Name: 플랜트 병원체의 유전자 조작 Ustilago maydis 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 배우세요 Ustilago maydis 유전자 교체 전략을 활용한 곰팡이 유전자 조작 방법입니다. 프로토플래스트 변형과 삭제 돌연변이체 생성을 통해 감염 표현형과 유전자 기능을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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원고의 중요한 읽기 박사 베네딕트 Steuten 특별 감사. chitinases의 원작이 ​​박사 토르스텐 LANGNER에 의해 수행되었다. VG의 기관은 식물 과학 우수 (CEPLAS, DFG EXC 1028)과 BioSC의 클러스터에서 지원, KS의 기관은 BioSC에 의해 지원됩니다. KB는 BioSC에 의해 지원됩니다. 바이오 경제 과학 센터 (BioSC)의 과학 활동은 재정적으로 NRW Strategieprojekt BioSC (313 / 323-400-00213)의 틀 내에서 혁신, 과학 연구의 교육부에 의해 지원되었다. LF는 DFG 국제 연구 교육 그룹 1525 iGRADplant의 박사 친교에 의해 지원됩니다.

삭제를 구축 1. 생성 <ol><li> 각각 1킬로바이트 상류 측면 (UF)과 하류 측면 (DF) 각각 평활 절삭 제한 부위에 의해 측면 적절한 저항성 카세트를 포함하는 결실 구조체 (도 1)를 포함하는 플라스미드를 생성한다. 참고 : 모든 복제 전략을 우리는 플라스미드 9 골든 게이트 복제를 권장합니다 (복제에 대한 참조 22 참조)를 사용할 수 있습니다. </li><li> 삭제 (9)를 구성하여 삭제 1 μg의 DNA를 얻었다 무딘 커터를 이용하여 플라스미드 구축 절제. 효소를 제거하고 상용 시약을 사용하여 22 예를 들어, 버퍼 및 제조업체의 지침을 따르지 삭제 구조를 정화. 주 : 벡터 백본 변환 혼합물에 남아있을 수 있습니다. </li></ol> 원형질체 2. 준비 참고 : 전자의 모든 시간 동안 멸균 상태 유지xperiment. 세포벽은 세포막에 분자의 접근을 제한하는 강한 보호 층이다. 삭제 구조체를 포함하는 DNA의 흡수를 허용하기 위해, 상기 칸막이 벽은 protoplasting 반응에서 효소 분해 셀 벽에 의해 제거 될 필요가있다. 원형질체 제조에서 중요한 단계는 매질 1) 삼투압 안정화하고 2) 원형질체에 기계적 응력을 회피. <ol><li> 마크 2 원형질체를 동결하고 -20 ° C에서 그들을 냉각하는 둥근 바닥 ml의 튜브. 원하는 유전 적 배경을 가진 균주의 신선한 판에서 3 ㎖ YEPS 빛의 사전 문화를 시작합니다. 28 ° C에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어. 참고 : 변형은 solopathogenic 변형 SG200 (10), 야생형 균주 등 AB33 (23), 또는 이중 돌연변이의 생성에 대한 돌연변이 배경으로 테스터 균주가 될 수 있습니다. 변형 원하는 저항의 무료 있는지 확인합니다. </li><li> 당황 FLA는 50 ml의 YEPS 빛의 문화를 희석K와 200 rpm으로하여 28 ° C에서 궤도 통에 품어. 참고 : 배가 시간은 야생형 균주 약 2 시간이다. 세 개의 중복 최소 허용합니다. </li><li> 지수 상까지 성장한다. (1.0 허용 0.6) 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정 된 광학 밀도가 약 0.8 있는지 확인하십시오. OD 1.0 (600)는 약 1 U. 7 10 × 2에 해당 ml의 당 세포를 maydis. </li><li> 현미경으로 오염 세포를 확인합니다. 40 배 배율을 사용합니다. 5 분 1,500 XG의 전체 50 ㎖ 문화의 세포 펠렛과 상층 액을 버린다. 25 ml의 구연산 나트륨, 소르비톨 용액 (SCS), 원심 분리기 5 분, 1,500 XG에 펠렛을 재현 탁하고, 상층 액을 버린다. 주 : 세균 오염이 작고 종종 이동하는 세포로서 식별 될 수있다. 진균 오염물은 U.의 시가 형 세포에 비하여 다른 셀의 형상이나 크기에 기초하여 식별 될 수있다 maydis. </li><li> CEN 중trifugation가 protoplasting 용액을 제조 (12.5 ㎎ / ㎖ 트리코더마는 SCS에서 효소를, 용균, 세포 펠렛 당 3 ㎖를 제조, 필터는 22 μm의 필터를 통해 살균, 솔루션은 최적의 효소 활동에 대한 신선한이어야한다). SCS는 칸막이 벽의 제거시 원형질체의 파열을 방지하기 위해 삼투 성 정제이다. </li><li> 용액 protoplasting 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. RT에서 5 분 20 품어과 세포의 30 ~ 40 %가 원형 또는 pinheads처럼 (그림 2)가 될 때까지 현미경으로 확인합니다. 주 : 지금부터 얼음의 모든 단계를 수행하고주의 원형질체를 처리! </li><li> 10 ml의 감기 (4 ° C) SCS에서 워시 3 배, 5 분 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버리고, 5 분 동안 1,000 XG에서 차가운 소르비톨, TrisHCl, 염화칼슘 2 용액 (STC), 스핀 (10) 용액에 펠렛을 재현 탁. 1 ml의 차가운 STC의 펠렛을 재현 탁 냉각 튜브에 100 ㎕의 분취 량을 확인합니다. 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 분취 량을 동결.</li></ol> 미국의 3 변환 maydis 참고 : 미국의 변환 maydis 원형질체는 기술적으로 간단하고 특수 장비를 필요로하지 않는 일렉트로과 유전자 변형 또는 대향 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 매개 형질 전환 방법에 의존한다. <ol><li> 2 층 선정 플레이트 (전환 반응 당 2 판)을 준비한다. 바닥 층은 배 농도의 항생제가 포함되어 있습니다. 400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 포함 RegLight 정확하게 취하여 12 ㎖ (300 μg의 / ㎖ nourseothricin 또는 4 μg의 / ㎖ carboxin 또는 1 ㎎ / ㎖의 G418) 페트리 접시에. 거품을 피하십시오. 참고 : 아래 층 플레이트 (아래 참조) 4 ° C에서 며칠을 저장하지만, 변환 동안 갓 최상층을 준비 할 수있다. </li><li> 얼음 해동 원형질체 (1 관 / 변환). 1 μL 헤파린 (15 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 1 μg의 DNA (선형화 구조) 또는 10 μL의 H 2 추가 </서브&gt; O (물 관리). 얼음에 10 분 동안 품어. </li><li> 이 시간 동안, 상위 계층에 대한 RegLight 바닥 판에 (60 ° C에 종기 멋진) RegLight를 액화 12 ml의 확산. 참고 :이 계층은 항생제가 포함되어 있지 않습니다. </li><li> 변환 튜브 (3 2)에 500 μL STC / PEG (폴리에틸렌 글리콜)를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 신중 섞는다. 얼음에 15 분을 품어. </li><li> 2 층 RegLight 판의 두 각 변환 반응을 배포한다. . 유리 피펫으로 조심스럽게 천천히 확산 형질 전환 식민지로 성장할 때까지 5 ~ 7 일 동안 28 ° C에서 수직으로 번호판을 품어. 접시 당 약 100 ~ 200 식민지를 얻습니다. 참고 : 낮은 번호가 하나가 너무 많은 세포벽을 포함하기 때문에 DNA를 취할 수 없거나 다시 생성 할 수 없습니다 &quot;나쁜&quot;원형질체에 의해 발생 될 수 있습니다. 전자는 자기 복제 플라스미드, 항생제없이 플레이트상에서 재생을 테스트하여 후자 변환에 의해 시험 될 수있다. </li> &lt;리&gt; / ㎖ 하이 그로 마이신 200 μg의에서 적절한 항생제를 포함 YEPS 빛 접시를 준비한다 (150 μg의 / ㎖ nourseothricin 또는 2 μg의 / ㎖ carboxin 또는 500 μg의 / ㎖ G418, 이러한 농도 바닥 판에 사용되는 하나의 동일한 반). 이 판에 최소 24 추정 형질 전환 식민지를 다시 정화. 단일 콜로니를 얻을 ​​수 있습니다. 비 선택적 미디어의 원래 긴장 밖으로 동시에 행진에서. 참고 : 후판 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 수정 삭제 이벤트 4. 확인 참고 : 돌연변이는 3 단계 절차에서 확인된다 (그림 1). 먼저, 유전자의 야생형 카피를 포함하는 후보 PCR에 의해 제외된다. 둘째, 상기 궤적에 저항성 카세트의 통합은 PCR에 의해 확인된다. 셋째, 오직 원하는 궤적에 저항성 카세트의 통합을 서던 블롯 분석에 의해 확인된다. 주의 변형 검증 야망이다ntial는 돌연변이 표현형 정말 삭제와 상관 관계가 있도록. <ol><li> 먼저 진단 PCR (20) <ol><li> 유전자의 디자인 프라이머 쌍은 250-600 BP (그림 1)의 제품에서 그 결과를 삭제합니다. 이러한 작은 제품은 식민지 PCR로 증폭하기 쉬운 표준 겔 전기 영동의 검출을위한 충분한 시간이다. </li><li> 각 후보 및 양성 대조군으로 원래의 균주를 들어, 20 ㎕의 0.02 M 수산화 나트륨에 이쑤시개로 하나의 식민지의 전지 재료의 약간의 (a 핀 머리의 양)을 재현 탁. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 참고 : 신선한 식민지를 사용합니다. 판 1 주 재 행진보다 오래된 경우 새로운 식민지를 얻을 수있다. </li><li> 바로 PCR에 대한 세포 현탁액 1 μl를 사용한다. 표준 PCR 반응을 실행하고 결과 조각을 분석 할 수 있습니다. 주의 : 이러한 샘플이 저장 될 수 없다. 참고 : 따라서이 PCR은 야생형 유전자의 존재에 대한 테스트 및 부정적인 CAND를 신속하게 식별 할 수 있습니다관심있는 유전자를 대체되어 있지 않은 idates. 이 PCR 반응에 밴드를 산출 클론이 삭제됩니다. 그러한 부정적인 클론은 어쨌든 추가 음성 대조군으로 함께 수행되어야한다. PCR 산물없이 후보 더 분석한다. 나머지 절반은 밴드가 발생하지 않아야하는 동안 해로운 영향없이 유전자에 대한 후보자의 약 절반은 야생형 유전자를 포함해야합니다. 이것은 50 %의 상 동성 재조합 속도에 대응한다. </li></ol></li><li> 둘째 진단 PCR <ol><li> 게놈 DNA의 준비. 주 : 게놈 DNA (gDNA를)는 두 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하여 제조 할 수있다. 첫 번째는 페놀과 클로로포름 따라서 만 두 번째도 4.2 4.2.1.6에 설명 된 경험이 적은 학생들 (처리 할 수있는 반면 (4.2.1.5에 4.2.1.1에서 설명) 경험이 풍부한 연구자들에 의해 처리되어야 같은 독성 시약을 포함한다. 1.11). 두 프로토콜은 안정적으로 노력하고 있습니다. 단계 4.2.1.1은 모두 protoc 동일합니다OLS. <ol><li> 각 후보와 5 ml의 YEPS 빛을 접종하고 28 ℃에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어. 형상 관리 접시에 배양 2 μl를 삭제합니다. 멸균 문화를 유지합니다. 참고 : 다음 표준 프로토콜 (: 독성 단계주의)이다. </li><li> 2 ml의 튜브에 1 국자 염산 세척 유리 구슬 (~ 200 μl를) 넣습니다. 미국의 2 ML을 추가 maydis 문화. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. (펠릿이 단계에서 얼 수) 상층 액을 버린다. (24 : 1 ~ 25) 펠릿에 500 ㎕의 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올을 추가합니다. 주의! 페놀 독성! </li><li> 1,000 rpm에서 vibrax에 500 ㎕를 모보 우스 - 용해 버퍼 6 분 10 1. 동요를 추가합니다. 세포 펠렛을 완전히 재현 탁되어 있는지 확인하지만, gDNA를의 전단을 방지하기 위해 진동 확장하지 마십시오. 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. 새로운 반응 관에 수성 단계의 400 μl를 전송 (상간을 만지지 마십시오). </li><li> 1 ml의 100 % (v / v)의 에탄올을 추가합니다. ㄴ 관찰, 혼합 튜브 배를 반전곧 나타납니다 DNA의 소리. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. 상층 액을 제거하고 200 μL 70 % EtOH로 씻는다. 이 단계에서 펠렛을 재현 탁하지 마십시오. </li><li> (펠릿이 완전히 건조시키지 않음) 완전히 뜨는을 제거합니다. 50 ㎕의 TE /의 RNase를 추가합니다. 10 분 동안 50 ℃에서 400 rpm으로 진탕하여 gDNA를 녹인다. 0.8 % 아가로 오스 겔 (20)의 gDNA를 2 μL를 분석한다. 참고 : 아래의 단계는 다른 비 독성 프로토콜을 포함한다. </li></ol></li><li> 게놈 DNA의 다른 제조 <ol><li> 염산 2 ㎖의 튜브에 유리 구슬을 세척의 1 국자 (~ 200 μl를) 넣습니다. 미국의 2 ML을 추가 5 분 동안 12,000 XG에 maydis 문화와 스핀. (펠렛이 단계에서 얼 수) 상층 액을 버린다. </li><li> 펠릿에 500 ㎕를 모보 우스 용해 버퍼 (2)를 추가합니다. 1,000 rpm에서 vibrax에 5 ~ 15 분 동안 흔들어. 세포 펠렛을 완전히 재현 탁되어 있는지 확인합니다. </li><li> 15 ~ 20 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어. 아프로 사용2 ml의 튜브를 호스팅하기 위해 설계 절한 인큐베이터 중요합니다. 그런 다음, 5 분 동안 얼음에 놓습니다. </li><li> 100 ㎕를 8 M 칼륨 아세테이트, 소용돌이를 추가 또는 8 ~ 10 번 반전. 실온에서 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. </li><li> 전송 (500) 신선한 1.5 ML 튜브에 뜨는의 μL, 400 μL 이소프로판올을 추가합니다. 소용돌이 또는 반전 8 ~ 10 시간. 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. 상층 액을 제거하고 500 μL 70 % EtOH로 씻는다. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. </li><li> 완전히 뜨는을 만끽! 결국, 잔류 액체를 제거하기 위해 짧은 스핀 (10 초)를 추가합니다. 3 ~ 5 분 동안 DNA 펠릿 건조를 할 수 있습니다. 50 ㎕의 TE / RNAase을 추가하고 400 rpm에서 10 분 ~ 15 50 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 설계 중 하나가 (UF-F, RC-R, RC-F, DF-R,도 1) 측면 외부에 결합되고 저항 카세트 내 결합 중 대응하는 두 쌍의 프라이머 9. </li><li> 모든 C의 gDNA를의 1:10 희석의 1 μl를 사용하여andidate 2 PCR 반응에서 템플릿으로 업스트림 및 다운 스트림 9 올바른 삽입을 확인. </li><li> 각 후보에 대한 표준 PCR 반응을 사용하여 조각 (22) 결과 분석한다. 주의 : 이러한 PCR들 정확한 게놈 로커스에서 저항 카세트의 삽입 테스트. 제품은 양쪽 모두 얻은 경우, 후보 가능성이 올바른 삽입합니다. 그러나, (다운 스트림 상류 나) 한쪽 만이 확인 될 수도 후보는 PCR 반응은 단순히 하나의 측면에 실패했습니다 경우 추가 분석을 위해 함께 수행되어야한다. </li></ol></li></ol></li><li> 남부 오 점 분석 (22)에 의해 수정 게놈 삽입의 검증 <ol><li> 유전자 또는 명확하게 DIST에 선도적 인 저항 카세트에 하나 절단, 구성하고 추가 / 궤적 외부 인하 적절한 효소 (15) 돌연변이 후보의 gDNA를 ㎕의 (4.2.1)와 대응하는 야생형 / 전구 변형 다이제스트inguishable 패턴 (그림 1) 8. 참고 : 그들이 소화되지 않은 DNA에서 명확하게 구별되도록 예상 밴드 없음,보다 큰 10킬로바이트 없어야합니다. </li><li> 상류 및 프로브와 같은 다운 스트림 측면을 사용합니다. 예는 PCR DIG 라벨 키트 또는 유사한 표준 방법을 사용할 수 있도록 라벨을합니다. 1에 표시된 프로브를 혼합 : 1 분 비율과 남부 오점을 실시하고 있습니다. 적어도 두 개의 독립적 인 올바른 형질 전환 체를 유지합니다. 주 : 야생형 패턴 원래 균주 명확히 검출되어야하며, 올바른 클론 만 예상 밴드를 포함한다. 후보 만 존재하는 추가 밴드는 잘못된 현장에서 구조의 다른 삽입을 나타냅니다. 이러한 클론 폐기해야합니다. 첫 번째 진단 PCR에서 확인 된 부정적인 후보는 잘못 통합 삭제 구조의 야생형 밴드와 (크기 예측할 수없는)의 주파수 대역을 포함해야합니다. </li></ol></li><li> 글리세롤 주식 참고 : 글리세롤 주식 변형 컬렉션 년 동안 클론을 유지하는 역할을한다. 적어도 두 개의 독립적 인 형질 전환 체는 각각의 돌연변이에 대한 보관해야합니다. 이 동일해야합니다 비교 표현형을 할 수 있습니다. <ol><li> 500 ㎕를 NSY 글리세롤 매체와 각 문화의 28 ° C 믹스 500 μl를 24 시간 동안 회전 바퀴에 YEPS 빛에서 확인 된 돌연변이 균주 5 ml의 문화를 성장. 문화와 매체가 잘 혼합 될 때까지 튜브를 반전. 매체 글리세롤 얼음 결정의 형성을 방지한다. </li><li> -80 ° C에서 고정. 재고가 작동하면 다시 연속 동결 문화의 일부를 테스트합니다. </li></ol></li></ol> 5. 현미경 표현형 <ol><li> 28 ° C에서 12 시간 동안 회전 바퀴에 YEPS 빛의 야생형과 돌연변이 균주 5 ml의 문화를 성장. </li><li> 다음 날, 약 0.1의 OD 600 문화를 희석 0.5과 0.7 사이의 OD 600까지를 성장. 1.0 corresp의 OD (600)onds 약 1 7 10 × 2의 미국에 ml의 당 세포를 maydis. </li><li> 현미경으로 세포 형태를 검사합니다. 참고 : 건강한 세포는 시가 모양 (그림 4, WT)에 나타납니다. 발음 액포 또는 필라멘트의 형성은 세포가 스트레스를 나타냅니다. 주 : 리포터 균주 적절한 분석은이 단계에서 수행 될 수 사용할 경우 예상되는 돌연변이 표현형에 따라 분석은, 예를 들면, 적용 할 수있다. 세포 형태가 변경 통계적 분석이 수행되어야하는 경우 예를 들어, 평균 셀 길이를 결정한다. </li></ol> 6. 감염 분석 참고 : 종묘 감염 분석이 저널 11에 이미 가시화되고있다. 이 중 수 등 SG200 10 또는 모두 돌연변이를 수행 호환 결합 파트너를 혼합하여 반수체, solopathogenic 변형 배경을 이용하여 수행 될 수있다. <ol><li> 당 최소 40 옥수수 모종을 성장16 시간, 200 μE / 22 ° C (주 / 야간) 28 ° C의 빛을주기에 7 일간 변형. 그들은 3 잎 단계 및 10~15cm 감염의 날에 높이에 있어야합니다. </li><li> 이틀 감염 전에, 28 ° C에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 5 ml의 YEPS 빛의 균주의 사전 문화를 시작합니다. YEPS 빛이 600 = 1.0 OD 50 ml의 주 문화를 성장 (세포 분열 속도 = 2 시간을 3 분할의 최소 허용, O / N을 수행 할 수 있습니다). </li><li> 5 분 1,500 XG에 50 ㎖ 문화의 세포를 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. 멸균 H 2 O 씻을 배 OD 3.0 600 무균 H 2 O의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 결합 파트너를 섞는다. </li><li> 작은 주사기를 사용 칠일 된 옥수수 모종의 줄기에 세포 현탁액 500 μL - 250을 주입. 대조군으로 멸균 H 2 O를 사용합니다. 같은 빛과 온도 조건에 추가 7-14일에 대한 감염된 모종을 유지합니다. 각 공장 (a)의 표현형 점수건강, 백화, 안토시아닌 형성, 작은 종양, 큰 종양, 죽은 식물 10 ccording. 참고 : 점수가 이르면 칠일 등의 수행 시간이 지남에 감염 따라 14 일에서 반복 될 수있다. </li></ol>

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이 프로토콜은 미국에서 역 유전 연구에 대한 결실 돌연변이 체를 생성하는 방법에 대해 설명 maydis. 시작점은 나란히 7,9 최적화되었을 유전자의 관심에 대한 1 시작 상류 및 정지 코돈의 하류 KB뿐만 아니라 적절한 저항성 카세트의 서열을 함유 플 랭킹 서열을 포함하는 결실 구조체이며 . 구조는 개별적으로 각각의 유전자에 대해 생성 조심스럽게 유전자를 삭제하기 전에 시퀀스 오류를 확인해야합니다. 측면은 이웃 유전자에 도달하거나 돌연변이 규제 요소를 수정하는 경우 측면에 점 돌연변이는 특히 게놈 시퀀스에서 원치 않는 변화를 일으킬 수 있습니다. 이것은 모든 형질 전환에 영향을 미칠 것이며, 목적 유전자 결실 무관 표현형 및 부작용을 일으킬 수있다. 삭제 전략을 계획 할 때, 예상되는 표현형은 유전 적 배경을 선택하기 위해 고려되어야. 본 경우 AB33 23 SG200 (10)은 형태...

Ustilago maydis는 수십 년 1, 2에 대해 광범위하게 연구 된 식물 병원성 모델 균류이다. 그것은 두 모폴로지, 효모와 같은 비 병원성 단계와 사상, 전염성 형태 3에 존재합니다. 이러한 상동 재조합 DNA 복구 메커니즘으로서 보편적 인 획기적인 발견이 균 4 효모 유사 성장 단계에서 이루어졌다. 또한, 감염에 대한 중요한 감염 필라멘트 및 독성 요인에 대한 형태 학적 스위치 5,6를 잘 특징이다. 이 검댕 곰팡이의 생물학 및 독성에 대한 증가하는 분자 지식은 훌륭한 게놈 주석 (10)와 사용 역 유전학의 용이성, 예를 들면, 우리 연구소에서 잘 조직 된 플라스미드 컬렉션 (HTTP가 지원하는 간단한 유전자 교체 전략 7-9에 의존 : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). 옥수수의 표준화, 신속한 감염 분석eedlings는 병원성의 상세한 연구 (11) 요인을 감안. 미국의 게놈 maydis는 약 6,900 유전자 (10)를 포함한다. 그 기능을 연구하기 위해, 그들은 인해 효율적인 상동 재조합 시스템에 개별적으로 또는 조합으로 삭제 될 수있다. 완벽 상동 끝을 포함 약 1킬로바이트의 측면 영역은 50 % 이상 상동 재조합의 속도에 적합하지만, 비 동종 끝 이미 250 bp의이 구조물 (9)의 올바른 통합을 어느 정도 할 수 있습니다. 현재, 다섯 가지 저항 카세트, 하이 그로 마이신, carboxin, nourseothricin, G418 및 phleomycin에 대한 저항을 매개 hygR, cbxR, natR, G418R, 및 phleoR는 형질 전환 7,9에 대한 선택 사용된다. 또한, 하이 그로 마이신 내성 이종 FLP 재조합 효소 (12)의 일시적인 발현에 의해 제거 될 수있는 재활용 카세트 (FRT-hygR)로 개발되어왔다. 이 저항 카세트하여 이론 무제한 유전자 변형에 제거 할 수 있습니다. Phleomycin 새로운 카세트와 재활용 hygR 카세트 특히 phleoR의 사용이 감소되도록 13 돌연변이이다. 콰 드러 돌연변이 따라서 다른 네 카세트를 사용하여 생성 될 수 있으나, 배의 변이체를 들어, FRT-hygR 시스템 (14)을 추천한다. 이 일반적인 유전자 결실 전략은 성공적 Sporisorium의 reilianum 15, 미국 등의 다른 검댕 곰팡이로 전송 된 hordei (16), 또는 U. 라 esculenta 17 때문에 효율적인 상동 재조합 시스템 아직 유전자 어려운 유기체에서 상기 애플리케이션에 대한 가능성을 제공한다. 관련된 유전자의 결실에 의해 예시 된 바와 같이 또한, 상동 재조합이 결여 생물 유전 공학을 개선하기 위해 수정 될 수 비 동성 엉D-가입 뉴로 crassa의 18, 19에. 여기에서 우리는 미국에 대한 게시 된 유전자 삭제 전략을 설명 후보자의 신속하고 정확한 검증에 초점을 맞춘 실험 자세히 7,9를 maydis. 예를 들어, 우리는 진균 chitinases를 사용하여 단일 돌연변이의 발생뿐 아니라 다수의 삭제 20,21 종자 도시한다. 그들은 강성 세포벽 키틴에 작용하기 때문에 Chitinases은 흥미로운 예이다. 세포벽 리모델링이 세포 분열시 형태 변화 필요, 사상 성장과 포자 형성에 전환합니다. 따라서, 결실 돌연변이 체의 수명주기 동안 표현형을 기대할 수있다.

<table><tbody><tr><td>아미노벤조익산 (Free Acid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천&nbsp;</td><td>BD</td><td>214010</td>은 <td>현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td>를 사용<td>하거나,</td><td>현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>Bacto 효모 추출물</td>을 사용211677;<td>BD</td><td>212750</td>은 <td>현지 공급 업체</td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Gr&uuml을 사용합니다. ssing GmbH</td><td>10234</td><td>또는 현지 공급</td></tr><tr><td>업체 Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr><tr><td>Carboxin을 사용하십시오.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>카사미노산&nbsp;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>콜린클로리드</td><td>시그마 알드리치</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>시트르산</td><td>ChemSolute</td><td>24,321,000</td>은 <td>현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>CuSO4*5H2O</td><td>Fluka</td><td>61240</td>을 <td>대안적으로 사용하고 현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>D(+)Sucrose를 사용합니다.</td><td>Roth</td><td>4621.1</td>은 <td>현지 공급</td></tr><tr><td>업체 DNA degr. free acid를</td> 대안적으로 사용합니다.<td>시그마-알드리치</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3*6H2O</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>10288</td>은 <td>현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>Geneticin (G418) disulfate salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma lysing enzymes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucose</td><td>Caelo</td><td>2580</td>을 <td>대안적으로 사용하고 현지 공급업체</td></tr><tr><td>인 Glycerin을 사용합니다.</td><td>Fisher Chemical</td><td>은</td><td>현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>H3BO3</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td> 위험 물질을 대안적으로 사용할 G065015<td>. 제조업체의 안전 지침을 확인하십시오.</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>하이그로마이신 B-용액</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>위험한 물질.&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl VWR</td><td></td><td>26764298은</td><td>현지 공급 업체</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td>을 <td>대안적으로 사용하고 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>MgSO4 물을 사용하지 않는</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td><td>물이 없는 것이 중요합니다. 또는 현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>MnCl2*4H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td>을 <td>사용하거나 현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA*2H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td>을 사용하거나 <td>현지 공급업체</td></tr><tr><td>를 사용합니다.Na2MoO4*2H2O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>또는 현지 공급업체를 사용하십시오</td></tr>. Na<tr><td>2SO4</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12174</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>현지 공급 업체</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13,751,000</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>Nicotinic acid (Free acid)</td> <td>Sigma를 사용합니다. Aldrich</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin 디하이드로겐 황산염&nbsp; &nbsp;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5,001,000</td><td></td></tr><tr><td>영양소 육수&nbsp;</td><td>Difco</td><td></td><td>현지 공급 업체</td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) pH 6.7</td><td>시그마 알드리치</td><td>P3803</td><td>위험 물질. 제조업체의 안전 지침을 확인하십시오.</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 (PEG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>AppliChem</td><td>121479</td><td>대안적으로 현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>Pyridoxin (monohydrochlorid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin을 사용하십시오.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>소형 주사기</td><td>BD</td><td>300300</td><td>사용 또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>멸균 필터, 22 &micro를 사용합니다. m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td>사용 또는 현지 공급</td></tr> 업체 <tr><td>Thiamin-hydrochloride</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>tri-Na-Citrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>사용 S332060</td><td>현지 공급 업체</td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl) aminomethane</td><td>VWR</td> <td>사용103156X</td>는 <td>현지 공급업체</td></tr><tr><td>인 Tris hydrochloride</td><td>Roth</td><td>9090.4</td>를 <td>사용하거나 현지 공급업체</td></tr>인 <tr><td>Triton X-100을 사용합니다.</td><td>세르바&nbsp;</td><td>37240</td><td>또는 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Fluka</td><td>96470</td><td>또는 현지 공급 업체 사용</td></tr><tr><td>용액 구성 / 재료</td><td></td><td></td> 준비 <td>용액 구성</td></tr><tr><td>Carboxin</td><td></td><td></td><td>재고 : 메탄올 5 mg / ml, 최종 농도 : 2 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>CM 플레이트</td><td></td><td></td><td>0.25 % (w/v) 카사미노산, 0.1 % (w/v) 효모 추출물, 1.0 % (v/v) 홀리데이 비타민 용액, 6.25 % (v/v); Holliday 소금 용액, 0.05 % (w / v) DNA degr. 유리산, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; 5 M NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하십시오. 오토클레이브 후 1% 포도당을 첨가하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td></td><td></td> <td>재고 : H2O에서 50 mg / ml, 최종 농도 : 500 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>HCl 세척 유리 구슬(0.35-0.45mm)</td><td></td><td></td><td>유리 구슬을 농축된 HCl(25%, 7.8M)로 덮고 60분 동안 배양합니다. 여러 번 흔들어줍니다. 디캔트 HCl(디캔트 액체 보관) 및 유리 구슬을 3M HCl(디캔트 액체 보관)로 세척합니다. pH가 7이 될 때까지 이중 증류된 H2O로 유리 구슬을 여러 번 세척합니다(액체는 더 이상 황록색이 아니어야 함). 유리 구슬을 분주하고 180°C에서 건조시킵니다. 디캔팅된 HCl은 폐기 전에 중화되어야 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>헤파린</td><td></td><td></td><td>재고 : 15 mg / ml</td></tr><tr><td>Holliday 소금 용액</td><td></td><td></td><td>16.0 &permil; (승/패) KH2PO4, 4.0 &permil; (승/패) Na2SO4, 8.0 &permil; (승/패) KCl, 1.32 &permil; (승/패) CaCl2*2H2O, 8.0 & (V/V) 미량 원소, 2.0 &permil; (승/패) MgSO<이하 >4</이하 >; 멸균 여과액</td></tr><tr><td>Holliday 비타민 솔루션&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1&permil; (승/패) 티아민, 0.05&permil; (승/패) 리보플라빈, 0.05&permil; (승/패) 피리독신, 0.2&permil; (승/패) Ca-판토테나트, (0.05&permil; (승/패) 아미노 벤조산, 0.2&permil; (승/패) 니코틴산, 0.2&permil; (승/패) 콜린클로라이드, 1.0&permil; (w/v) 미오-이노시톨; -20 &deg에서 저장 될 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td></td><td></td><td>재고 : PBS에서 50 mg / ml, 최종 농도 : 200 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td></td><td></td><td>재고 : H<2 / sub>O에서 200 mg / ml, 최종 농도 : 150 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>NSY-글리세롤-매체</td><td></td><td></td><td>0.8 % (w/v) 영양 육수, 0.1 % (w/v) 효모 추출물, 0.5 % (w/v) 자당,&nbsp; 80.0 % (v/v) 87% 글리세린 (f.c. 69.6%)&nbsp;</td></tr><tr><td>RegLight</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) 효모 추출물&nbsp; 0.4 % (w/v) 박토 펩톤, 0.4 % (w/v) 자당, 18.22 % (w/v) 소르비톨, 1.5 % (w/v) 한천</td></tr><tr><td>SCS, pH 5.8</td><td></td><td></td><td>용액 1: 20 mM 트리-Na-시트레이트, 1 M 소르비톨; colution 2: 20 mM 구연산, 1 M 소르비톨, pH 5.8에 도달할 때까지 용액 1에 용액 2를 첨가; 오토클레이브</td></tr><tr><td>STC, pH 8</td><td></td><td></td><td>1 M 소르비톨, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; 필터 멸균</td></tr><tr><td>STC/PEG</td><td></td><td></td><td>40 % (v/v) PEG in STC-buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>TE 완충액, pH 8</td><td></td><td></td><td>1.31 mM 트리스 베이스, 8.69 mM 트리스 -HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O</td></tr><tr><td>TE/RNase</td><td></td><td></td><td>10 &마이크로; TE 완충액에 있는 g/ml RNaseA</td></tr><tr><td>미량 원소</td><td></td><td></td><td>0.06&permil; (승/패) H3BO3, 0.14&permil; (승/패) MnCl*4H2O, 0.4 & (승/패) ZnCl2, 0.4 & (승/패) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 &permil; (승/패) FeCl3*6H2O, 0.04&permil; (승/패) CuSO4*5H2O</td></tr><tr><td>Trichoderma 용해 효소 용액</td><td></td><td></td><td>12.5 mg/ml SCS; 필터 멸균;</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td></td><td></td><td>806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base를 사용하기 직전에 준비; pH를 확인하고 필요한 경우 HCl로 조정; 오토클레이브</td></tr><tr><td>Usti-lysis 버퍼 1, pH 8</td><td></td><td></td><td>10mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM NaCl, 1%(w/v) SDS, 2%(v/v) TritonX-100, 1mM EDTA. pH 측정기를 사용하여 pH를 측정하지 마십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>Usti-lysis buffer 2</td><td></td><td></td><td>mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio</td></tr><tr><td>YEPS-Light medium</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) 효모 추출물, 0.4% (w/v) 박토 펩톤, 0.4% (w/v) 자당, 플레이트: 1.5% (w/v) Bacto Agar</td></tr></tbody></table>

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

유전자 결실은 유전자 기능 분석에 중요한 역할을한다. 타겟 방식으로 유전자를 방해하는 가장 효율적인 방법 중 하나는 상동 재조합을 통해 선택 마커 전체 유전자의 교체이다. 상동 재조합 동안 DNA의 교환은 유사도가 높은 순서 사이에 발생한다. 따라서, 표적 유전자를 플 랭킹 선형 게놈 서열은 특히 원하는 통합 사이트에 선별 마커를 지시하는데 사용될 수있다. 삭제 구조의 무딘 끝은 세포의 DNA 복구 시스템을 활성화하여 상동 재조합을 통해 또는 비 - 상동 - 최종 가입하여 어느 구조의 통합을 촉진한다. 효율적인 상동 재조합 유기체에서, 성공적인 유전자 결실의 비율은 50 % 이상이 전략에 유용한 유전자 파쇄 시스템하게 도달 할 수있다. Ustilago가 maydis 검댕 곰팡이는 효율적인 상동 recombinat을 나타내는 진핵 모델 미생물이다이온. 그 약 6,900 유전자 가운데 많은 기능 삭제 돌연변이의 도움으로 특징되었고, 유전자의 필수 기능에 유전자 교체 시도 포인트의 실패를 반복했다. 형광 마커 또는 예측 도메인의 돌연변이 태그에 의해 유전자 기능의 후속 특성은 상동 재조합을 통해 DNA 교환에 의존합니다. 여기, 우리는 미국이 제시 가장 간단한 예를 들어, 유전자 결실을 이용하여 상세히 maydis 변형 생성 전략.

미국으로 인코딩 네 chitinolytic 유전자의 삭제 구조 maydis 게놈 cts1의 삭제에 대한 hygR 카세트를 사용하여 골든 게이트 복제에 의해 생성 된의 natR cts2의 삭제, cts3의 삭제 및 cts4 (20)의 삭제를위한 cbxR에 대한 G418R 카세트. 유전자 치환 전략의 일반적인 개요는 cts3의 삭제 (도 1)에 의해 예시된다. 두 번째 chitinolytic 유전자 cts1의 단일 및 이중 돌연변이 독성에 chitinases의 역할 분석을위한 두 개의 서로 다른 유전 적 배경에서 동일한 구조와 순차적으로 생성되었다. 두 개의 서로 다른 변형 배경이 사용되었다 : AB33은 사상 성장을 유도 할 수 있...

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 검댕이 곰팡이인 ustilago maydis를 유전적으로 변형하는 것입니다. 이 균주 생성 방법을 사용하면 다양한 방법으로 유전자의 기능적 특성을 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 유전자를 삭제하거나, 프로모터스를 교환하거나, 융합 구조를 생성할 수 있습니다.이 방법의 가장 큰 장점은 변형을 정확하게 확인할 수 있으므로 모든 표현형이 관심 유전자의 변화와 직접 연결될 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 원형지속형 반응을 멈출 때를 아는 것이 성공적인 변환을 위해 중요하기 때문에 필수적입니다. 준비 과정에서 섭씨 영하 20도에서 두 개의 밀리리터 원형 바닥 튜브를 식히십시오.다음으로, 새 플레이트를 사용하여 YEPS-Light에서 3ml 사전 배양을 접종합니다. 섭씨 28도의 회전 바퀴에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 당황한 플라스크에 25마이크로리터의 YEPS-Light에 50ml의 YEPS-Light를 첨가합니다.그런 다음 지수 단계에 도달할 때까지 오비탈 셰이커에서 배양을 성장시킵니다. 광학 밀도 1.0은 ustilago maydis의 7번째 세포에 1-2배 10에 해당합니다. 600나노미터에서 광학 밀도를 확인하십시오.0.6에서 1.0 사이의 값을 사용할 수 있습니다. 다음으로, 40배 배율에서 세포의 오염 여부를 확인합니다. 박테리아 오염은 작고 자주 움직이는 세포로 식별할 수 있습니다.곰팡이 오염은 모양이나 크기에 따라 식별할 수 있습니다. 항상 오염된 문화는 버리고 깨끗한 문화권에서만 작업하십시오. 1, 500 G에 5 분 동안 세포를 펠릿으로 만든 후, 상층제를 버리십시오.그런 다음 펠릿을 25ml의 SCS에 다시 현탁시킵니다. 원심분리를 반복합니다. 한편, 세포 펠릿 당 3 밀리리터의 프로토플라스트 용액을 준비합니다.이 용액을 22미크론 필터에 통과시킵니다. 이제 상등액을 버리고 펠릿을 2 밀리리터의 프로토플라스팅액에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포의 30-40%가 원형 또는 핀 머리 모양이 될 때까지 세포를 실온에서 그대로 두십시오.반응은 5분에서 20분 정도 걸릴 수 있습니다. 5분 후에 현미경으로 관찰을 시작하십시오. 최대 변형 효율을 얻으려면 프로토 소성 반응을 적시에 중단해야합니다.그런 다음 원형아체를 마치 비눗방울처럼 매우 조심스럽게 다루어야 합니다. 프로토콜을 진행하고 항상 원형체를 얼음 위에 두십시오. 다음 단계는 10 밀리리터의 차가운 SCS로 세척 한 다음 1, 000 G에서 5 분 회전으로 수집하는 것입니다.이 세척 단계를 총 3 번 반복하십시오.세척 후 펠릿을 10ml의 차가운 STC에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 1, 000 G에서 또 다른 5 분 회전으로 세포를 다시 수집 한 다음 1 밀리리터의 차가운 STC에서 다시 현탁시킵니다. 이제 콜드 튜브에 100마이크로리터 분취액을 만들고 이 분취액을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.ustilago maydis protoplasts를 형질전환하려면 형질전환당 두 개의 선택을 준비합니다. 먼저 RegLight 한천을 녹여 섭씨 60도로 식힙니다. 그런 다음 녹인 한천 중 일부에 작업 농도의 두 배로 선택적 항생제를 첨가하고 각 플레이트에 12ml를 추가하여 바닥 층을 형성합니다.샘플은 조심스럽게 혼합해야 합니다. 거품을 만들지 마십시오. 항생제를 사용하지 않고 남은 RegLight를 섭씨 60도로 유지하십시오.다음으로, 각 변형을 위해 얼음 위에서 원형질체 튜브 하나를 해동합니다. 해동되면 1마이크로리터의 헤파린 용액과 1마이크로그램의 선형화된 구성 DNA를 추가합니다. 그런 다음 10분 동안 얼음 위에 두십시오.기다리는 동안 항생제가 없는 RegLight 12ml를 항생제가 든 RegLight 위에 펴 바릅니다. 다음으로, 각 변형 튜브에 500마이크로리터의 STC/PEG를 추가하고 반전과 조심스럽게 혼합합니다. 그런 다음 얼음 위에서 15분 더 배양을 계속합니다.이제 각 형질전환 반응을 두 개의 개별 선택적 RegLight 플레이트에 분배합니다. 계속하기 전에 모든 액체가 플레이트에 스며들었는지 확인하십시오. 그런 다음 섭씨 28도에서 5-7일 동안 플레이트를 똑바로 세워 100-200개의 군체를 얻습니다.만약 소수의 군체만 자라난다면, 원형아세포는 너무 많은 세포벽을 포함하고 있을 수 있으며, 이는 세포 제작 플라즈마로 형질전환시켜 검사할 수 있으며, 그렇지 않을 수도 있으며, 이는 항생제 없이 플레이트에 심어 테스트할 수 있습니다. 나중에 테스트를 위해 24개의 변형체를 선택합니다. 선택적 YEPS-Light에서 재정화하여 단일 콜로니를 얻습니다.또한 각 플레이트에서 원래 균주의 일부를 줄무늬를 제거하여 항생제가 비형질전환제에 대해 선택되는지 확인합니다. 2개의 PCR과 서던 블롯 분석을 포함하는 3단계 프로세스를 사용하여 돌연변이를 확인하는 것이 중요합니다. 이는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.이 섹션에서는 이러한 분석에 필요한 게놈 DNA를 준비하는 방법을 설명합니다. 먼저 YEPS-Light 5ml에 후보 형질전환체를 접종하고 섭씨 28도에서 24시간 동안 회전하는 바퀴에서 배양합니다. 다음날, CM 플레이트에 2 마이크로 리터의 배양액을 떨어 뜨립니다.문화를 무균 상태로 유지하십시오. 그런 다음 약 200 마이크로 리터의 염산 세척 유리 구슬과 2 밀리리터의 24 시간 배양액이 담긴 2 밀리리터 튜브를 준비합니다. 12, 000G에서 5분 동안 튜브를 회전시킨 후 상층액을 흡인하고 버립니다.보관을 위해 냉동할 수 있는 펠릿에 500마이크로리터의 usti-lysis buffer 2를 추가합니다. 그런 다음 Vibrax에서 1, 000RPM으로 튜브를 5-15분 동안 흔듭니다. 세포가 완전히 다시 부유되었는지 확인한 다음 섭씨 65도에서 15-20분 동안 튜브를 배양합니다.그런 다음 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 냉각되면 100 마이크로 리터의 8 몰 아세트산 칼륨을 넣고 짧은 소용돌이 또는 10 번의 반전을 가합니다. 그런 다음 실온에서 12, 000G에서 15분 동안 튜브를 돌립니다.그런 다음 500 μl의 상등액을 1.5 millil tube에 분취하고, 400 μl의 isopropanol을 분취액에 첨가합니다. 섞기 후에, 12, 000 G.Disbarkant에 5 분 동안 관을 회전시키고 70%ethanol의 500 마이크로리터를 가진 펠릿화된 DNA를 세척하십시오. 이제 5분 동안 회전하고 상층액을 완전히 제거합니다.다시 한 번 간단히 회전한 후 DNA 펠릿을 몇 분 동안 자연 건조시킨 다음 RNase NTE 50마이크로리터를 추가합니다. RNase를 추가한 후 쉐이킹으로 배양한 다음 분석을 위해 DNA를 사용합니다. chintinases cts3 delta의 단일 및 이중 돌연변이와 최대 3개의 다른 키티나제 유전자를 가진 다중 돌연변이가 두 개의 서로 다른 유전적 배경에서 동일한 구조로 순차적으로 생성되었습니다.형질전환체는 PCR에 의해 확인된 후 서던 블롯 분석에 의해 확인되었다. cts3 유전자의 경우, SG200 균주에서 상동 재조합 비율이 70%였으며, 이는 cts3가 비필수 기능을 가지고 있음을 시사합니다. 일부 돌연변이는 명백한 성장 결함으로 이어집니다.예를 들어, cts1/2 이중 돌연변이는 뚜렷한 세포 분리 결함을 가지고 있었습니다. 격막을 염색하면 사이토키네시스(cytokinesis)가 완료되지만 세포는 연결된 상태로 유지되는 것으로 나타났습니다. 키티나제(chitinase)가 독성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 SG200 균주 돌연변이를 사용하여 묘목 감염 분석을 수행했습니다.조절된 유전자 khd4의 돌연변이가 독성을 감소시켰지만, 모든 키티나제의 결실은 옥수수 묘목의 감염에 영향을 미치지 않았다. 이 비디오를 본 후에는 ustilago maydis와 같은 검댕이 곰팡이를 유전적으로 수정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 약 4주 안에 균주가 쉽게 생성될 수 있습니다.이 절차를 사용할 때 향후 클로닝 프로그램을 사용하여 균주 검증 세부 사항을 계획하는 것이 매우 중요합니다. 곰팡이 배양에 대한 작업을 시작하기 전에 이 작업을 수행하십시오. 이 절차를 약간 수정하면 sporsorium reilianum 또는 ustilago esculenta와 같은 다른 검댕이 곰팡이 또는 piriformospora indica와 같은 사상 곰팡이도 유전적으로 변형될 수 있습니다.유전자 변형 생물체를 사용한 작업은 해당 국가의 규정에 따라 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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연구

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유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

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아그로박테리움 매개 피토프토라 팜미보라의 변형을 위한 간소화된 방법

배우세요 Ustilago maydis 유전자 교체 전략을 활용한 곰팡이 유전자 조작 방법입니다. 프로토플래스트 변형과 삭제 돌연변이체 생성을 통해 감염 표현형과 유전자 기능을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

플랜트 병원체의 유전자 조작

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