Name: 세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달, Ceratitis의 capitata (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 Ceratitis capitata 배아 미세주입을 통한 핵산 전달 기법으로, 저농도 핵산 주입으로 유전자 기능 연구 및 형질전환 계통 생성이 가능합니다. 이 방법은 농업 해충 관리를 위한 새로운 유전적 도구를 확장합니다.

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저자는 "곤충 유전학 및 유전체학" 연구소의 모든 구성원, 특히 지난 30년 동안 메드플라이의 사육을 개발, 적응 및 유지하기 위해 노력한 Lorenzo Ghiringhelli에게 감사를 표하고 싶습니다. 본 논문의 대표적인 결과 중 일부는 N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, 엘스비어(라이선스 번호 3796240759880)의 허가를 받았습니다. 이 작업은 Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE"(FS)의 지원을 받았습니다.

1. 실험 셋업 <ol><li> Insectary 요구 사항 <ol><li> 모든 C. 유지 capitata 수명은 25 ° C, 65 % 습도와 12/12 시간 빛 / 어둠 광주에서 스테이지. </li><li> 6 L 케이지 약 1,500-2,000 medfly 번데기를 놓습니다. 산란 (42)을 자극하기에 충분 작은 구멍 한쪽에 메쉬 황동 케이지를 사용합니다. 모세관 작용에 의해 물과 파리를 제공하기 위해 케이지의 기본에 작은 구멍을 통해 스폰지 스트립을 삽입합니다. 성인 (그림 1A)를위한 음식 소스로 효모와 설탕 (1시 10분)의 혼합물을 사용합니다. 효모의 양을 증가 (최대 1 : 설탕 : 3, 효모) 암컷이 알을 낳기에 실패합니다. </li><li> 메시을 통해 퇴적 된 계란을 수집 케이지 아래에 물이 가득 접시를 놓습니다. 처녀 암컷이 알을 낳다 수 있듯이 파리는 미세 주입 실험에 계란을 수집하기 전에 적어도 6~7일 나이가 될 때까지 기다립니다. 이 여성이 성관계를 한 것을 보장합니다그리고 계란은 수정 된 된 것입니다. </li><li> 미세 그물 여과기로 물을 필터링하여 계란을 수집합니다. 표준 애벌레 식품 (1.5 LH 2 O, 100 ml의 염산 1 %를 포함하는 플라스틱 상자에 스트레이너에서 계란을 이동 광범위 항균제가 50 ml의 에탄올 5g, 400g 설탕 175g 순수 맥주의 효모, 1 파스퇴르 피펫을 사용하여) 소프트 밀기울을 kg이다. </li><li> 공기 순환을 허용 순 뚜껑 폐쇄 투명 용기에 각 창을 배치하고 밀기 층을 함유 번데기 (도 1b)을 선호. </li><li> 약 10 일 후, 애벌레 음식에서 등장과 번데기의 쌀겨 층 아래로 뛰어 3 차 령 유충을 확인합니다. </li><li> 24 시간 후, 부드러운 브러시를 사용하여 작은 컵에서 번데기를 수집하고 새로운 성인 케이지로 전송. 성인은 일반적으로 십일 번데기 후 등장. 신흥 비행은 ptilinum, 일 위의 머리에있는 팽창 주머니를 사용안테나의 전자베이스는 puparium의 끝을 강제로. 출현 후, ptilinum 영구적으로 다시 내 머리 축소합니다. </li></ol></li><li> 마이크로 인젝션 유충 1 L 식품의 제조 <ol><li> 300 ML의 H 2 O 2.5 g 한천을 녹이고 </li><li> 따뜻한 500㎖의 H 2 핫 교반 접시에 O 및 4g 나트륨 안식향산 염을 용해, 4.5 ml의 37 % 염산, 42g 효모 추출물과 115g 탈수 당근 분말. </li><li> 상기 혼합물에 10 mL의 무수 에탄올에 용해 된 2.86 g 광범위 항균제의 용액을 추가한다. </li><li> 배양 접시 라운드 15cm의 매체를 배포하고 냉각 할 수 있습니다. 필요한 경우, 4 ℃에서 저장. </li></ol></li><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 현미경 슬라이드 (75 X 26mm 2)에 양면 테이프의 2cm 스트립을 놓고 중국 마커 가장자리를 표시, 기름 확산과 주입 된 배아의 필연적 인 탈수를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li><st룽&gt; 핵산 준비 <ol><li> 시판 키트 (34)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 에탄올을 사용하여 플라스미드를 석출 원하는 농도로 주입 버퍼 (0.1 mM의 포스페이트 버퍼 pH 7.4, 5 mM의 KCl을)에 재현 탁. </li><li> 페놀 - 클로로포름을 사용하여 긴 dsRNA를 synthetized 체외에서 정화, 이소프로판올을 사용하여 침전 및 사출 버퍼 (43)에 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 배아 준비 <ol><li> 6-7일 옛 성인을 포함하는 케이지 아래에 물이 가득 트레이를 배치합니다. </li><li> 암컷은 30 분 동안 알을 낳다하고 정밀한 스트레이너를 사용하여 물을 필터링하여 배아를 수집 할 수 있습니다. 항상 배아 탈수를 방지하기 위해 물에 스트레이너를 유지합니다. </li><li> 상업 50 % 표백제 용액에 5 초 동안 여과기를 immerging하여 배아를 Dechorionate. </li><li> 반복 적어도 (깨끗한 초순수에 스트레이너를 immerging 조심스럽게 배아를 씻으4-5 회). 마지막으로, 깨끗한 초순수에 여과기를 배치합니다. 최대 2 시간 이내에 배아를 사용합니다. 주 : 마이크로 인젝션의 타이밍이 종래 cellularization 핵 분열의 단계에서, 사전 배반 배아 내로 주입의 필요성에 관한 것이다. 이렇게 주입 된 DNA가 권취되는 핵 내로, 특히 생식을 발신한다 원시 생식 세포 핵에 있습니다. medfly cellularization 9 및 12 시간 45, 46 사이에 일어난 반면, 초파리에서 극 세포에서 cellularization는 배반 엽의 형성은 약 30 분 후에 44 발생으로 수정 후 약 90 분에 (25 ° C에서)를 시작합니다. </li><li> 행 배아 방향 <ol><li> 좋은 붓을 사용하여, 약 50 배아를 수집하고 물에 담가 검은 필터 종이의 디스크에 배치합니다. </li><li> 해부 실체 현미경, 양면 테이프의 상면에 행 배아를 마련미세 브러시 (000)를 사용하여 현미경 슬라이드 (도 1C). 참고 : 분사가 세균 줄 발생한 것 극부에서 수행 될 때, 모두 같은 방향으로 배아를 맞 춥니 다; 후방 극은 micropyle 영역에 반대입니다. </li><li> 클로로 기름의 층이 석유는 중국 마커 테두리 (1.3 참조)를 통해 유출되지 않도록하기와 배아를 커버. 참고 : 오일 배아를 피복하기 전에, 추가의 단계가 수행 될 수있다 : 배아는 액체 함량을 감소시키고 이에 따라 주입 DNA 용액의 진입을 용이하게하기 위해 몇 분 동안 건조 된 수있다. 이것은 높은 액체 압력의 결과로서, 주사 또는 주입 용액의 과다 유출시 배아 붕괴를 방지 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 배아 미세 주입 <ol><li> 플라스미드 DNA 또는 마이크로 피펫을 사용하여 dsRNA를 용액 (1-2 μg의 / μL)와 바늘 (1-2 μL)를 입력합니다. </li><l난&gt; 주입 시간 (0.5 초)를 제어하는 ​​마이크로 인젝션 장치에 바늘을 연결, 압력 (800 고전력 증폭기)와 배압 (150 고전력 증폭기). </li><li> 바늘 (도 1D)의 움직임을 제어하는 미세 조작기를 사용하여 실체 현미경 하에서 미세 주입을 수행한다. 슬라이드를 이동하려면 현미경 스테이지를 사용합니다. <ol><li> 범위의 무대에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 배아 (그림 1E)의 후방 극에 바늘의 끝을 삽입합니다. </li><li> 페달로 마이크로 인젝션 장치를 활성화하여 용액을 주입한다. 주입 액은 태아의 약간의 이동의 결과로, 내부 압력의 증가를 유도한다. </li><li> 즉시 페달을 릴리스 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 주사 부위에 약간의 세포질 누설을 준수하십시오. 참고 : 인해 미세 주입 프로에 DNA / dsRNA를이 /의 siRNA와 사망의 잠재적 인 치명적 영향을 구별하는 방법자체 시저, ​​제어 실험을 수행해야합니다. 이러한 역 유전학 실험의 경우, 전용 버퍼의 주입을 포함하거나, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 이중 가닥 RNA (dsRNA를-GFP) 또는 siRNA를를 - 유래. </li></ol></li><li> 주사는 25 ° C에서 배아를 품어 다음과 같습니다. </li></ol> 4. 후 주입 절차 <ol><li> 이틀 주입 한 후, 실체 현미경 아래에서 부화 유충 (그림 1 층)에 대한 슬라이드를 확인합니다. 유충 오일 이동하지만 빨리 유생 식품에 전사 할 필요가있다. 이 때문에, 일 슬라이드를 여러 번 확인한다. </li><li> 미세 페인트 브러시 (000)를 사용하여 부드럽게 당근 기반 애벌레 음식에 부화 유충을 전송합니다. 각 페트리 접시 당 200 애벌레의 최대까지 전송합니다. </li><li> 65 %의 습도 (25 ° C)에서 애벌레를 품어. 뚜껑은 공기 교환을 손상, 접시에 충실하지 않음을 확인합니다. </li><li> 뚜껑을 페트리 접시를 유지유충에 공기 흐름이 여전히 존재하도록 주로 마감했다. 과도한 건조를 방지 매일 요리를 확인하고, 필요한 경우, 증발을 보상 물을 추가합니다. </li><li> 그물 뚜껑에 의해 폐쇄 투명한 용기에 배양 접시를 놓고 밀기울 층을 포함하는 번데기를 선호 할 수 있습니다. 일상 insectary 양육에 관해서는, 3 차 령 애벌레 애벌레 음식 중 점프는 밀기울에 번데기가되다. </li><li> (이 세대 0, G0 임) 번데기를 수집하고 성인 양육 및 선별을위한 작은 케이지에 배치합니다. 후면 표준 애벌레 음식의 자손. </li><li> 주입 개인 키메라 일반적으로 세균이 라인 전환 실험의 경우, 차세대 변형 가능한 개인 (G1)에 대해 확인한다. 전위 이벤트는, 참으로, 세균 온라인 또는 소마를 형성 할 것이다 배아 syncytium의 핵 중 어느 발생했을 수 있습니다. <ol><li> 곧 출현 후, CO 2를 사용 G1 개인 마취 및 TRANSF 확인표면 형광 실체 현미경 아래 ormation 이벤트. 잠시 녹색 형광을위한 화면으로 EYFP 필터를 사용 (..; EMM 30분의 535 내선 20분의 500), (EMM 75분의 605.. 내선 12분의 546) 적색 형광의 유무를 선별하기 위해, DsRedwide 필터를 사용 . </li><li> 이성의 야생형 성인과 함께 작은 새장에 변형 개인을 배치하고, 초기 이형, 긴장을 기원. </li></ol></li></ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

곤충 배아 핵산 마이크로 인젝션은 유전자 기능 및 생물 공학적 응용 분석 모두를 용이하게하는 범용 기술이다. 곤충 종의 증가로부터 게놈 시퀀스의 최근 간행물은 아직 미지의 기능 유전자의 기능적 특성화 도구 시급 리드. RNA 간섭 분자 기능 (49)을 추론하기위한 가장 중요한 방법 중 하나 입증 배아 미세 주입이 연구를 용이하게하고있다. 플라스미드 DNA의 주입 트랜스 - 매개 유전자 도입을 이용하여 곤충 게놈을 수정하는데 사용될 수 있으며, 최근에는 게놈 편집 툴 (예 TALEN, CRISPR / Cas9, HEGs). 이러한 기술은 이미 박멸 또는 야생 모집단의 여분 w 양쪽 목표 해충 제어 프로그램에 사용될 수있는 다수의 곤충 종의 균주의 개발을 허용 할i 번째 수정 생물학적 기능과 곤충. 이 프로토콜에서 우리는 플라스미드 DNA 또는 dsRNA를 하나와 medfly 배아 미세 주입에...

지중해 과실 파리는 (medfly) Ceratitis capitata는 국제적인 종 광범위하게 손상 과일과 재배 작물이다. 이 같은 장군 Bactrocera 및 Anastrepha에 속하는 것과 같은 여러 가지 해충 종을 포함 Tephritidae 가족에 속한다. medfly 패밀리의 대부분의 연구 종이며, 곤충 침입 (1)의 연구뿐만 아니라 해충 관리 전략을 최적화이 단지 모델이되었다. medfly 300 개 이상의 야생의 종과 재배 식물 3,4를 공격 할 수있는 multivoltine 종입니다. 손상은 성인과 애벌레 단계 모두에 의해 발생 : 성관계 여성은 미생물이 상업적 품질에 영향을 미칠 수 있도록, 산란을 위해 과일의 표면을 관통, 과일 펄프의 애벌레 피드 반면. 세 애벌레 단계 후, 애벌레는 호스트에서 등장하고 토양에 번데기가되다. Ceratitis을capitata 아프리카, 중동, 웨스턴 오스트레일리아, 중남미, 유럽, 미국 (5)의 지역을 포함하여 거의 전 세계적으로 분포를 표시합니다. 가장 일반적인 전략 medfly 침략는 살충제의 사용을 포함하는 제한 (예를 들어, 말라 티온, 스피노 사드) 및 환경 친화적 해충 멸균 기법 (SIT) 6. 후자의 접근 방식은 조사를 이온화에 노출 멸균 렌더링 남성의 수천 수백의 야생으로 방출을 포함한다. 야생 암컷 같은 멸균 남성 정합 결국 박멸 선도 모집단 크기의 감소를 초래없이 자손을 초래한다. SIT는 전 세계 여러 캠페인에서 효과가 입증되었지만, 주요 단점은 양육 및 출시 될 곤충의 수백만 살균의 높은 비용을 포함한다. 출시 개인으로 표시하면 중에 분야에서 캡처 야생 곤충에서 멸균 구별 할 필요가있다활동을 모니터링하며, 현재 형광 분말을 사용하여 달성된다. 이러한 절차는 비용이 많이 드는 바람직하지 않은 부작용 (7)이있다. 순서 최적화 및 / 또는 해충의 제어를위한보다 효과적인 방법을 개발하기 위해서는, medfly 생물학 및 유전학 널리 전세계 많은 연구자들이 탐구되어왔다. medfly 게놈 서열 8, 9의 가용성, 유전자 기능에 대한 새로운 조사를 용이하게합니다. RNA 간섭은 이러한 연구를위한 강력한 도구이며 dsRNA를 (이중 가닥 RNA) 또는 siRNA를 (작은 간섭 RNA)의 미세 주입을 통해 달성 될 수있다. 이 기술을 보여주기 위해, 예를 들어, 사용 된 그 C.에서 결정 성 고분자 연쇄 capitata 일부만 초파리 (10)의에 대해 보존된다. 프로토콜의 발전은 C. 허용 medfly 배아 microinject 할 capitata이 아닌 첫 번째가 될 수 있습니다-Drosophilid 파리 종은 유전자 변형된다. 그 계란 11 탈수 양쪽 형태와 저항의 관점에서, 초파리와 마찬가지이기 때문에, 프로토콜은 제 D. 위해 개발 된 프리 배반 배아로 플라스미드 DNA를 전달하도록 melanogaster의 12, 13 C. 초기에 사용하도록했다 capitata. 이 첫 번째 실험은 transposable 요소 미노스 (11)에 따라 medfly 세균 라인 변환을 허용했다. 이어서, 원래의 시스템은 다른 트랜스포존 기반의 접근법을 사용하여 14 변형시켰다. 이것은 나비목 트리코 NI (15)로부터 피기 백하는 경우이다. 프로토콜은 이후 상기 최적화되었으며, 이는 많은 다른 파리목 22-31의 또 다른 tephritid 종의 16-21 변환 및 허가되었다. 모든 이러한 시스템은 일반적인 바이너리 벡터 / 헬퍼 플라스미드의 형질 전환 시스템의 사용에 의존한다 : 인공 결함을 견인원하는 유전자를 포함하는 아들은 플라스미드 DNA로 조립 및 트랜스 효소 (32)를 제공하여 곤충의 게놈에 통합되어 있습니다. 형질 medfly 라인의 수는 정확성을 향상시킬 수있는 형광 정자 균주 남성 만 자손을 생산하고, 따라서 추가적인 sexing 전략을 필요로하지 않으며, 균주 사멸을 유도하는 조건을 보이면서 치사 유전자를 운반하는 균주를 포함한 여러 기능과, 생성 된 농성 모니터링 단계 33-37의. 형질 전환 된 미생물의 야생에서 박리가 모기 만 (38, 39)에 대하여 파일럿 테스트에서 발생하지만, 하나 이상의 회사는 필드 (40)으로 사용하기위한 유전자 medfly 균주들을 평가하고있다. 배아 미세 주입도 (CR을 같은 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs), 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 새로운 게놈 편집 도구의 개발을 선호 할 수 있습니다ISPR) / CRISPR 관련 단백질 (9) 뉴 클레아 제 (Cas9)과 새로운 진화 및 발달 연구를 활성화뿐만 아니라 가능한 생명 공학 도구 상자를 확장합니다 원점 복귀 엔도 뉴 클레아 유전자 (HEGs). 게놈 편집 방법은 이미 모기 41 유전자 드라이브 시스템의 생성을 허용하고 medfly 그들의 전송이 임박. 여기에서 우리는 위에서 언급 한 모든 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다 medfly 배아에서 핵산을 마이크로 인젝션위한 범용 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1 x 주입 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.1 mM 인산염 버퍼 pH 7.4, 5&nbsp; mM KCl</td></tr><tr><td>구성 플라스미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도우미 플라스미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>페놀-클로로포름 정제</td></tr><tr><td>표준 애벌레 식품</td><td></td><td></td><td>1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g 광범위한 항균제 제약 제품에 용해 50&nbsp; 에탄올 ml, 설탕 400g, 탈염 맥주 효모 175g, 연질 밀기울 1kg</td></tr><tr><td>당근 애벌레 식품</td><td></td><td></td><td>2.5g 한천, 나트륨 벤조에이트 4g, 4.5ml 37% HCl, 42g 효모 추출물, 115g 당근 가루, 2.86&nbsp; g 광범위한 항균제, 물을 1 L에 성인</td></tr><tr><td>식품</td><td></td><td></td><td>효모 추출물과 설탕 (1:10)</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>주사 바늘&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>성인 케이지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로트리플루오로에틸렌 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Ceratitis capitata</td><td></td><td></td><td>사용된 균주는 ISPRA입니다</td></tr></tbody></table>.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; ceratitis의 capitata</em

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

지중해 과실 파리 (medfly) Ceratitis capitata (WIEDEMANN) (파리목 : Tephritidae)은 매우 높은 농업 관련을 가진 해충 종입니다. 이는 생식 행동에 기인한다 : 그들은 계란과 펄프의 부화 유충 피드를 배치 할 때 여성은 과일과 야채의 외부 표면을 손상. 야생 C. capitata 인구는 전통적으로 분무 및 / 또는 환경 친화적 인 접근 방식이, 가장 성공적인은 멸균 곤충 기술 (SIT) 인 살충제를 통해 제어된다. 농성 대량 사육, 방사선 기반의 살균과 짝짓기를하는 능력을 유지하지만 비옥 한 자손을 생성 할 수없는 남성의 필드 자료에 의존한다. 출현과 함께 medfly 게놈 시퀀스의 가용성과 생명 공학 도구의 이후의 급속한 발전,이 종의 생물학에 대한 우리의 이해를 밀어 크게하고있다. 이 게놈 조작, 캘리포니아위한 새로운 전략의 확산을 선호N 인구 조절에인가 될 수있다. 이러한 맥락에서, 배아 미세 주입은 medfly 컨트롤의 도구 상자를 확장의 이중 역할을한다. 키 생물학적 과정을 조절하는 유전자의 기능을 방해 할 수있는 능력은, 참으로, medfly 침입을 기본 분자 기계에 대한 우리의 이해를 확장합니다. 또한, 배아 - 라인 변환을 달성하는 능력은 새로운 SIT 설정 미래 응용 분야에 대해 시험 할 수있는 다수의 형질 전환 균주의 제조를 용이하게한다. 실제로 유전자 조작은, 예를 들어, 현장에서 웅성 불임의 성능을 모니터링 할 수 바람직한 특성을 부여하기 위해 사용될 수 있으며, 또는 초기 생명 단계의 사멸을 초래할 수있다. 여기에서 우리는이 두 가지 목표를 달성하기 위해 medfly 배아로 핵산을 microinject하는 방법을 설명합니다.

여기에서 우리는 각각의 관심의 유전자의 기능적 특성에 관한 배아 미세 주사의 두 응용 프로그램 (사례 1)을보고하고, 형질 전환 균주의 발생 (사례 2)에서. 배아에 dsRNA를 배달 유전자 기능을 해명합니다. innexin-5 유전자를 곤충에서, 남성 및 여성 생식기 43,47,48 구체적으로 표현 갭 정션을 인코딩한다. 밀접한 관련 종의 사용 가능한 정보에 기초하여, dsRNA에 의해 유도 된 유전자 침묵은 medfly 여성 및 남성 생식 세포의 제거 될 것으로 예상되었다. 2400 배아의 총 수는 548 유충이 부화하고 216 성인 (게시되지 않은 데이터) 살아있는 2 μg의 / μL dsRNA를 혼합, 주입 ...

지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

이 절차의 전반적인 목표는 주요 농업 해충인 Ceratitis Capitata의 배아에 핵산을 전달하여 최종적으로 해당 해충을 제어하기 위한 도구 상자를 확장하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 유전자의 기능을 교정하고 형질전환 계통을 생성하는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 적은 양의 핵산을 주입하여 원하는 효과를 얻을 수 있다는 점입니다.지중해초파리 군집의 모든 생애 단계를 25 °C, 습도 65%, 12시간 명기/12시간 암기의 광주기(오전 8시 광기 시작) 조건에서 유지합니다. 케이지 바닥의 작은 구멍을 통해 스펀지 스트립을 삽입하여 모세관 현상으로 파리에게 물을 공급합니다. 6L 용량의 케이지를 준비하고, 여기에 1,500~2,000마리의 번데기를 넣습니다.먹이로는 효모와 설탕을 1:10 비율로 혼합한 것을 약 45 g 정도 케이지에 넣어줍니다. 알을 수집하려면 케이지 아래에 물을 채운 플레이트를 놓습니다. 암컷이 망을 통해 알을 낳으면 알이 물속에 수집됩니다.처녀 암컷은 무정란을 낳을 수 있으므로, 알을 수집하기 전 파리가 최소 일주일이 될 때까지 기다려 모든 알이 수정되었는지 확인하십시오. 알을 수집하려면 고운 체로 물을 거릅니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 알을 약 0.5 liters의 표준 유충 먹이가 담긴 플라스틱 상자로 옮깁니다.충분한 수의 알이 산란되지 않았다면, 성충 먹이의 효모 함량을 최대 25%까지 높이십시오. 각 상자를 밀기(bran) 층이 깔린 투명 용기에 넣어 번데기화를 유도합니다. 공기가 순환될 수 있도록 용기를 망 덮개로 덮어줍니다. 약 10일 후, 번데기화를 위해 밀기 층으로 내려온 3령 유충이 있는지 확인하십시오.번데기를 발견하면 다음 날부터 번데기 확인 준비를 합니다. 번데기를 수집하려면 부드러운 붓을 사용하여 용기에서 쓸어 모으십시오. 처음에는 번데기를 작은 컵에 수집합니다.수집이 완료되면 번데기를 새로운 성충 케이지로 옮깁니다. 성충은 약 10일 후에 우화합니다. 미세 주입을 위해 슬라이드를 미리 준비하십시오.슬라이드에 2cm 길이의 양면테이프 조각을 붙이고, 배아가 건조해지지 않도록 오일 층을 유지하는 벽을 만들기 위해 차이나 마커로 가장자리를 표시합니다. 갓 산란된 배아를 수집하려면, 수정된 젊은 암컷이 새 트레이에서 30분 동안 산란하도록 둔 다음 배아를 수집합니다. 배아에서 난막을 제거하려면, 거름망과 알을 시판 50% bleach 용액에 5초 동안 담급니다.배아를 과하게 표백하지 않는 것이 매우 중요합니다. 표백된 배아를 담은 스트레이너를 깨끗한 초순수에 조심스럽게 담가 즉시 세척하십시오. 이 과정을 최소 4회 반복하십시오.그 다음, 스트레이너를 깨끗한 초순수에 보관하고 2시간 이내에 배아를 주입합니다. 이어서 세밀한 붓을 사용하여 배아 약 50개를 수집하여 물에 적신 검은색 여과지 디스크 위에 놓습니다. 해부용 실체 현미경 하에서 배아를 준비된 현미경 슬라이드의 이중 코팅 테이프 위에 일렬로 배열합니다.모든 배아를 동일한 방향으로 정렬합니다. 페인트 브러시로 배아 막을 뚫는 과정에서 배아에 손상을 주어 생존율이 낮아질 수 있으므로, 배아를 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 이제 배아 위에 chloro-trifloro etholene 오일을 한 층 덮어줍니다.오일은 차이나 마커로 표시한 경계 내에 유지되어야 합니다. 경계를 넘치게 하지 마십시오. 마이크로피펫을 사용하여, 1~2 µg/µL 농도의 핵산 용액 몇 µL를 주입 바늘에 채웁니다.그 다음, 바늘을 미세 주입 장치에 연결하고 150 hecto-pascals의 배압으로 800 hecto-pascals에서 0.5초 동안 주입하도록 설정합니다. 주입 시에는 풋 페달 트리거를 사용하고, 스테이지 컨트롤로 슬라이드를 이동시키면서 미세 조작기를 사용하여 바늘을 제어합니다. 주입 볼루스가 적절하게 배출되는지 확인한 후, 바늘을 행의 첫 번째 배아 후극에 맞춥니다.스테이지를 이동하여 배아에 바늘을 삽입하고 핵산 볼러스를 주입합니다. 주입된 액체로 인해 내부 압력이 증가하면서 배아가 약간 움직이게 됩니다. 페달을 떼고, 즉시 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거합니다.주입 부위에서 소량의 세포질이 유출될 수 있으며, 이는 정상적인 현상입니다. 주입 시 배아가 터지는 경우에는 배아를 오일로 덮기 전 몇 분 동안 건조시키십시오.주입 후, 슬라이드를 페트리 접시로 옮깁니다. 접시 뚜껑에 여과지 디스크를 배치합니다. 여과지를 물로 적신 후, 페트리 접시를 파라핀 필름으로 밀봉합니다.챔버를 25 °C에서 배양합니다. 주입 2일 후, 하루 동안 여러 차례 슬라이드를 확인하여 부화한 유충이 있는지 확인합니다. 오일 속의 유충을 찾아 세밀한 붓을 사용하여 당근 기반의 유충 먹이가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.각 접시에 최대 200마리의 유충을 넣습니다. 유충은 오일 속에서 오래 생존할 수 없으므로 자주 확인하십시오. 유충에 공기가 계속 공급될 수 있도록 뚜껑을 거의 닫은 상태로 유충을 배양합니다.매일 디쉬를 확인하고 일주일 후, 디쉬를 밀기울이 담긴 컨테이너에 넣어 유충을 수집할 준비를 합니다. 번데기를 수집하면 곧 성충이 우화할 것입니다. 이후 우화한 성충을 이산화탄소를 사용하여 마취시키고 형질전환 여부를 확인합니다.스크리닝 시, 이러한 이동 방법이 결정적일 수 있습니다. Medfly 성충은 얼음이나 CO2를 사용하여 마취할 수 있으나, 장시간 노출될 경우 생존율이 낮아질 수 있습니다. DS red 광폭 필터를 사용하여 적색 형광의 존재 여부를 확인하십시오.또는 EYFP 필터를 사용하여 녹색 형광을 확인합니다. 형질전환된 개체들을 반대 성별의 야생형 성체와 함께 작은 케이지로 옮겨 헤테로 접합체 계통을 구축합니다. 한 실험에서는 double-stranded RNA를 사용하여 inx5 유전자 발현을 억제했습니다.주입하지 않은 대조군의 성체 생식선은 예상대로 정상적으로 보였으나, 처리된 개체들은 정소와 난소가 발달하지 않은 모습을 보였습니다. 암수 양성 개체의 복부에서 inx5 전사체 풍부도를 정량화한 결과, 대조군에 비해 해당 유전자의 발현이 유의하게 낮음이 확인되었습니다. 두 번째 실험에서는 서로 다른 형광 마커를 발현시키기 위해 beta-2 tubulin 프로모터를 사용하여 정자가 표지된 두 가지 계통을 제작하였습니다.형질전환 수컷은 신체와 정소에서 뚜렷한 형광 패턴을 보였습니다. 본 영상을 통해 우리는 초파리 배아의 사육 및 핵산 미세주입을 위해 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이를 숙달하면 8시간의 작업 시간 동안 최대 1,000개의 배아에 주입을 수행할 수 있습니다.이 절차에 따라, thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine과 같은 다른 금속들을 사용하여 차세대 medfly 균주를 개발할 수 있습니다.

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

여기서, 우리는 NASOnia vitripennis에 있는 효율적인 pupal 및 성인 주사를 위한 방법을 태아 micro주입에 접근하는 대안으로, RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 유전자 녹아웃을 통해 RNA 침묵을 사용하여 관심있는 유전자의 기능적 분석을 가능하게 하는 방법을 기술합니다.

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

여기에서는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 통해 게놈을 수정하거나 생식계열 형질전환을 통해 표시된 전치 요소를 추가할 목적으로 세포 전 옥수수 식물 호퍼 배아를 수집하고 미세 주입하기 위한 프로토콜입니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

학습하세요 Ceratitis capitata 배아 미세주입을 통한 핵산 전달 기법으로, 저농도 핵산 주입으로 유전자 기능 연구 및 형질전환 계통 생성이 가능합니다. 이 방법은 농업 해충 관리를 위한 새로운 유전적 도구를 확장합니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,

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