Name: 복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 생쥐 척수의 사선 절편 준비 방법으로 복부 루트 자극을 통해 운동신경원을 식별하고 축삭 측지가 분포하는 복부 세포를 연구하는 신경생리학 기법을 익히세요.

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저자는 사진을 찍는 그들의 도움 마린 마누엘과 올리비아 골드만-Szwajkajzer 감사합니다. 저자는 또한 원고를 교정하기위한 아르 준 Masukar과 토비아스 복을 주셔서 감사합니다. 금융 지원은 라 공들인 (HYPER-국방부, ANR-2010 BLAN-1429-01)을 부어 직원은 국립 제공 한은 NIH - NINDS (R01NS077863)의 티에리 Latran 재단 (OHEX 프로젝트), 근육 병증에 대한 프랑스 협회 ( 승인 번호 16026) 및 대상 ALS는 기꺼이 인정한다. 펠릭스 리로이는 고등 사범 학교, Cachan의에서 &quot;Contrat 박사&quot;의받는 사람이었다.

실험은 유럽 지침 (609분의 86 / CEE 및 2010-63-UE)과 프랑스 법률에 따라 수행하고, 파리 데카르트 대학 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 척수 조각 준비 <ol><li> 다음 매일 용액 또는 사전에 일일를 준비합니다. 밤새 보관하는 경우, 95 % O 2 5 % CO 2와 거품과는 밀폐 병에 냉장 보관하십시오. <ol><li> 저 나트륨 인공 뇌척수액 (ACSF) + 준비 : 3 밀리미터의 KCl을 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 230 mM의 수크로오스, 26 mM의 NaHCO3을 0.8 mM의 CaCl2를 8mm로의 MgCl 2, 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 아스코르브 산, 1 ㎜ 나 - kynurenate, 2 mM의 나트륨 - 피루브산. 95 % O 2, 5 % CO 2 (PH 7.4)와 거품. 나-kynurenate 자주 용해하기 어려운 때문에, 재료 표에 나열된 하나를 구입해야합니다. </li><li> K-글루코 네이트 SOLU 준비기 : KOH으로 pH 7.4으로 조정 된 130 mM의 K 글루코 네이트, 15 mM의 KCl을 0.05 mM의 EGTA, 20 mM의 HEPES, 25 mM의 글루코스, 1 mM의 나트륨 - kynurenate, 2 mM의 피루브산 나트륨 -. </li><li> ACSF 준비 : 130 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을, 2 mM의 CaCl2를, 1 ㎜의 MgCl 2, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 26 mM의 NaHCO3을 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 아스코르브 산, 2 mM의 나트륨 피루 베이트. 95 % O 2, 5 % CO 2 (PH 7.4)와 거품. </li><li> 절개의 시작에 앞서, K 글루코 네이트 용액 80 ㎖에 2 % 한천을 용해하고, 60 ° C로 보온. </li></ol></li><li> 심장 내 관류 <ol><li> 시대에 P2에서 P11에 이르기까지, 여성과 남성 쥐에이 준비를 수행합니다. </li><li> 25 mM의 나트륨 펜토 바르 비탈 (50 ㎎ / ㎏) 0.1 ㎖를 복강 내 주사하여 마우스를 마취. </li><li> 바늘 또는 테이프를 사용하여, 실리콘 가득 큰 페트리 접시의 뒷면에 마우스를 고정. 해부 현미경을 사용하여해부의 나머지 부분에 대한 전자. </li><li> 흉골의 끝을 잡고 가슴을 들어 올려 미세 가위를 사용하여 조리개를 잘라. 그런 마음을 노출 갈비뼈를 절단하여 양쪽 가슴을 엽니 다. </li><li> 27G 바늘과 좌심실을 천공하기 전에 우심방을 잘라. </li><li> 얼음처럼 차가운 낮은 나 +의 ACSF와 관류. 30 초 후, 낮은 나 + ACSF는 아트리움에서 흐르는 볼 수 있습니다. 나트륨의 낮은 양의 급상승로부터 세포를 방지하고 해부하는 동안 세포 죽음을 줄일 수 있습니다. </li><li> 혈액이 배출 될 때 간은 노란색으로 변할 때까지 해부 현미경으로 심장에 바늘을 들고 보관하십시오. </li></ol></li><li> 척수의 해부 <ol><li> 동물의 목을 벨과 그 뱃속에 넣어. </li><li> 빨리 다시 (그림 1A1)의 피부를 제거합니다. 두 컷 어깨 통해 가슴 케이지 (그림 1A2)을 추락합니다. 그런 리터로 코드를 잘라동물의 아래쪽에서 리브의 시작하여 척추를 분리하기 위해 꼬리 섹션 가능한 흐름. 다시 동물 플립 여전히 갈비뼈에 붙어있는 내장을 제거합니다. </li><li> , 다른 척추 열을 이동시켜 작은 실리콘 가득한 페트리 접시과 지느러미 사이드 (그림 1A)를 누르고 4 곤충 핀을 사용합니다. </li><li> 지느러미 측의 추궁 절제술을 수행하고 주동이의 끝 (그림 1B)에서 척수를 노출하는 동안 지속적으로 (약 4 ° C에서) carbogen - 버블 ACSF와 동물을 관류. 이렇게하려면 뼈와 척수 사이의 미세 가위의 끝을 삽입하고 백질 멀리해야하고, 주동이의 끝에서 조금씩 뼈를 잘라. 각면에 다른 뼈의 대역 이미 절단 (그림 1B1)를 멀리 유지하기 위해 핀셋을 사용하는 동안. </li><li> 가장 작은 가능한 스프링 가위와 핀셋을 사용하여, 경질을 들어 올려 컷가위로 척수 손상을 방지하기 위해 양쪽에 경질의 느슨한 부분을 잡고있다. rostro - 꼬리 축을 따라 잘라. 참고 : 두라는 반 투명 연속 막이다 이 나이에 피아 교인이 너무 허약하고 해부와 슬라이스 (그림 1B2) 동안 떨어져 올 것이다. </li><li> 경질 제거 사용되면 무딘 유리 또는 플라스틱 팁 부드럽게 하프 컷 척주에 의해 형성된 홈의 왼쪽에있는 코드를 밀어 입쪽 측부터 우측 복부와 등쪽 뿌리 잘라 그들은 (적어도 몇 mm, 그림 1B2) 코드를 입력 곳에서 멀리. </li><li> 항상 입쪽에서 꼬리로 이동, 왼쪽의 동작을 반복한다. 왼손잡이 경우, 왼쪽에서 시작하여 오른쪽으로 이동합니다. </li></ol></li><li> 한천에 포함 <ol><li> 척주에서 코드를 슬립. 아래 핀 작은 곤충 핀을 사용하여지느러미와 코드가 최대 표면과 섬세 멤브레인의 조각 여전히 부착 (그림 1C1)을 제거합니다. </li><li> 정리하면, 양쪽 끝 (그림 1C2)을 트림. 코드를 조작하고 방향을주의해야 할 코드의 앞쪽 부분에 굽 곤충 핀을 삽입합니다 (그림 1C2에 화살표). 이어서 빙냉 K 글루코 네이트 용액에 척수 옮긴다. 참고 :이 솔루션은 CSF의 세포 내 성분을 모방와의 motoneurons (26)을 절단됩니다되면 삼투압 충격의 죽어가는 세포를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 척수는 세포 내 솔루션 내에서되면, 건조 화장실에서 한천로 비커를 타고 얼음과 물의 혼합물에 식혀. </li><li> 온도를 측정하는 동안 교반하십시오. 온도가 38 °에 도달하면 곤충 핀을 잡고, 척수 젖어 아래로 주동이의 측면을 배치 C. 척수가 성으로되어 있는지 확인raight 가능한 한 멀리 꼬리 부분, 벽에서 약간 위쪽 (그림 1D1). </li><li> 한천은 가능한 한 빨리 응고 할 수 있도록 얼음과 물의 혼합물에서 비커를 남겨주세요. 확인이 코드가 가능합니다 (그림 1D1)만큼 직선으로되어 장소에 유지하고 확인합니다. </li></ol></li><li> 슬라이스 <ol><li> 응고 후, (도 1D2의 화살표) 블록의베이스 코드의 요부와 35 °의 각도로되는 방식으로 척수를 포함하는 한천 블록을 잘라. 등쪽면은베이스 (그림 1D2)에서 멀리 직면해야한다. 참고 :이에서 나오는 복부 뿌리에 motoneuron 풀의 연속성을 유지하기위한 절차의 중요한 단계이다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 vibratome의 챔버로 블록을 붙인다. K-글루코 네이트 용액에 담가 및 유지 관리 slushed 냉동 K-글루코 네이트 솔루션을 추가목욕 (2 ℃ 이하) 냉장. </li><li> (곡률과 큰 직경에 의해 식별) 요추 영역의 400 μm의 두께 슬라이스 - 350 컷. 적절한 방향 (1.4.1를 참조하십시오.)에서 복부 표면에 지느러미로부터 절단 및 조각 지속적으로 더 주동이를 만들기 위해 블레이드를 사용합니다. 일반적으로 2 mm 이상 연장 복부 뿌리를 가진 4-5 적합한 조각이있다. 10 ° 각도, 70 Hz의 진동 주파수와 슬라이스의 10mm / 분 속도 : 다음 매개 변수를 사용합니다. </li></ol></li><li> 잠복 <ol><li> 34 ° C에서 ACSF에 조각을 전송합니다. 약 30 분 후, RT까지 냉각 슬라이스와 기록 세션을 시작한다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> 그림 1. 해부 A1 :. 지느러미 열을 노출 뒤의 피부를 제거 A2 :. 어깨와 갈비뼈 절단는 등의 열 B1을 확보하기 : 실리콘 채워진 페트리 접시에 고정 된 척추 열 (최대 지느러미 쪽, 왼쪽 꼬리 쪽) B2 :. 노출 해부 척수와 같은 C1을 :. 척수 고립 . (주동이의 측면 왼쪽) C2 : 삽입 할 준비가 척수 (최대 복부 측면, 왼쪽 주동이의 측면). 주동이의 측면에 작은 곤충 핀을 참고 D1 :.. 한천 비커에서 척수 (주동이의 측면 다우, 바닥을 향하도록 복부 측면) D2 : 내장 척수와 컷 한천 블록. 35 ° 각도를 블록의베이스와 요추 확대 (화살표)와 척수 양식을합니다. 스케일 바 1cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 상공 회의소에 슬라이스를 배치 참고 : 쉬게ntral 뿌리는 가변 크기입니다. <ol><li> (40)에서 사전에 170 μm의에 이르기까지 다양한 팁 직경 다양한 피펫의 상자를 준비합니다. 흡입 피펫을 준비 긴 테이퍼 많은 피펫을 준비합니다. 다이아몬드 나이프를 사용하여, 서로 다른 위치에 상처를 만든다. 그 다음 해부 현미경, 핀셋 팁을 타격하여 휴식. </li><li> 기록 현미경에서 실을 제거하고 해부 현미경으로 배치합니다. </li><li> 흡입 자극 전극에 장착 될 수있는 충분한 길이 (2 mm 이상)의 복부 루트를 포함하는 슬라이스를 선택한다. 복부 뿌리 슬라이스 상향 (그림 2A)의 올바른 방향을 선택하고 조각 (그림 2B) 주변의 한천의 나머지 부분을 남기면서 섬세 복부 뿌리 주변의 한천을 잘라. 참고 : 한천이 조각보다 더 확고하기 때문에,이 조각의 앵커의 스레드가 한천보다는 이렇게 슬라이스하고 A에 휴식을 할 수 있습니다nchor는 조직을 손상하지 않습니다. 슬라이스의 앵커의 스레드 (그림 2c에 빨간색으로 표시) motoneuron 풀 위에 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경에 백 챔버를 탑재하고 연속적 일의 속도로 ACSF 기록 챔버를 관류 - RT에서 2 ㎖ / 분. 유리 피펫 ACSF 채우고 주사기에 연결을 사용하여, 복부 루트 (도 2c에서 화살표) 중 하나를 흡인. 복부 루트 좋은 자극을 달성하기 위해, 피펫 팁을 복부 주위 루트 빡빡 할 필요가있다. 하나의 기둥은 자극 전극 (패치 클램핑 전극에 연결된 레퍼런스 또는) 욕 중에서 다른 하나이어야한다. </li><li> 목적하는 세포 유형의 패치 클램프 기록을 달성하고 10 previsouly 바와 같이 복부 루트 자극의 효과를 기록한다. <ol><li> 여기서, 데이터 수집을위한 증폭기를 사용한다. 3 kHz에서 전체 셀 녹음을 필터링합니다. 10 kHz에서 디지털화. curre 다리 저항을 보정NT-클램프 모드. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> 그림 2. 복부 루트 준비 A : 복부 루트가 위를 향 한천에 포함 된 요추 척수 조각 B :.. 한천 C에서 해방 복부 뿌리와 요추 척수 조각 : 단단히 (화살표) 복부 뿌리 주위에 배치 자극 전극과 요추 척수 조각 . 마우스 기자 R26 톰 (17). 스케일 바 1mm로 교차 chrna2-Cre 호텔 마우스 (28)의 적색 형광을 발현하는 렌쇼 세포의 위치를 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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그것은, 신뢰할 수있는 포괄적이고 구체적인 방법으로 하나의 척추 세그먼트에서 motoneuron 풀과 렌쇼 세포의 일방적 인 자극을 허용하기 때문에 척수의 경사 슬라이스가 중요합니다. 또한, 기록의 motoneurons의 빠른 우아하고 비 모호한 식별 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 다른 슬라이스 준비 방법에 비해이 기술의 장점을 강조하며, 우리는이 절차를 수행하는 동안 피할 수있는 가장 일반적인 함정을 강조합니다. 가로 슬라이스를 사용하여 대부분의 연구는 고유의 전기적 특성 3,14,15,29에 자신의 ID를 기반으로. 그러나 이러한 주어진 풀 (알파, 베타 및 감마의 motoneurons 30) 내에서 motoneuron 풀 사이뿐만 아니라 motoneuron 서브 타입 사이에 크게 다릅니다. 따라서, 사이즈의 파라미터를 이용하여 연구가 작은 감마 운동 신경원을 배제 할 가능성이있다. 한편, 쿠퍼 셰링 D축색 돌기 (31...

역사적으로, 날카로운 전극을 사용 motoneuron 녹음은 고양이 나 쥐 1이나 마우스 2에서 격리 된 전체 척수에 큰 동물 생체 내에서 실시 하였다. somas 필요한 밀봉과 motoneuron에 직접 액세스를 요구 1980 년대 패치 클램프 녹음 기술의 출현은, 시각적 인지도하에 달성 될 수있다. 따라서, 척수 슬라이스 제조 용이 1990 세 이후 달성되었다. 그러나, 초기 슬라이스 준비는 종종 복부 뿌리의 자극을 허용하지 않았다. 우리가 아는 한, 두 연구는 가로 조각의 복부 뿌리를 성공적으로 자극을보고, 아무도는 마우스 4,5에서 얻은되지 않았다. motoneuron 풀은 복부 루트를 벗어나지 축삭을 유지하는 - (P11 P2)이 문서에서 우리는 신생아 쥐의 생존 척수 조각을 달성하기 위해 기술을 제시한다. 벤트RAL 루트 자극은 같은 복부 루트에서 배출되는 motoneuron 풀의 somas에 다시 antidromic 활동 전위를 트리거합니다. 또한 motoneuron 담보 타겟 다른 운동 신경원 6-10 및 11-13 렌쇼 세포를 여기. 단지의 motoneurons은 복부 뿌리를 자신의 축삭을 보낼 수 있기 때문에, 우리의 motoneurons (10)를 식별 physiologicaly하는 간단하고 확실한 방법으로 antidromic 활동 전위의 기록을 사용합니다. motoneuron 신원을 확인하기 위해 잠재적으로 비 포함되거나 잘못된 전기 생리 학적 및 criterions에를 사용하는 것 외에도, 척수 운동 신경원에 대한 최근의 연구는 또한 사후 지루하고 시간 소모적 16 염색에 의존. 이러한 식별은 보통 기록 세포 샘플에 대해 수행된다. 다른 식별 전략은 내인성 운동 신경원 형광을 발현하는 마우스 선에 의존 <sup&gt; 17 ~ 19. 이 연구는 이미 유전자 변형 마우스 줄을 사용하여 필요한 경우 마커의 발현은 여전히 ​​변수 또는 그러나 유전자 인코딩 된 마커를 사용하여 젊은 나이에 어려울 수 있습니다. 대안 적으로, antidromic 활동 전위 기록은 셀 기록의 시작에서 모든 마우스에서 일상적으로 수행 될 수있다. 고양이, 쥐와 마우스에서 손상 척수 준비 작업 실험자은 확실하게 1950 년대 1,2,20,21 이후 같은 식별 기술을 사용했다. 최적의 조건에서 우리는 기록의 motoneurons의 거의 모든에서 antidromic 활동 전위를 유도 할 수 있었다. 또한, 복부 루트 자극을 확실하게 다른 운동 신경원 22, 23 또는 이들의 타겟을 자극하기 위해 사용될 수있다. 렌쇼 세포 10,24,25. 우리는 여기에 motoneuron somas antidromic에서 활동 전위 기록 형태 복부 루트 자극의 응용뿐만 아니라 렌쇼 세포의 자극을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td>은 <td>다른 브랜드보다 더 잘 용해됩니다</td></tr>. <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>수크로스&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>품질 생물학</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>포도당&nbsp;</td><td>시그마</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-피루브산&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-글루코네이트&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>시그마</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>알로몬</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>시그마</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>시그마</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>시그마</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>글루콘산</td><td>시그마</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>세슘 수산화물 솔루션</td><td>시그마</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위 - 2.5mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td>은 <td>경막을 절단하는 데만 사용되며 뼈를 절단하면 손상될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>자극기</td><td>A-M 시스템</td><td>절연 펄스 자극기 모델 2100</td><td></td></tr><tr><td>진동</td>기 <td>Campden</td><td>진동 마이크로톰 7000 - 모델 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

척수 조각에서 전기 생리 녹음은 네트워크 속성에 휴대 질문의 넓은 범위를 조사 할 가치있는 기술을 입증했다. 우리는 젊은 쥐 (- P11 P2)의 척수의 가능한 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비에서의 motoneurons은 축삭은 척수의 복부 뿌리에서 나오는 유지한다. 이 축색 돌기의 자극은 척수 내에서 motoneuron의 somas과 흥미로운 motoneuron의 담보 침입 다시 전파 활동 전위를 이끌어. antidromic 활동 전위의 기록은 다른 식별 방법을 능가 motoneuron 정체성을 특성화하기 위해, 즉시 확정하고 우아한 방법입니다. 또한, motoneuron의 담보를 자극하는 기타 운동 신경원 또는 R와 척수 내에서 운동 신경원의 담보 타겟을 자극하는 간단하고 신뢰성있는 방법은세포를 enshaw. 이 프로토콜에서는, 우리는 복부 루트 자극의 결과는 motoneuron somas뿐만 아니라 렌쇼 세포 여기에서 antidromic 녹음을 제시한다.

Antidromic 활동 전위를 사용하여 Motoneuron 정체성의 확인 셀 타겟팅 의 motoneurons은 복부 혼 (그림 2C에 빨간색으로 표시)에서 발견된다. 복부 루트를 형성하는 축삭의 번들에서 시작하고 번들이 완전히 분산과 하나가 (20 μm의 위, 긴 소마 축) 큰 세포를보고 시작 때까지 이동합니다. 4 MΩ로 (3)의 초기 저항의 전극을 사용하여 라운드 건강보고 셀의 전 세포 기록을 달성한다. 사용되는 내부 용액은 140 mM의 K-글루코 6 mM의 KCl을 10 mM의 HEPES, 1 mM의 EGTA, 0.1 mM의 CaCl2를...

우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

이 절차의 전반적인 목표는 복측 신경근(ventral roots)의 자극이 가능한 척수의 사선 절편(oblique slices)을 제작하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 복측 신경근 자극을 통해 운동 신경을 식별하고, 운동 신경 축삭 측지(motoneural axon collaterals)에 의해 지배되는 복측 세포들을 연구할 수 있다는 점입니다. 저희는 복측 세포를 자극할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법이 필요했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.이 방법이 처음인 사람은 해부의 각 단계를 적절히 수행하는 데 어려움이 있어 고전할 수 있습니다. 우선 P2에서 P11 단계의 마우스를 저나트륨 ACSF로 관류하십시오. 마우스의 머리를 제거하고 등의 피부를 벗겨낸 후, 양쪽 어깨를 지나 갈비뼈 방향으로 두 군데를 절개하십시오.그런 다음, 척추와 갈비뼈를 동물의 하단부로부터 분리하기 위해 꼬리 쪽 구역에서 척수를 가능한 한 낮게 절단합니다. 척추를 뒤집고 갈비뼈에 여전히 붙어 있는 내장 기관을 제거합니다. 척추를 실리콘이 채워진 다른 작은 페트리 접시로 옮깁니다.차가운 ACSF를 추가하고 carbogen으로 버블링한 후, 곤충 핀 4개를 사용하여 조직의 배측(dorsal-side)이 위로 오도록 고정합니다. 그런 다음, 먼저 미세 가위의 팁을 뼈와 척수 사이에 삽입하고 백질(white matter)에 닿지 않도록 주의하며 주둥이 쪽(rostral end)부터 뼈를 절단하여 배측의 척추궁 절제술(laminectomy)을 수행합니다. 핀셋으로 이미 절단된 뼈 띠를 잡으면서 양측을 번갈아 가며 절단합니다.다음으로, 작은 핀셋을 사용하여 경막을 들어 올리고 작은 가위로 양측의 전후방 접근 경로를 따라 절개합니다. 경막 제거는 매우 중요한 단계입니다. 이를 철저하게 수행하기 위해 몇 분의 시간을 더 투자할 가치가 충분합니다.경막을 제거한 후, 뭉툭한 유리 팁을 사용하여 척주 절반 절단 부위에 형성된 홈의 왼쪽으로 척수를 부드럽게 밉니다. 그런 다음 밝은 쪽의 복측 및 배측 신경근을 척수 진입 지점에서 최대한 멀리 떨어진 곳에서 절단합니다. 항상 머리 쪽에서 꼬리 쪽 방향으로 진행하며 왼쪽에서도 동일한 작업을 반복합니다.해부 후, 척수를 척추관에서 조심스럽게 밀어내어 분리합니다. 그런 다음 작은 곤충 핀을 사용하여 척수의 등쪽 표면이 위로 오도록 고정합니다. 부착된 막 조각들을 세심하게 제거합니다.세척이 완료되면 척수 양 끝을 다듬고, 척수의 전방 부위에 굽은 곤충 핀을 삽입하여 방향을 표시합니다. 그런 다음 척수를 얼음처럼 차가운 세포 내 용액으로 옮깁니다. 이어서, 이전에 준비한 용융 한천을 얼음과 물의 혼합물 위에서 냉각시킵니다.온도를 측정하면서 한천(agar)을 저어줍니다. 한천의 온도가 38 °C에 도달하면, 곤충 핀으로 척수를 잡고 로스트럴(rostral) 쪽이 아래로 향하게 하여 한천에 담급니다. 이때 척수가 벽면에서 떨어져 최대한 곧게 펴져 있어야 하며, 카우달(caudal) 부분이 약간 위쪽을 향하도록 합니다.비커를 얼음과 물의 혼합물에 두어 한천(agar)이 척수 주변에서 가능한 한 빨리 응고되도록 합니다. 응고 후, 한천 블록의 바닥면이 척수의 요수(lumbar part)와 35도 각도를 이루도록 척수가 포함된 한천 블록을 절단합니다. 이때 배측 표면(dorsal surface)이 바닥면의 반대 방향을 향해야 합니다.시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 블록을 바이브라톰(vibratome) 챔버에 접착합니다. 운동 신경핵(motor pools)과 그곳에서 나오는 복측 뿌리(ventral roots) 사이의 연속성을 유지하기 위해 블록을 정확하게 장착하는 것이 매우 중요합니다. 블록을 글루콘산 칼륨(potassium gluconate) 용액에 담급니다.바이브라톰(vibratome) 매개변수를 설정합니다. 다음으로, 곡률과 더 큰 직경으로 식별 가능한 요추 부위를 350 400 micron 두께의 절편으로 자릅니다. 적절한 절편들을 34 °C의 ACSF로 옮깁니다.일반적으로 복측 뿌리가 2 mm 이상 뻗어 있는 적절한 슬라이스는 4~5개 정도입니다. 34 °C에서 약 30분간 유지한 후, 슬라이스를 실온으로 식히고 기록 세션을 시작하십시오. 팁 직경이 40~170 µm인 다양한 피펫들을 상자에 미리 준비해 두십시오.섹션 피펫을 준비하려면 테이퍼(tapure)가 긴 피펫을 선택하십시오. 그 다음, 다이아몬드 나이프를 사용하여 서로 다른 위치에 흠집을 낸 후, 해부 현미경 하에서 핀셋으로 팁 부분을 쳐서 각 피펫을 절단합니다. 이어서, 기록용 현미경에서 챔버를 분리하여 해부 현미경 아래에 배치하십시오.흡입 자극 전극에 장착할 수 있을 만큼 충분한 길이의 복측 뿌리를 포함하는 절편을 선택하십시오. 복측 뿌리가 위를 향하도록 절편을 배치하여 고정한 다음, 절편 주변의 나머지 한천은 그대로 둔 채 복측 뿌리 주변의 한천만 조심스럽게 잘라내고, 시료를 고정하기 위해 그리드를 배치하십시오. 챔버를 현미경에 다시 장착하고, 실온에서 분당 1~2 mL의 속도로 ACSF를 기록 챔버에 지속적으로 관류하십시오.ACSF가 채워진 주사기에 연결된 유리 피펫을 사용하여 복측 신경근(ventral root) 중 하나를 흡입합니다. 복측 신경근에 효율적인 자극을 주기 위해서는 피펫 팁이 복측 신경근을 단단히 감싸야 합니다. 원하는 세포 유형의 패치 클램프 기록(patch-clamp recording)을 수행하고, 앞서 설명한 대로 복측 신경근 자극의 효과를 기록합니다.이 이미지는 전압 고정 기록(voltage-clamp recording) 결과를 보여줍니다. 상단 패널의 기록은 하단 패널의 기록과는 다른 운동 신경세포에서 측정된 것입니다. 상단 패널은 1V 자극에 대한 운동 신경세포의 역행성 반응을 빨간색으로, 5V 자극에 대한 반응을 검은색으로 나타냅니다.아래쪽 트레이스는 빨간색으로 표시된 20-volt 자극에 대한 정방향 활동 전위 반응과 검은색으로 표시된 30-volt 자극에 대한 반응을 보여줍니다. 검은색 점은 자극 시점을 나타냅니다. 이중 화살표 머리는 정방향 및 역방향 스파이크 간의 잠복기 차이를 강조합니다.여기 전류 클램프 기록이 제시되어 있습니다. 상단 패널은 각각 빨간색과 검은색으로 표시된 10-volt 및 15-volt 자극에 대한 역행성 반응을 보여줍니다. 하단 패널은 각각 빨간색과 검은색으로 표시된 25-volt 및 40-volt 자극에 대한 순행성 반응을 보여줍니다.다시 한번, 자극 타이밍과 잠복기의 차이가 표시되어 있습니다. 이 Renshaw 세포 풀 이미지는 사선 콘덴서와 20x 대물렌즈를 사용하여 획득되었습니다. 화살표로 표시된 것처럼 운동뉴런 축삭이 복측 신경근으로 합쳐지는 것에 유의하십시오.동일 영역의 이 이미지는 40x 대물렌즈를 사용하여 촬영되었습니다. 추정되는 Renshaw 세포는 화살표 머리로 표시되어 있습니다. 여기에는 검은 점으로 표시된 복측 신경근 자극 후 Renshaw 세포의 전압 고정 기록이 나와 있습니다.세포 내 용액에 포함된 QX-314는 세포의 발화를 방지하였으며, glycine 및 gaba 반응은 각각 3 µM gabazine과 1 µM strychnine에 의해 차단되었습니다. 빨간색 트레이스는 회색 트레이스들의 평균값입니다. 이 기술을 숙달하면 20분에서 30분 내에 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, 시료를 항상 차가운 배지 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 복측 뿌리(ventral-root) 자극에 적합한 척수 사선 절편을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 복측 뿌리 자극은 운동신경의 정체성을 쉽게 확인하고, 무엇보다 복측 세포를 안정적으로 자극하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 중간 entorhinal 피질 (멕)의 지느러미-복부 축을 유지 뇌 조각의 준비와 electrophysiological 레코딩을위한 절차를 설명합니다. 위치의 신경 인코딩 멕 내에서 지느러미-복부 조직을 따르기 때문에,이 절차는 탐색 및 메모리에 중요한 세포 메커니즘 조사를 용이하게합니다.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

이 비디오는 트랜스 척추 직류 자극 하에서 쥐의 운동 뉴런의 생체 내 녹음을 설명합니다. 이 프로토콜은 막 특성을 측정하고 척수의 항문 또는 음극 분극 전, 도중 및 후에 운동 뉴런의 리드미컬한 발화를 기록하는 방법을 설명합니다.

쥐의 척추 운동 뉴런의 경척추 직류 자극

이 비디오는 쥐의 척수 절편에서 신경 네트워크 활동을 연구하기 위한 미세 전극 어레이 기반 분석을 보여줍니다. 먼저, 슬라이스의 표재성 등쪽 뿔(SDH)의 전기생리학적 활성을 기록합니다. 그런 다음, 탈분극을 연장하기 위해 칼륨 채널 억제제가 도입되어 뉴런 네트워크 전반에 걸쳐 동기 리듬 활성을 일으킵니다.

microelectrode array-based assessment of neuronal networks in mouse spinal cord slices(쥐 척수 절편에서 신경 네트워크에 대한 Microelectrode Array-based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices)

시냅스 전 방출 안면막에서 Ca2+ 전류를 기록하는 것은 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 정확하게 이해하는 데 중요합니다. 우리는 기능적으로 고립된 망상척수 축삭돌기를 생성하는 lamprey 척수의 급성 해리를 제시하여 개별 시냅스전 말단의 방출면 막에서 직접 기록할 수 있습니다.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

근육 내 흡수 및 해당 운동 뉴런으로의 분자 역행 수송의 효능은 모터 엔드 플레이트(MEP)에 대한 주입 부위의 위치에 따라 달라집니다. 여기에서는 운동 뉴런으로의 추적자의 역행 수송을 최적화하기 위해 골격근에서 MEP를 찾는 방법을 설명합니다.

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

이 프로토콜 모두 시각적으로 통신 brainstem 척수 준비 하 고 포괄적인 단계별 방식 brainstem 가로 조각의 준비를 명확히. 그것은 재현성을 증가 하 고 brainstem의 호흡 영역에서 신경 출력 기록 가능한, 오래 지속, 컬 활성 분할 영역 취득의 가능성을 강화 하도록 설계 되었습니다.

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

이 프로토콜은 동시 트랜스 척추 직접 전류 자극을 가진 쥐 요추 모토뉴런의 생체 내 세포 내 기록을 설명합니다. 이 방법을 통해 멤브레인 특성을 측정하고 척수의 무음 또는 음극 편광 전, 도중 및 후에 모토뉴런의 리듬 발사를 기록할 수 있습니다.

트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록

뉴런에 다양한 시냅스 입력의 통합은 자연 타이밍과 회로 가소성을 위해 모든 사전 시냅스 핵을 보존하는 준비에서 가장 잘 측정되지만, 뇌 슬라이스는 일반적으로 많은 연결을 끊습니다. 우리는 생체 외 실험 능력을 유지하면서 생체 내 회로 활동을 모방하는 수정 된 뇌 조각을 개발했습니다.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

척수 등쪽 경적에서 네트워크 수준의 nociceptive 활성을 조사하기 위한 마이크로전극 어레이 기술과 4-아미노피리딘-유도된 화학적 자극의 조합된 사용이 개략적으로 설명된다.

마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록

이 프로토콜은 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 분해능으로 척수 자극(SCS)에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 방법을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 척수를 분리하고 세포 생존력을 동시에 유지하는 기술을 향상시킬 수 있습니다.

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

배우세요 생쥐 척수의 사선 절편 준비 방법으로 복부 루트 자극을 통해 운동신경원을 식별하고 축삭 측지가 분포하는 복부 세포를 연구하는 신경생리학 기법을 익히세요.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

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