪽의 연골을 단단히 고정하십시오.

그다음, 두 번째 미세 핀셋을 연골과 VNO 사이의 매우 낮은 각도로 후면에서 조심스럽게 이동시켜 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 합니다. 감각 상피의 손상을 방지하기 위해 VNO의 미측 끝부분을 잡고 연골에서 천천히 벗겨냅니다. VNO를 캡슐에서 들어 올린 후, 남은 작은 연골 조각들을 모두 제거합니다. 연골 조각이 남아 있으면 절편 제작 과정에서 조직이 주변 아가로스에서 분리될 수 있기 때문입니다.

다음으로, 조직 손상을 방지하기 위해 처음 적출한 VNO 위에 차가운 S2를 소량 떨어뜨립니다. VNO를 임베딩하기 위해, 두 개의 작은 페트리 접시 가장자리까지 녹은 S3를 채웁니다. 그 후, 각 VNO를 아가로스에 담그고 수평 방향으로 여러 번 앞뒤로 움직여 표면의 세포외액 막과 기포를 제거합니다. VNO의 rostral tip이 접시 바닥을 향하도록 수직으로 배치합니다.

그 후, 두 접시를 모두 젤 아이스팩 위에 놓고 아가로스가 응고될 때까지 기다립니다. 아가로스가 응고되기 시작하면 VNO의 방향을 변경하지 마십시오. 방향을 바꾸면 조직이 주변 아가로스에서 분리될 수 있습니다. 이 과정에서 작은 스패출러를 사용하여 작은 접시에서 아가로스 블록을 들어내어 큰 페트리 접시의 뚜껑으로 옮긴 후, VNO의 주측(rostral) 끝부분이 위를 향하도록 아가로스를 뒤집어 놓습니다.

다음으로, 수술용 메스를 사용하여 블록을 피라미드 모양으로 절단하되, 내포된 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음, 순간접착제를 사용하여 피라미드 모양의 블록을 바이브라톰 시편 플레이트 중앙에 고정합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 약 1분 동안 기다립니다.

시료를 150에서 200 µm 두께의 절편으로 자릅니다. 실체 현미경으로 절편의 형태를 간단히 확인합니다. 그 다음, 사용 전까지 모든 절편을 산소 공급 챔버로 옮깁니다.

이 단계에서는 VNO 절편을 이미징 챔버로 옮기고, 0.1 mm 두께의 합성 섬유로 연결된 스테인리스 스틸 앵커를 사용하여 절편의 위치를 고정합니다. 합성 섬유 실로 조직 절편을 덮지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 이미징 챔버를 기록 장치로 옮기고 실온에서 산소가 공급된 S2 용액을 절편에 지속적으로 관류합니다.

흡입 모세관을 용액 표면에 맞추어 배스 용액이 지속적으로 교환되도록 조절합니다. 그런 다음, 혈관이 포함된 VNO 슬라이스의 비감각 부위 위쪽 가까이에 8-in-1 멀티 배럴 관류 펜슬을 배치합니다. 그 후 150 mM 염화칼륨으로 채워진 L자형 아가르 브리지를 사용하여 참조 전극과 배스 용액을 연결합니다.

그 다음 패치 피펫을 피펫 용액 S4로 채웁니다. 코팅을 긁어내지 않도록 주의하며 헤드 스테이지에 연결된 염화은 코팅 전극 위에 피펫을 장착하고 단단히 고정합니다. 그런 다음 배스(bath)에 진입하기 전에 패치 피펫에 약간의 양압을 가합니다. 피펫의 저항을 모니터링하여 4 MΩ에서 10 MΩ 사이인지 확인하십시오.

적외선 최적화 DIC를 사용하여 CCD 카메라로 VNO 절편을 시각화하고, 형광 조명과 적절한 필터 큐브를 사용하여 FPR-rs3 i-Venus 발현 세포 또는 유사하게 표지된 뉴런을 식별합니다. 최대 감도를 얻기 위해 핸드 휠을 사용하여 세포체에 접근합니다. 양압으로 인해 피펫 팁이 근접하면 세포체 막에 작은 함몰이 보이기 시작합니다.

그 다음 양압을 해제하고 약한 음압을 가해 세포막을 빨아들임으로써 1~20 gigaohms의 높은 저항 씰을 형성합니다. 이어서 짧고 부드럽게 흡입하여 세포막을 파괴하고 whole cell 구성을 확립합니다. 이 그림의 관상면 VNO 조직 절편 공초점 이미지는 비서각 감각 상피 내의 형광 FPR-rs3 Tau Venus 양성 뉴런의 분포를 보여줍니다.

FPR-rs3 Tau Venus 양성 뉴런은 내강 경계에서 노브(knob)와 같은 구조로 끝나는 단일 정단 수지상 돌기를 나타냅니다. 여기에는 VSN 세포체에서 수행된 전체 세포 패치 클램프 기록이 제시되어 있습니다. 다음은 FPR-rs3 양성 VSN의 TTX 민감성 빠른 활성 나트륨 전류에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록의 대표적인 트레이스입니다.

대조군 조건에서의 전압 단계 기록 결과, 전압 의존적인 빠르게 소멸하는 내향 전류가 나타납니다. 1 µM의 TTX 처리 시 이 전류가 크게 감소합니다. 그리고 여기에 표시된 디지털 감산 파형은 TTX 민감성 전압 개폐 나트륨 전류를 보여줍니다.

대표적인 전류 클램프 기록(current clamp traces)은 단계별 양전하 및 음전하 전류 주입 시 발생하는 탈분극, 과분극 및 일련의 활동 전위를 보여줍니다. 숙련될 경우, 두 서골비강(VNO) 모두에 대한 전체 해부 및 조직 절편 제작 과정은 약 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후, 더 많은 수의 뉴런 집단을 분석하여 처리량을 높이기 위해 세포 외 루즈 패치 기록(extra-cellular loose patch recordings)이나 칼슘 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 구강 서골비기관으로부터 급성 조직 절편을 제작하는 방법과 서골비 감각 신경세포로부터 단일 세포 전기생리학적 기록을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.