Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

이 친화성 포획 프로토콜의 전반적인 목표는 포유류 세포에서 내인성 단백질 복합체를 분리하는 것입니다. 이 방법은 어떤 단백질이 물리적으로 연결된 기능 모듈로 함께 형성되는지와 같은 세포 및 분자 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 대상 단백질과 관련된 수많은 물리적 상호 작용이 동시에 관찰될 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1-8g의 세포를 성장시킵니다. 성장 배지를 큰 비커에 붓습니다. 그런 다음 큰 직사각형 아이스팬의 얼음 위에 배양 접시를 놓습니다.

배양 접시에 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 20ml를 추가하고 대형 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 세포를 분리합니다. 얼음에서 미리 냉각된 50ml 튜브로 세포를 옮깁니다. 같은 접시에 얼음처럼 차가운 1x PBS 10ml를 더 추가합니다.

남은 세포를 모아 50ml 튜브로 옮깁니다. 각 요리에 대해 이 과정을 반복합니다. 다른 접시의 세포 현탁액을 결합하여 샘플 수와 플라스틱 폐기물을 줄일 수 있습니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 1, 000 x g에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심 분리 후 상층액을 조심스럽게 붓습니다. 각 펠릿을 얼음처럼 차가운 1x PBS 10ml에 재현탁합니다.

재현탁된 펠릿을 50ml 튜브당 최대 5개까지 통합합니다. 빈 튜브를 PBS 10ml로 씻으십시오. 이전과 같이 통합 샘플과 원심분리기에 용액을 추가합니다.

상등액을 제거한 후 펠릿을 얼음처럼 차가운 1x PBS 10ml에 재현탁합니다. 20ml 주사기에서 플런저를 제거하고 따로 보관하십시오. 주사기의 노즐에 캡을 씌우고 주사기를 50ml 튜브 안에 넣은 다음 세포 현탁액을 그곳으로 옮깁니다.

1000 x g, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리기를 사용합니다. 세포의 최상층이 빨려 들어가기 시작할 때까지 진공 트랩 시스템에 부착된 미세한 팁 피펫으로 상층액을 흡입합니다. 그 결과 습식 세포 펠릿이 생성됩니다.

주사기의 뚜껑을 풀고 플런저를 삽입한 다음 스티로폼 상자의 액체 질소 욕조에 보관된 액체 질소로 채워진 큰 플라스틱 비커에 세포를 직접 떨어뜨립니다. 주사기에서 남은 세포를 강제로 떨어뜨립니다. 다음으로 얼린 세포를 50ml 튜브에 붓습니다.

과도한 액체 질소가 증발할 수 있도록 튜브를 느슨하게 덮습니다. 섭씨 80도에서 하룻밤 동안 유지하십시오. 다음날 캡을 완전히 조입니다.

동결된 세포는 크라이오밀링까지 섭씨 80도에서 이러한 방식으로 보관될 수 있습니다. 섭씨 80도의 냉동고에서 세포 비드를 제거하고 액체 질소 수조의 50ml 튜브 홀더에 넣습니다. 50ml 용기, 20mm 공 2개, 용기 뚜껑을 액체 질소가 들어 있는 깨끗한 직사각형 얼음 양동이에 미리 냉각합니다.

또한 PTFE 절연체를 예냉각하십시오. 퍽 세트 또는 슬리브 앤 퍽을 사용하십시오. 밀링에 적절한 평형을 설정합니다.

집게를 사용하여 사전 냉각된 20mm 밀링 볼 두 개와 동결된 셀을 사전 냉각된 밀링 용기 안에 넣습니다. 항아리에 액체 질소를 최대 절반까지 추가하고 용기에 뚜껑을 놓고 어셈블리를 분쇄기로 옮깁니다. 어셈블리를 제자리에 고정하고 400rpm, 3분, 1분마다 역회전, 인터벌 브레이크 없음 프로그램을 사용하여 3번의 밀링 사이클을 수행합니다.

밀링 중에 볼이 덜거덕거리는 소리를 듣는 것이 중요하며, 이는 볼이 충돌하여 재료를 분쇄하고 있음을 나타냅니다. 이 소리가 들리지 않으면 밀링이 발생하지 않음을 의미합니다. 세 번의 밀링 주기가 완료되면 용기를 다시 액체 질소로 옮기고 잠시 그대로 두어 식힙니다.

뚜껑을 조심스럽게 제거합니다. 집게를 사용하여 볼을 제거하고 미리 냉각된 주걱을 사용하여 미리 냉각된 50ml 튜브로 분말을 옮깁니다. 항아리에 액체 질소를 첨가하면 볼에 굳어진 가루를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.

세포 추출물 준비를 위해 100mg의 세포 분말을 예냉된 1.5ml 또는 2mL 마이크로fuge 튜브에 넣습니다. 빈 마이크로분리 튜브로 분석 저울의 용기를 측정합니다. 액체 질소 냉각 스푼 또는 주걱을 사용하여 세포 분말을 튜브에 분배합니다.

튜브를 액체 질소로 되돌리기 전에 분석 저울에서 튜브 내에 분주된 분말의 질량을 확인하십시오. 셀 파우더가 든 튜브를 열고 실온에서 1분 동안 방치하여 튜브 내부의 압력을 해제하고 파우더에 첨가할 때 추출 버퍼가 즉시 동결되는 것을 방지합니다. 프로테아제 억제제가 보충된 추출물 400마이크로리터를 튜브에 추가합니다.

튜브를 잠시 소용돌이친 다음 얼음을 잡습니다. 마이크로 팁 초음파를 사용하여 샘플에 짧은 저에너지 펄스를 제공하고 응집체를 분산시킵니다. 원심 분리로 추출물을 정화하십시오.

마지막으로 상등액을 제거하고 친화성 캡처를 진행합니다. 친화성 매체를 사전 세척하려면 항체 결합 상자성 비드가 포함된 튜브를 자석에 놓습니다. 비드는 몇 초 안에 튜브 측면에 축적되어 저장 용액을 제거할 수 있습니다.

그런 다음 비드에 500마이크로리터의 추출 버퍼를 추가합니다. 중간 속도로 잠시 소용돌이하여 섞입니다. Pluse는 미니 원심 분리기에서 튜브를 돌려 모든 내용물을 튜브 바닥으로 모읍니다.

그런 다음 자석에 튜브를 놓고 용액을 흡인합니다. 정화된 세포 추출물을 사전 세척된 친화성 배지와 와류를 포함하는 튜브로 간략하게 전달하여 친화성 캡처를 시작합니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 튜브를 배양하고 회전 휠에서 연속적으로 부드럽게 혼합합니다.

구슬은 배양 내내 매달려 있어야 합니다. 상층액을 흡인하고 1ml의 냉추출 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 단백질을 용리시키려면 환원제 없이 SDS 페이지 샘플 버퍼를 추가하여 비드에서 항체 사슬이 방출되는 것을 완화합니다.

실온에서 5-10분 동안 교반하면서 배양합니다. 상층액을 수집 및 저장한 다음 샘플을 SDS 페이지에 적용한 다음 표준 기술을 사용하여 단백질을 염색합니다. 식별을 위해 개별 단백질 띠를 절제하거나 샘플을 짧게만 전기영동하여 단일 분석에서 전체 샘플을 특성화할 수 있습니다.

친화성 포획에 사용되는 불용성 배지를 포함하는 물질은 회수된 단백질체에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 자성 구슬, 철이 함침된 아가로스 및 전통적인 아가로스입니다. 각 배지는 항-FLAG M2 항체에 결합되었으며, cryomilled HEK 293 세포에서 생산된 추출물로 스파이크된 FLAG 태그 박테리아 알칼리 인산가수분해효소를 캡처하는 데 사용되었습니다.

미크론 규모의 마그네틱 비드는 가장 깨끗한 프로파일을 보였으며, 이는 비특이적 단백질 흡착 수준이 상대적으로 낮음을 나타냅니다. 세포 용해 방법은 또한 회수된 단백질체에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서, 내인성 단백질 복합체는 cryomilled 또는 초음파 처리된 세포 추출물로부터 친화성 포획을 받았습니다.

세포 추출물이 cryomilled 세포 분말에서 생성될 때 더 적은 고질량 오염 물질이 관찰되었습니다. 자기 매체가 다른 매체보다 낮은 백그라운드를 나타낼 수 있지만, 항체 자체는 특히 표적 항원이 없는 경우 위양성 오염의 흡착을 촉진할 수 있습니다. 항체 파라톱스가 점유되어 있거나 사용되지 않을 때 anti-FLAG 자기 매체에 의해 기여하는 백그라운드 결합을 결정하기 위해 3x FLAG 펩타이드 스파이크인의 존재 또는 부재 상태에서 HEK 293T 세포 추출물을 사용하여 모의 친화성 캡처 실험을 수행했습니다.

동족 항원결정기가 없는 경우, alpha FLAG medium은 3x FLAG 펩타이드로 경쟁적으로 회피할 수 있고 SDS 페이지 샘플 버퍼에 의해 더 많이 회피할 수 있는 검출 가능한 수준의 배경 단백질을 포착합니다. 지배적인 오염 종은 37에서 50킬로달톤 사이에서 관찰되었습니다. 경쟁 epitope가 있는 경우 3x FLAG 및 SDS 기반 용출은 모두 배경 단백질 결합이 비교적 자유롭습니다.

이 절차를 시도하는 동안 신중하고 신속하며 정확하게 작업하는 것이 중요합니다. 절차와 관찰된 모든 변형을 추적하여 결과에 가장 중요한 단계를 파악하십시오. 이 절차에 따라 질량 분석법, 속도 구역 원심분리 및 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 혼합물의 조성, 균질성 수준, 구성 고분자 복합체의 크기 및 모양을 분석할 수 있습니다.

개발 후, 친화성 포획은 단백질체학 분야의 연구자들이 생리학적 단백질 복합체의 구성을 비교할 수 없을 정도로 자세하게 탐구할 수 있는 길을 열었으며, 이는 지속적인 글로벌 연구 노력으로 남아 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 크라이오밀링을 위해 포유류 세포를 준비하는 방법과 관심 단백질의 친화성 캡처를 실행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.