세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달, Ceratitis의 capitata

이 절차의 전반적인 목표는 중요한 농업 해충인 Ceratitis Capitata의 배아에 핵산을 전달하여 궁극적으로 이를 통제할 수 있는 도구 상자를 확장하는 것입니다. 이 방법은 부동태 유기체의 유전자를 기능적으로 교정하고 형질전환 균주를 생성하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 원하는 효과를 얻기 위해 매우 적은 양의 핵산을 주입한다는 것입니다.

메드플라이 군집의 모든 생애 단계를 섭씨 25도, 습도 65%로 유지하고 오전 8시부터 광위상이 있는 12개의 12시간 명암/암흑 광주기를 유지합니다.케이지 바닥에 있는 작은 구멍을 통해 스폰지 스트립을 삽입하여 모세관 작용을 통해 파리에게 물을 공급합니다. 6리터 케이지를 설정하고 1, 500에서 2, 000 사이의 번데기를 적재합니다.

음식의 경우 효모와 설탕의 1-10 혼합물 약 45g을 케이지에 적재합니다. 알을 모으려면 케이지 아래에 물을 채운 접시를 놓습니다. 암컷은 그물을 통해 알을 낳고 물에 모입니다.

처녀 암컷은 난자를 만들 수 있기 때문에 알을 모으기 전에 파리가 적어도 일주일 될 때까지 기다렸다가 난자가 모두 수정되었는지 확인하십시오. 계란을 모으려면 미세한 여과기로 물을 걸러냅니다. 그런 다음 저온 살균 피펫을 사용하여 약 0.5리터의 표준 애벌레 먹이가 들어 있는 플라스틱 상자에 계란을 옮깁니다.

알을 충분히 낳지 않았다면 성인 음식의 효모 함량을 최대 25%까지 늘리십시오.번데기를 위해 밀기울 층이 들어있는 투명 용기에 각 상자를 넣으십시오. 공기 순환을 위해 용기를 그물 뚜껑으로 덮으십시오. 약 10일 후, 번데기를 위해 밀기울층으로 뛰어내린 세 번째 인스타 유충이 있는지 확인합니다.

번데기를 발견하면 다음 날에 번데기를 확인할 준비를 하십시오. 번데기를 모으려면 부드러운 솔을 사용하여 용기에서 번데기를 쓸어냅니다. 처음에는 번데기를 작은 컵에 모으십시오.

수집이 완료되면 번데기를 새 성체 케이지로 옮깁니다. 성충은 약 10일 후에 나와야 합니다. 마이크로 주입의 경우 슬라이드를 미리 준비하십시오.

2cm 길이의 양면 코팅 테이프를 슬라이드에 부착하고 가장자리를 도자기 마커로 표시하여 배아를 촉촉하게 유지하는 오일 층을 위한 벽을 만듭니다. 갓 낳은 배아를 채취하려면 어린 수정 암컷이 새 트레이에서 30분 동안 난자 포지팅을 한 다음 배아를 채취하도록 합니다. 배아에서 융모막을 제거하려면 여과기와 난자를 시판되는 50% 표백제 용액에 5초 동안 담그십시오.

배아를 과도하게 표백하지 않는 것이 중요합니다. 즉시 여과기를 깨끗한 초순수에 조심스럽게 담궈 표백된 배아를 씻으십시오. 이 작업을 최소 4회 수행합니다.

그런 다음 여과기를 투명한 초순수에 보관하고 2시간 이내에 배아를 주입합니다. 다음으로, 고운 붓을 사용하여 약 50개의 배아를 모아서 물에 적신 검은색 여과지 원반에 놓습니다. 해부 실체 현미경 아래에서 준비된 현미경 슬라이드의 이중 코팅 테이프에 배아를 정렬합니다.

모든 배아를 같은 방향으로 향하게 합니다. 페인트 브러시로 배아막을 뚫으면 배아의 생존을 감소시키는 손상이 발생할 수 있으므로 배아를 조심스럽게 조작하는 것이 중요합니다. 이제 배아를 chloro-trifloro etholene 오일 층으로 덮습니다.

오일은 중국 마커 테두리에 의해 포함되어야합니다. 국경을 넘치지 마십시오. 마이크로피펫을 사용하여 주사 바늘에 몇 마이크로리터의 핵산 용액을 마이크로리터당 1-2마이크로그램으로 로드합니다.

그런 다음 바늘을 마이크로 주입 장치에 연결하고 150 헥토 파스칼의 배압으로 800 헥토 파스칼에서 30 초 주입을 제공하도록 설정합니다. 주입하려면 풋 페달 방아쇠를 사용하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 제어하는 동안 stage 컨트롤을 사용하여 슬라이드를 이동합니다. 주입 볼루스가 제대로 배출되고 있는지 확인한 다음 바늘을 열에 있는 첫 번째 배아의 후극에 맞춥니다.

스테이지를 움직여 배아에 바늘을 삽입하고 핵산 덩어리를 주입합니다. 주입된 액체는 내부 압력을 증가시켜 배아를 약간 움직이게 합니다. 페달을 놓고 즉시 그러나 부드럽게 배아에서 바늘을 제거하십시오.

주사 부위에서 약간의 세포질이 누출됩니다. 이것은 정상입니다. 주사로 배아가 터지면 배아를 기름으로 덮기 전에 몇 분 동안 배아를 건조시킵니다.

주입 후 슬라이드를 페트리 접시로 옮깁니다. 접시 뚜껑에 여과지 디스크를 놓습니다. 필터를 물에 담그고 파라핀 필름으로 페트리 접시를 닫습니다.

챔버를 섭씨 25도에서 배양합니다. 주사 2일 후 하루 종일 슬라이드에 부화한 유충이 있는지 여러 번 확인하십시오. 기름에서 유충을 찾고 고운 붓을 사용하여 당근 기반 애벌레 먹이가 있는 페트리 접시에 옮깁니다.

각 접시에 최대 200마리의 유충을 넣으십시오. 유충은 기름에서 오래 살 수 없으므로 자주 찾으십시오. 뚜껑을 대부분 닫은 상태에서 유충을 부화시켜 유충에 여전히 공기 흐름이 있도록 합니다.

매일 접시를 확인하고 일주일 후에는 밀기울이 담긴 용기에 접시를 넣어 유충을 모을 준비를 합니다. 번데기를 모으고 곧 나타날 것으로 예상하십시오. 나중에 이산화탄소를 사용하여 부화한 성체를 마취하고 변형 여부를 검사합니다.

걸러낼 때 동원 방법이 중요할 수 있습니다. 메드플라이 성체는 얼음이나 CO2를 사용하여 마취할 수 있지만 장기간 노출되면 다른 사람의 생존이 감소할 수 있습니다. DS red 광각 필터를 사용하여 적색 형광의 존재 여부를 확인합니다.

또는 EYFP 필터를 사용하여 녹색 형광을 확인합니다. 변형된 개체를 이성의 야생형 성체가 있는 작은 우리로 옮겨 이형접합 균주를 확립합니다. 한 실험에서는 inx5 유전자 발현을 침묵시키기 위해 이중 변형 RNA를 사용했습니다.

주사되지 않은 대조군의 성인 생식계는 예상대로 정상으로 보인 반면, 치료를 받은 개인은 고환과 난소가 덜 발달된 것으로 나타났습니다. 남녀 모두의 복부에서 inx5 전사체 풍부도를 정량화한 결과, 대조군에 비해 유전자의 발현이 현저히 낮았음을 확인했습니다. 두 번째 실험에서는 서로 다른 형광 마커를 구동하기 위해 beta-2 tubulin promoter를 사용하여 표지된 정자를 가진 두 개의 균주를 생성했습니다.

형질전환 수컷은 신체와 고환에서 뚜렷한 형광 패턴을 보였습니다. 이 비디오를 통해 우리는 medfly 배아에 핵산을 배양하고 미량 주입하기 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 일단 마스터하면 하루 8시간 동안 최대 1,000개의 배아를 주입할 수 있습니다.

이 절차에 따라 thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine과 같은 다른 금속을 수행하여 차세대 medfly 균주를 개발할 수 있습니다.