생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

이 절차의 전반적인 목표는 당뇨병성 쥐의 큰 전층 피부 결함에 대한 상처 치유에 대한 인공 피부와 결합된 지방 유래 줄기 세포 시트의 효과를 확인하는 것입니다. 이 방법은 뼈가 노출된 당뇨병성 큰 상처와 같은 만성 상처의 치유에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 시트 기술을 사용하여 세포를 고체 시트로 상처에 이식하고 그 결과 실행 가능하고 안정적인 이식이 가능하다는 것입니다.

뚱뚱한 패드 기증자의 경우 8주에서 33주 된 루이스 쥐를 사용할 계획을 세우십시오. 수술 부위에는 멸균 면봉 어플리케이터, 거즈, 메스, 바늘 홀더, 수술용 가위, 집게 한 쌍 및 5-0 나일론 봉합사를 준비하십시오. 임시 조직 배치를 위해 100ml 페트리 접시에 10mL의 PBS를 로드합니다.

PBS가 적재된 접시의 무게를 측정하여 나중에 수확된 조직의 질량을 찾습니다. 쥐를 마취한 후 멸균 드레이프에 누운 자세로 놓습니다. 그런 다음 수술 부위를 면도하고 70% 에탄올을 여러 번 번갈아 가며 문질러 노출된 피부를 문지릅니다.

이제 측면 하복부를 3cm 높이로 절개합니다. 다음으로 외부 경사근을 노출시키고 해부합니다. 그런 다음 부고환을 둘러싼 부고환 지방 조직을 노출시킵니다.

다음으로, 부고환 지방 조직을 조심스럽게 절제합니다. 부고환, 고환 및 부고환 혈관의 손상을 피하십시오. 조직을 PBS 접시에 옮깁니다.

그런 다음 기증자 쥐를 닫고 표준 수술 후 관리 방법을 따릅니다. 수확된 지방 조직 2-3g에서 ASC를 분리합니다. 0.1% A형 콜라겐분해효소에서 한 시간 동안 조직을 소화하여 기질 혈관 분획(SVF)을 얻습니다.

SVF를 정제한 후 20ml의 배지에 SVF를 현탁시킵니다. 현탁액을 60제곱센티미터 배양 접시 2개로 나누고 표준 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 플레이트를 세 번 세척하여 부착되지 않은 세포와 부스러기를 제거합니다.

최종 세척 후 새로운 완전한 매체를 다시 추가하십시오. 그런 다음 배양 3일째에 거의 하위 합류점이 될 때까지 세포를 계속 계대시킵니다. 그런 다음 간단한 배양에서 0.25 % 트립신 EDTA 1 밀리리터를 사용합니다.

플레이트에서 세포를 제거합니다. 세포가 활성 트립신에 10분 이상 노출되지 않도록 합니다. 세포를 관찰하고 세는 후에, 1, 평방 센티미터 당 700의 조밀도에 그(것)들을 subculture

그런 다음 3일마다 세포를 통과시키고 진행하기 전에 3개의 통로를 완료합니다. 계대배양된 랫드 ASC를 세 번째로 통과시킨 후, 150, 000개의 세포를 35mm 직경의 온도 반응형 배양 접시와 2밀리리터의 배양 배지에 플레이트합니다. 접시를 인큐베이터에서 3일 동안 배양하여 균일한 세포 시트를 만듭니다.

3일 후 매체를 변경하고 AA 밀리리터당 16.4마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 세포를 배양하고 AA 배지를 격일로 변경합니다. AA 함유 배지에서 4-5일 후에 ASC의 증식을 확인합니다. 셀과 인접한 셀 시트 사이의 간격을 찾습니다.

인접한 셀 시트가 설정되면 셀을 모델에 사용할 수 있습니다. 필요한 경우 플레이트를 실온에서 15-20분 동안 두어 세포 시트를 수집합니다. 플레이트는 온도에 민감하기 때문에 세포가 연속적인 시트로 자발적으로 분리되고 시트는 집게로 제거할 수 있습니다.

비만 상처 치유 모델의 경우 체중이 500-600g 인 16-18 주 된 성인 수컷 ZDF 쥐를 사용하십시오. 수술 부위에 쥐를 배치하고 마취시키고 머리를 면도하기 전에 70% 에탄올을 사용하여 청소하십시오. 그런 다음 수술 부위를 면도하고 70% 에탄올을 번갈아 가며 스크럽하여 노출된 피부를 청소합니다.

이 시기쯤에, 지방 줄기 세포의 온도 감지 플레이트를 벤치로 옮깁니다. 세포 시트가 플레이트에서 분리되기 전에 배지를 제거하고 PBS로 셀 시트를 세 번 세척합니다. 세포 시트를 수집한 후 필요할 때까지 PBS에 담가둡니다.

세포가 준비되면 쥐의 머리에 15 x 10mm 두께의 피부 결점을 만듭니다. 먼저 피부 조직을 골막까지 제거합니다. 그런 다음 메스와 수술용 가위로 피부 조직을 절제합니다.

결손을 완성하려면 골막막을 흡혈구로 골막을 제거하십시오. 그런 다음 결함 위에 셀 시트를 놓습니다. 줄기 세포 시트는 부드럽고 유연합니다.

집게를 사용하여 결함의 모든 모서리로 확장하십시오. 이제 사용 직전에 식염수에 적신 10 x 15mm 패치로 세포 시트와 결손을 덮고 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 약 10 바늘로 상처를 봉합합니다. 상처를 보호하려면 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 인공 피부에 15 x 20mm 크기의 비접착 드레싱 패치를 고정합니다.

쥐는 항상 드레싱을 제거하고 필요한 경우 즉시 드레싱을 교체하기 때문에 격일로 드레싱을 관찰할 계획을 세우십시오. 6마리의 주커(Zucker) 당뇨병성 지방쥐로 구성된 2개 그룹에서, 기술된 프로토콜은 두개골 결함을 생성하는 데 사용되었다. 실험용 쥐는 쥐 지방 줄기 세포 시트로 처리되었으며 대조군은 그렇지 않았습니다.

14일 후, 치료군의 상처는 대조군의 상처보다 현저히 작았다. 이 비디오를 보고 나면 쥐에서 뼈가 노출된 큰 상처를 만든 다음 지방 유래 줄기 세포로 그 상처를 치료하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 온도 반응형 배양 접시를 사용하는 전체 과정에서 엄격한 온도 관리를 사용해야 합니다.

그렇지 않으면 세포가 접시에서 자발적으로 분리되어 실험이 지연될 수 있습니다.