Name: 생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 지방유래줄기세포(ASC) 시트와 인공피부를 이용한 당뇨병 쥐의 만성 상처 치유 방법을. 이 기술은 세포 시트 공학으로 안정적인 이식을 가능하게 하여 당뇨병 환자의 난치성 상처 치료에 새로운 가능성을 제시합니다.

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저자 실용적인 조언을 제공 하는 학과의 플라스틱 및 재건 수술, 준 텐도 대학의과 대학, 박사 유키코가 감사 합니다. 우리는 또한 당뇨병 센터의 도쿄 여자의 의학 대학의과 대학 우수 기술 지원의 씨 카 즈 무라를 감사합니다. 이 연구는 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본에서 개발 혁신 시스템 "셀 시트 조직 공학 센터 (CSTEC)" 프로젝트의 학 제 연구 분야 프로그램 고급 혁신 센터의 창조에 의해 지원 되었다.

아래에 제시된 모든 실험 프로토콜은 도쿄 여자 의과 대학 의과 대학 동물 복지 위원회의 승인을 받았으며 동물 실험의 올바른 수행을 위한 지침의 모든 요구 사항을 준수했습니다.
1. 동물, 악기, 문화 배지 및 요리의 준비
<ol>
	<li>20% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 최소 필수 배지 알파를 사용하여 완전한 배양 배지를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 몇 달 동안 보관하십시오.</li>
	<li>성인 수컷 ZDF 쥐를 제2형 당뇨병성 비만 모델로 사용합니다. 수컷 루이스 쥐의 지방 패드를 사용하여 지방 조직을 분리하여 세포 시트를 준비합니다.</li>
</ol>
2. rASC의 격리 및 배양
<ol>
	<li>루이스 쥐(8-33주령, 수컷)에서 이소플루란을 사용하여 전신 마취 하에 지방 조직을 얻습니다.
	<ol>
		<li>설치류 기계식 인공호흡기와 4% 이소플루란을 준비합니다. 멸균 면봉 몇 개, 깨끗한 거즈, 메스, 바늘 홀더, 작동 중인 가위, 집게 한 쌍, 5-0 나일론 봉합사를 준비합니다. 수술 기구 및 용품을 소독하십시오.</li>
		<li>얻어진 지방 조직을 임시로 보존하기 위해 10mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 100mm 페트리 접시를 준비합니다. 수집된 지방 조직을 측정하기 위해 수술을 시작하기 전에 저울을 사용하여 PBS로 페트리 접시의 무게를 잰다. 멸균 커튼에 수술 기구와 용품을 놓습니다.</li>
		<li>설치류 기계식 인공호흡기를 통해 3 - 4%의 이소플루란을 사용하여 쥐를 마취하고 수술 중 쥐를 2 - 3%의 이소플루란으로 유지합니다. 각 쥐의 호흡 깊이와 속도를 관찰하여 마취 깊이를 모니터링합니다.</li>
		<li>멸균 장갑을 착용한 상태에서 멸균 커튼 위에 쥐를 누운 자세로 놓습니다. 전기 면도기로 수술 부위를 면도하고 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈를 사용하여 쥐의 복</li>부를 청소합니다.
		<li>쥐의 측면 하복부에 메스로 약 5cm 길이의 피부 절개를 만듭니다. 외부 경사근을 노출시키고 해부합니다. 그런 다음 부고환을 둘러싼 부고환 지방 조직을 노출시킵니다. 부고환 지방 조직을 부드럽게 당겨 빼냅니다. 
		참고: 지방 조직은 쥐의 복부 양쪽에서 얻을 수 있습니다.</li>
		<li>부고환 지방 조직만 절제하여 부고환, 고환 및 부고환 혈관의 손상을 방지합니다(그림 S1). PBS의 절제된 지방 조직을 페트리 접시에 담궈 건조를 방지하고 조직의 무게를 잰다.</li>
		<li>5-0 VICRYL로 복부 근육을 봉합하고 5-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다. 그런 다음 수술을 받은 각 쥐를 별도의 우리(우리당 쥐 1마리)로 되돌립니다. 
		참고: 쥐가 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 - 3 g의 지방 조직에서 rASC를 분리하십시오 (Lewis rat에서 절제 및 이전에보고 된 방법에 따라 처리) 27. 간단히 말해서, 절제된 지방 조직을 0.1% A형 콜라겐분해효소로 37°C에서 1시간 동안 효소로 분해하여 기질-혈관 분획(SVF; 그림 S2).
	<ol>
		<li>생물학적 세척 벤치에서 100μm 세포 여과기 여러 개, 50mL 튜브 여러 개, 15mL 튜브 여러 개 및 메스 2개를 준비합니다. 원심분리기를 켜고 수조를 37°C로 예열합니다. 또한 50mL 튜브에 A형 콜라겐분해효소 0.1%(최종 농도)로 약 50mL의 멸균 PBS를 준비합니다.</li>
		<li>메스 두 개를 사용하여 지방 조직을 작은 조각으로 다집니다.</li>
		<li>다진 지방 조직을 모두 50mL 튜브로 옮기고 PBS를 추가하여 총 부피를 15mL로 만듭니다.</li>
		<li>50mL 튜브를 5분 동안 똑바로 세웁니다. 상층을 버리고 이물질을 제외한 하층을 수집합니다.</li>
		<li>효소로 지방 조직을 분해하기 위해 상층이 포함된 PBS가 있는 50mL 튜브에 A형 콜라겐분해효소 용액 0.1%를 추가합니다. 
		참고: 37°C의 수조에서 지방 조직 2 - 3 g당 약 20 mL의 PBS를 데웁니다.</li>
		<li>50mL 튜브를 기울여 120 - 130rpm으로 37°C 수조에서 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다.</li>
		<li>흔든 후 50mL 튜브를 똑바로 세워 5분 동안 그대로 둡니다.</li>
		<li>100μm 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 여과하고 새 50mL 튜브에 용액을 붓습니다. 여과된 용액을 15mL 튜브 2개에 분주합니다.</li>
		<li>15mL 튜브의 용액을 700 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액의 상층을 조심스럽게 제거하고 용액의 하층을 5mL 남겨 둡니다. 펠릿을 흡입하지 마십시오.</li>
		<li>각 15 mL 튜브에 약 5 mL의 완전 배양 배지를 추가하고, 15 mL 튜브당 최대 10 mL를 추가하고, 펠릿을 조심스럽게 다시 현탁시킵니다.</li>
		<li>2.2.8 - 2.2.9단계를 반복합니다. 그런 다음 SVF를 얻습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>60cm2 배양 접시 2 개를 준비합니다. 700 × g에서 5분 동안 2회 원심분리 후 SVF를 수집합니다. SVF를 현탁하고 각 60cm2 배양 접시에 10mL의 SVF 용액을 플레이트화합니다.</li>
	<li>5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 접시를 배양합니다.</li>
	<li>PBS와 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 준비하고, 사용할 때까지 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>초기 도금(24시간) 후 PBS로 셀을 3회 세척하여 부착되지 않은 세포와 파편을 제거합니다. 신선한 완전한 매체를 추가하십시오.</li>
	<li>3일차에 거의 sub-confluent에 있는 세포를 계대분석합니다. 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 3 - 5분 동안 세포를 배양합니다. 
	참고: 세포 손상을 방지하기 위해 10분 이내에 트립신화 단계를 완료하십시오.</li>
	<li>트립신화 후 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 모든 세포가 접시에서 완전히 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 접시에 9mL의 완전 배양 배지를 추가합니다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.</li>
	<li>1.7 x 103 cells/cm2의 밀도로 세포를 계대배양 3일까지 3일마다 3번씩 배양합니다. 계대배양된 세포를 5%CO2 인큐베이터의 가습된 분위기에서 37°C로 배양합니다.</li>
</ol>
3. rASC 시트 생성
<ol>
	<li>직경 35mm의 온도 반응형 배양 접시를 여러 개 준비합니다. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 이상 동안 FBS(또는 FBS를 포함하는 완전한 배지)로 접시를 사전 코팅합니다. 
	알림: 직경 35mm의 온도 반응형 배양 접시는 시판되는 제품입니다.</li>
	<li>써모플레이트를 준비하고 다음 실험 절차를 위해 37°C에서 배양합니다. 
	참고: 세포가 접시에서 자발적으로 분리되는 것을 방지하기 위해 37°C 열 플레이트에서 온도 반응형 배양 접시를 사용하여 모든 절차를 수행합니다.
	<ol>
		<li>실험 전에 절차에 사용된 전체 배양 배지를 37°C로 가열합니다.</li>
		<li>루이스 쥐에서 유래한 종자 통로 3 rASCs를 2mL 총 부피의 완전 배양 배지를 사용하여 3일 동안 1.5 x 105 cells/dish 직경의 35mm 직경 온도 반응형 배양 접시에 넣습니다. 
		참고: rASC가 새로운 배양 접시에 도금될 때 균일한 rASC 파종과 균일한 두께의 rASC 시트를 얻기 위해 인큐베이터에서 접시를 앞뒤, 왼쪽, 오른쪽으로 천천히 흔들어야 합니다.</li>
		<li>파종 후 3일차에 배지 2mL를 16.4μg/mL L-아스코르브산 인산염 마그네슘 염 n-수화물(AA)을 포함하는 완전 배양 배지 2mL로 37°C 열 플레이트에서 배양한 온도 반응형 배양 접시로 변경합니다. 
		참고: 용존 AA는 -30°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>추가로 4 - 5일 동안 세포를 배양하고 2일마다 배지를 AA를 함유한 새로운 배지로 교체합니다.</li>
		<li>광학 현미경으로 ASC의 증식과 생성을 확인하여 인접한 세포 시트의 세포 사이에 갭이 발생했는지 여부를 확인합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cell sheet를 incubator에서 benchtop으로 15 - 20분 동안 옮겨 실온으로 냉각시킵니다.; 세포가 연속적인 cell sheet로 자발적으로 분리되는 것을 관찰합니다. 한 쌍의 집게로 접시 표면에서 rASC 시트를 수확합니다. 
	알림: 일반적으로 rASC 시트는 한 쌍의 집게로 처리할 수 있습니다. 필요한 경우, 세포 시트가 부서지기 쉽고 깨지기 쉬운 경우 이식 멤브레인을 사용하여 배양 접시에서 상처 부위로 세포 시트를 옮길 수 있습니다.</li>
</ol>
4. full-thickness skin defect wound model의 준비 및 rASC 시트의 이식
<ol>
	<li>설치류 기계식 인공호흡기와 4% 이소플루란을 준비합니다. 멸균 면봉 여러 개, 깨끗한 거즈, 5-0 나일론 봉합사, 메스, 골막 박식술, 바늘 홀더, 작동 가위, 집게 한 쌍을 준비합니다. 수술 기구 및 용품을 소독하십시오. 멸균 커튼에 수술 기구와 용품을 놓습니다.</li>
	<li>PBS를 준비하고 약간의 인공 피부 및 비접착성 드레싱과 함께 실온에서 유지하십시오. 인공 피부(15 x 10mm)와 비접착 드레싱(20 × 15mm)을 미리 자릅니다. 인공 skin. 를 사용하기 전에 인공 피부의 내부 콜라겐 스폰지 층을 식염수에 담그십시오.
	참고: 인공 피부는 외부 실리콘 시트 층과 내부 콜라겐 스폰지의 두 가지 층으로 만들어집니다.</li>
	<li>ZDF 쥐 (16-18 주령, 수컷, 500-600g)를 제 2 형 당뇨병 및 비만의 상처 치유 모델로 사용하십시오.</li>
	<li>설치류 기계식 인공호흡기를 사용하여 4% 이소플루란을 흡입하여 ZDF 쥐를 마취합니다. 설치류 기계식 인공호흡기를 통해 이소플루란을 4 - 5%로 사용하여 마취를 유도하고 수술 중에는 3 - 4%로 유지합니다. 발가락 꼬집기를 통해 각 쥐의 호흡 깊이와 속도를 관찰하여 마취 깊이를 모니터링합니다.</li>
	<li>멸균 장갑을 착용한 상태에서 멸균 커튼에 쥐를 엎드린 자세로 놓습니다. 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈를 사용하여 쥐의 머리를 청소하고, 전기 면도기로 수술 부위를 면도하고, 면도 후 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈를 사용하여 피부를 청소합니다.</li>
	<li>표피에서 골막까지의 피부 조직을 제거하여 마취된 ZDF 쥐의 머리에 제곱된 전체 두께 피부 결함(15 x 10mm2)을 만듭니다. 메스로 피부와 피부 조직을 절제하고 골막절 천술로 골막을 제거합니다.</li>
	<li>35mm 온도 반응형 배양 접시의 rASC를 이식 직전에 인큐베이터에서 실온 환경으로 옮깁니다.</li>
	<li>35mm 온도 반응형 배양 접시의 rASC가 상처가 형성된 후 접시 표면에서 시트로 자발적으로 분리되는 것을 관찰합니다. 온도에 반응하는 배양 접시에서 7일 동안 배양한 후 rASC 시트를 수확합니다. 배양된 배지를 제거하고 PBS로 rASC 시트를 세 번 세척합니다. 건조를 방지하기 위해 이식할 때까지 rASC 시트를 PBS에 담그십시오.</li>
	<li>한 쌍의 집게를 사용하여 rASC 시트를 두개골 결손 바로 위에 놓습니다. 세포 시트가 부서지기 쉽고 깨지기 쉬운 경우, 멤브레인을 배양 접시에서 상처 부위로 세포 시트를 옮기기 위한 골격으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>rASC 시트와 결손부위를 인공피부(15 x 10mm2)로 덮고 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 약 10개의 봉합물로 상처를 봉합합니다. 상처를 보호하기 위해 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 인공 피부 위에 비접착 드레싱(20 x 15 mm2)을 올려 상처 환경을 촉촉하게 유지하고 삼출물을 흡수합니다. 
	참고: 비접착성 드레싱은 적용 후 며칠 이내에 ZDF 쥐에 의해 제거됩니다. 따라서 이식 후 쥐를 정기적으로 모니터링 할 필요가 있습니다. 일반적으로 비접착성 드레싱은 전신 마취 하에 2일마다 교체합니다.</li>
	<li>수술을 받은 각 쥐가 완전히 회복될 때까지 별도의 우리로 되돌립니다(우리당 쥐 한 마리). 관찰 기간이 지난 후, 승인된 이소플루란 과다 투여 방법을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.</li>
</ol>

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다음 저자 공개할 금융 관계가이 게시에 관련: 男 카노는 설립자와 셀 씨 주식 회사, 기술 및 도쿄 여자의과 대학에서 특허 라이센스, 위원회의 감독 이며 男 오 카노 마사유키 야마토 있으며 셀 씨 주식 회사 도쿄 여자 의과대학 관계자 받는 셀 씨 i n c.에서 연구 자금 다른 저자는 그들은 금융 관계가이 게시에 관련 없는 선언 합니다.

성공적으로 경작 된 rASC 시트에 대 한 가장 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 온도 약 37 ° C에서 온도 응답 문화 요리에 경작 하는 동안 유지 되어야 합니다. RASC 시트를 생성 하는 동안 모든 절차 37 ° C 온도-접시에, 수행 하 고 모든 시 약은 저절로 요리31에서 분리에서 세포를 방지 하기 위해 37 ° C로 예 열. 2) 받는 사람에서 쥐 rASC 시트의 성공적인 이식에 대 한 중요 한 비 접착 드레싱의 제거를 방지 하기 위해 모니터링 해야 합니다. 드레싱 제거 되 면 새로운 비 접착 드레싱 상처 사이트에서 분리에서 이식된 ASC 시트를 방지 하기 위해 적용 되어야 합니다.
이 절차를 사용 하 여, rASC 시트 일반적으로 얻은 했다 시드 통로의 5-7 일 이내 3 셀 온도 응답 문화 요리. 초기 셀 밀도와 AA를 포함 하는 완전 한 문화 매체 적용 시간 rASC 시트를 생성 하는 데 필요한 문화 시간을 조정할...

당뇨병 환자의 인구 세계 전반 증가 하 고 20151;에서 400 백만 도달 당뇨병 환자의 약된 15-25% 더 낮은 말단 당뇨병 궤 양2의 진행에서 위험에 있습니다. 더 낮은 말단 당뇨병 궤 세공 되지 않으며 완전 한 회복 후 재활 훈련으로 장기간 치료를 해야 할 수도 있습니다. 긴 치료 기간을 종종 환자 삶의 질에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과. 따라서, 당뇨병 상처 치료에 대 한 감소 또는 악화를 방지 하는 새로운 치료를 개발 해야 합니다. 당뇨병 상처 치유를 평가 하려면 우리는 당뇨 궤 양 상처 치유 모델 쥐, 모방 실용적인 임상 조건, 최적화 그리고 치유 상처 가속 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 이식 여부 평가.
Mesenchymal stromal 세포 (MSCs) 그들의 자기 갱신, 그들의 immunomodulatory 효과 용량과 다양 한 세포 계보3으로 차별 하는 그들의 능력 때문에 상처 치유를 가속을 위한 우수한 잠재력을 전시. ASCs는 지방 조직에서 파생 된 MSC의 유형 그리고 그들은 그들의 잠재적인 신생 및 paracrine 활동4,5를 포함 하 여 다른 조직에서 파생 된 MSCs에 몇몇 이점을 전시. 지방 조직, 인체에서 상대적으로 풍부한 이며 최소한 침략 적 절차를 사용 하 여 컬렉션에 대 한 접근 허용. 따라서, ASCs 상처 치유 응용 프로그램6,7에 대 한 실험적으로 사용 되었습니다.
이전 보고서 상처 주변 지역에 단일 셀 MSC 정지 직접 주입 상처 치유8,9를 가속화할 수 있습니다 나타났습니다. 그러나,이 당뇨병 궤 양 모델 단일 세포 현 탁 액의 주입에 따라 상처 치유의 가속의 보고서에도 불구 하 고 상처 사이트에서 이식된 세포의 생존에 명확 하지 않습니다.
이 연구에서 우리가 온도 응답 문화 요리를 사용 하 여 셀 시트 공학 적용. 이 요리는 온도 응답성 고분자 N-isopropylacrylamide covalently 그들의 표면10에 바인딩된. 이식할된 폴리머 레이어를 온도-제어 세포 접착 또는 문화 접시의 표면에서 분리 수 있습니다. 접시의 표면이 된다 37 ° C에서, 반면 세포 표면에서 32 ° c 온도에서 친수성이 되 면 저절로 분리 준수 및 증식, 세포 수 소수 배양된 세포 온도; 감소 하면 그대로 셀 접합 및 세포 외 매트릭스 (ECMs)와 인접 셀 시트 수확 수 있습니다. 따라서, ECM, 트립 신, 등을 손상 하는 분해 효소 필요11않습니다. 따라서, 셀-시트 공학 셀 연결을 유지 하 고 세포 이식의 효능을 향상 시킬 수 있습니다.
또한, 셀-시트 이식 세포 주입12에 비교 될 때 세포 생존 율을 증가 시킵니다. 이 프로토콜에서 커 당뇨 지방 (ZDF) 쥐 지연된 상처 치유와 타입 2 당뇨병과 비만 모델 선정 됐다. 쥐 자발적으로 약 4 주에 비만 개발합니다. 그들은 다음 어느 시점에서 그들은 혈당 인슐린 저항, dyslipidemia, 그리고 hypertriglyceridemia13과 관련 된 전시 하는 나이의 8과 12 주 사이 비만과 2 형 당뇨병을 개발. 상처 지연된 치유, 주변 혈관, 당뇨병 신 장병에 감소 된 혈은 또한14,,1516을 관찰 했다. 또한, ZDF 쥐 다루기 힘든 피부 궤 양, 당뇨 궤 양 등의 치유 공부에 대 한 적절 한 모델을 수 있습니다.
상처 치유 메커니즘에 인간과 설치류의 차이 피부에 해 부 차이와 연결 됩니다. 정상적인 쥐에서 치유 하는 상처는 다시 epithelialization 및 알갱이 만듦 조직 형성에 따라 인간의 상처 치유 하는 반면 상처 수축, 기반. 일반적으로, 상처 부 설치류 모델에 사용 되 상처 수축 최소화 하는 데 도움이 하 고 비록 nondiabetic 쥐에 상처 수축에 의해 거의 완전히 폐쇄는 알갱이 만듦 조직17, 점차적인 형성에 대 한 수 있습니다. 그러나, 당뇨병 상처 수축 ZDF에서 쥐 장애인, 그리고 상처 치유 주로 발생 통해 다시 epithelialization 및 알갱이 만듦 조직 형성; 따라서,이 과정은 인간의 상처 치유14더 비슷합니다.
Debridement 임상 발생 종종 후 당뇨병 상처를 노출 된 뼈. 12 m m 직경 athymic 누드 마우스18,19 의 뒤에 전체 간격 피부 상처와 정상적인 쥐20의 뒤에 10 m m 직경 전체 간격 피부 상처 이전 연구 조사가 있습니다. 심한 당뇨병 상처에 대 한 임상 모델을 개발, 큰 (15 x 10 m m2) 전체 간격 피부 결함 뼈를 노출 하 고는 하지 않고 만들어졌습니다, 앞에서 설명한21, 제 2 형 당뇨병 및 비만 쥐에서.
일반 루이스 쥐의 ASCs에서 쥐 ASC (rASC) 시트는 ASC 시트 allogenic 이식 통해 창조 되었다. 임상 연습에서 궤 양은 당뇨병 환자 자주 전시 통제 높은 혈액 포도 당 수준 및 높은 몸 질량 색인, 이러한 환자에서 지방이 많은 직물을 얻기의 어려움을 증가 하는 이러한 합병증 원인 상처 치유 장애 등 심각한 당뇨 합병증 때문에 헌 식은 가능 하지입니다. 또한, 당뇨병 전시회와 동물에서 ASCs 속성을 변경 하 고 기능22장애인. 따라서, 여기에 제시 된 프로토콜 정상 쥐에서 rASC 시트 allogenic 이식 및 당뇨병 쥐에 인공 피부의 응용 프로그램 설명 합니다.
이 프로토콜에서 사용 하는 bilayer 인공 피부 상처의 자발적 수축 방지, 새로운 결합 조직 매트릭스의 합성을 촉진과 진정한 피23를 닮았다. 이 프로토콜에서 인공 피부는 rASC 시트에 배치 하 고 상처 수축 또는 느슨한 쥐 피부에서 발생 하는 확대를 방지 하기 위해 나일론 스레드 고정. 또한, 인공 피부 ASC 시트에 대 한 3 차원 프레임 워크를 제공, 이식 ASC 시트 및 상처, 습 한 환경 유지와 감염과 외부 세력 으로부터 상처를 보호 합니다. 마지막으로, 비 접착 드레싱 외부 충격에서 그것을 보호, 촉촉한 상처 환경을 유지 및 흡수 exudate 상처 위에 배치 됩니다.
RASC 시트, 유연한, 얇고 변형 이며 박동 심장24같은 받는 사람 사이트 준수 수 있습니다. 셀-시트 엔지니어링과 다양 한 조직 재건을 위해 사용 되어 치료 효과25,26. 를 생성할 수 있습니다. 임상 치료 잠재력을 전시 하는 ASC 시트의 다양 한 상처 치유 가속 수 있습니다. 또한, ASC 시트, 인공 피부의 사용과 결합의 수용자 이식 다루기 힘든 궤 양이나 화상, 말 초 동맥 질환 또는 교원 질 질병, 관찰 등의 치료에 적용할 수 있습니다 또는 영양 부족은 또는 스테로이드를 사용 하는 환자에 게 관리 될 수 있습니다. 이 방법은 ASCs 이식의 효율성을 증가 시킵니다. 상처 치유에서 쥐 모델 인간의 상처 치유 과정을 닮 고 소형 실험 동물 임상 상태를 모방 하는 심각한 상처 상태를 생성 합니다.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>32571-036</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Japan Bioserum Co Ltd.</td><td>S1650-500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 A</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10 103 578 001</td><td>독일 만하임</td></tr><tr><td>60 cm2 Primaria 조직 배양 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353803</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>1490-144</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산 인산염 마그네슘염 n-수화물</td><td>Wako</td><td>013-19641</td><td></td></tr><tr><td>35mm 온도 반응형 배양 접시(UpcellTM)</td><td>CellSeed</td><td>NUNC-174904</td><td>일본 도쿄(</td></tr><tr><td>MP-1000)</td><td>Kitazato Science Co., Ltd. </td><td>1111</td><td></td></tr><tr><td>설치류 기계식 인공호흡기</td><td>Stoelting</td><td>#50206</td><td>Wood Dale, IL</td></tr><tr><td>4% 이소플루란</td><td>Pfizer Japan</td><td>114-13340-3</td><td>Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>인공 피부 (Pelnac&reg; )</td><td>스미스 & 조카</td><td>PN-R40060</td><td>&nbsp; 일본 도쿄</td></tr><tr><td>-비접착성 드레싱 (Hydrosite plus&reg; )</td><td>스미스 & 조카</td><td>66800679</td><td>Allevyn non-adhessing&reg로 알려져 있습니다. 미국에서</td></tr><tr><td>5-0 나일론 봉합</td>사 <td>Alfresa</td><td>EP1105NB45-KF2</td><td></td></tr><tr><td>20 CELLSTAR TUBES</td><td>greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning Incorporated</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL</td><td>Hu-Friedy</td><td>P14</td><td>Chicago, IL</td></tr></tbody></table>

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (asc) 시트의 이식

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

인공 피부는 임상 연습에 상당한 치료 결과 달성 했다. 그러나, 당뇨병 환자 비능률적된 혈 또는 큰 상처와 상처에 대 한 인공 피부 치료 연장 될 수 있습니다. 세포 기반 치료 당뇨병 궤 양의 치료에 대 한 새로운 기술로 등장 하 고 셀 시트 공학 세포 이식의 효능을 향상 했다. 보고서의 수는 지방 유래 줄기 세포 (ASCs), 중간 엽 기질 세포 (MSC), 유형의 지방 조직 및 다른 조직에서 MSCs에 비교 될 때 컬렉션에 대 한 그들의 접근에서 그들의 관계 되는 풍부 때문에 치료 잠재력을 전시 하는 건의 했다. 따라서, ASCs 치료 용 줄기 세포의 좋은 원천이 될 나타납니다. 이 연구에서는 일반 루이스 쥐의 epididymal 지방 지방에서 ASC 시트 온도 응답 문화 요리와 의약품을 포함 하는 일반 문화 매체를 사용 하 여 성공적으로 창조 되었다. ASC 시트 커 당뇨병 지방산 (ZDF) 쥐에 이식 했다의 저하는 비만 2 형 당뇨병 쥐 모델 상처 치유. 상처 후부 두개골 표면에 만들어진, ASC 시트는 상처에 이식 했다 그리고 bilayer 인공 피부는 시트 커버를 사용 되었다. 받은 ASC 시트에서 쥐에서 쥐 ASC 시트 이식 없이 보다 치유 상처 더 했다. ASC 시트는 습 한 상처 환경 유지 보수를 필요로 건조 조건에 과민 하기 때문에이 접근은 제한 되었다. 따라서, 인공 피부 건조를 방지 하는 ASC 시트 커버를 사용 되었다. 인공 피부와 함께에서 ASC 시트 allogenic 이식 또한 다른 다루기 힘든 궤 양이나 화상, 말 초 동맥 질환 및 교원 질 질병, 관찰 등을 적용할 수 있습니다 그리고는 영양 또는 스테로이드를 사용 하는 환자에 게 관리 될 수 있습니다. 따라서,이 치료는 당뇨병 상처 치유에 대 한 치료 옵션을 개선 향한 첫 번째 단계를 수 있습니다.

이 프로토콜 다루기 힘든 당뇨병 상처에 대 한 새로운 세포 기반 치료를 설정 하려고 했습니다. ( 그림 1에서 그림)로 짧게 수용자 rASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 정상적인 쥐에서 만들어진 하 고 전체 간격 피부 결함에 인공 피부의 bilayer를 사용 하 여 당뇨병 쥐에 이식 했다. 가벼운 현미경의 이미지 rASC 시트 (그림 2A)의 좋은 본보기와 rASC 시트 (그림 2B)의 나쁜 예를 들어 그림 2에 표시 됩니다. 때 ASCs는 새로운 문화 접시에 도금, 접시 천천히 앞뒤로 누 볐 어 및 왼쪽 및 오른쪽 유니폼 rASC 시드 및 균일 두께 rASC 시트 (그림 2A)을 달성 하는 인큐베이터에 있어야 합니다. rASCs를 균일 하 게 붙어 있을 수 없습니다 있으며 문화 접시의 표면에 교양, 시트 연속...

지방 유래 줄기 세포 (ASCs) 쉽게 격리 하 고 정상 쥐의 지방에서 수확. ASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 주 커 전체 두께 전시 하는 당뇨 지방 쥐 결함 노출 된 뼈와 피부와 다음 인공 피부의 bilayer 덮여에 이식 될 수 있다.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

이 절차의 전반적인 목표는 당뇨병성 쥐의 큰 전층 피부 결함에 대한 상처 치유에 대한 인공 피부와 결합된 지방 유래 줄기 세포 시트의 효과를 확인하는 것입니다. 이 방법은 뼈가 노출된 당뇨병성 큰 상처와 같은 만성 상처의 치유에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 시트 기술을 사용하여 세포를 고체 시트로 상처에 이식하고 그 결과 실행 가능하고 안정적인 이식이 가능하다는 것입니다.뚱뚱한 패드 기증자의 경우 8주에서 33주 된 루이스 쥐를 사용할 계획을 세우십시오. 수술 부위에는 멸균 면봉 어플리케이터, 거즈, 메스, 바늘 홀더, 수술용 가위, 집게 한 쌍 및 5-0 나일론 봉합사를 준비하십시오. 임시 조직 배치를 위해 100ml 페트리 접시에 10mL의 PBS를 로드합니다.PBS가 적재된 접시의 무게를 측정하여 나중에 수확된 조직의 질량을 찾습니다. 쥐를 마취한 후 멸균 드레이프에 누운 자세로 놓습니다. 그런 다음 수술 부위를 면도하고 70% 에탄올을 여러 번 번갈아 가며 문질러 노출된 피부를 문지릅니다.이제 측면 하복부를 3cm 높이로 절개합니다. 다음으로 외부 경사근을 노출시키고 해부합니다. 그런 다음 부고환을 둘러싼 부고환 지방 조직을 노출시킵니다.다음으로, 부고환 지방 조직을 조심스럽게 절제합니다. 부고환, 고환 및 부고환 혈관의 손상을 피하십시오. 조직을 PBS 접시에 옮깁니다.그런 다음 기증자 쥐를 닫고 표준 수술 후 관리 방법을 따릅니다. 수확된 지방 조직 2-3g에서 ASC를 분리합니다. 0.1% A형 콜라겐분해효소에서 한 시간 동안 조직을 소화하여 기질 혈관 분획(SVF)을 얻습니다.SVF를 정제한 후 20ml의 배지에 SVF를 현탁시킵니다. 현탁액을 60제곱센티미터 배양 접시 2개로 나누고 표준 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 플레이트를 세 번 세척하여 부착되지 않은 세포와 부스러기를 제거합니다.최종 세척 후 새로운 완전한 매체를 다시 추가하십시오. 그런 다음 배양 3일째에 거의 하위 합류점이 될 때까지 세포를 계속 계대시킵니다. 그런 다음 간단한 배양에서 0.25 % 트립신 EDTA 1 밀리리터를 사용합니다.플레이트에서 세포를 제거합니다. 세포가 활성 트립신에 10분 이상 노출되지 않도록 합니다. 세포를 관찰하고 세는 후에, 1, 평방 센티미터 당 700의 조밀도에 그(것)들을 subculture.그런 다음 3일마다 세포를 통과시키고 진행하기 전에 3개의 통로를 완료합니다. 계대배양된 랫드 ASC를 세 번째로 통과시킨 후, 150, 000개의 세포를 35mm 직경의 온도 반응형 배양 접시와 2밀리리터의 배양 배지에 플레이트합니다. 접시를 인큐베이터에서 3일 동안 배양하여 균일한 세포 시트를 만듭니다.3일 후 매체를 변경하고 AA 밀리리터당 16.4마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 세포를 배양하고 AA 배지를 격일로 변경합니다. AA 함유 배지에서 4-5일 후에 ASC의 증식을 확인합니다. 셀과 인접한 셀 시트 사이의 간격을 찾습니다.인접한 셀 시트가 설정되면 셀을 모델에 사용할 수 있습니다. 필요한 경우 플레이트를 실온에서 15-20분 동안 두어 세포 시트를 수집합니다. 플레이트는 온도에 민감하기 때문에 세포가 연속적인 시트로 자발적으로 분리되고 시트는 집게로 제거할 수 있습니다.비만 상처 치유 모델의 경우 체중이 500-600g 인 16-18 주 된 성인 수컷 ZDF 쥐를 사용하십시오. 수술 부위에 쥐를 배치하고 마취시키고 머리를 면도하기 전에 70% 에탄올을 사용하여 청소하십시오. 그런 다음 수술 부위를 면도하고 70% 에탄올을 번갈아 가며 스크럽하여 노출된 피부를 청소합니다.이 시기쯤에, 지방 줄기 세포의 온도 감지 플레이트를 벤치로 옮깁니다. 세포 시트가 플레이트에서 분리되기 전에 배지를 제거하고 PBS로 셀 시트를 세 번 세척합니다. 세포 시트를 수집한 후 필요할 때까지 PBS에 담가둡니다.세포가 준비되면 쥐의 머리에 15 x 10mm 두께의 피부 결점을 만듭니다. 먼저 피부 조직을 골막까지 제거합니다. 그런 다음 메스와 수술용 가위로 피부 조직을 절제합니다.결손을 완성하려면 골막막을 흡혈구로 골막을 제거하십시오. 그런 다음 결함 위에 셀 시트를 놓습니다. 줄기 세포 시트는 부드럽고 유연합니다.집게를 사용하여 결함의 모든 모서리로 확장하십시오. 이제 사용 직전에 식염수에 적신 10 x 15mm 패치로 세포 시트와 결손을 덮고 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 약 10 바늘로 상처를 봉합합니다. 상처를 보호하려면 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 인공 피부에 15 x 20mm 크기의 비접착 드레싱 패치를 고정합니다.쥐는 항상 드레싱을 제거하고 필요한 경우 즉시 드레싱을 교체하기 때문에 격일로 드레싱을 관찰할 계획을 세우십시오. 6마리의 주커(Zucker) 당뇨병성 지방쥐로 구성된 2개 그룹에서, 기술된 프로토콜은 두개골 결함을 생성하는 데 사용되었다. 실험용 쥐는 쥐 지방 줄기 세포 시트로 처리되었으며 대조군은 그렇지 않았습니다.14일 후, 치료군의 상처는 대조군의 상처보다 현저히 작았다. 이 비디오를 보고 나면 쥐에서 뼈가 노출된 큰 상처를 만든 다음 지방 유래 줄기 세포로 그 상처를 치료하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 온도 반응형 배양 접시를 사용하는 전체 과정에서 엄격한 온도 관리를 사용해야 합니다.그렇지 않으면 세포가 접시에서 자발적으로 분리되어 실험이 지연될 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 중앙 동맥과 신경 및 두개골 neurovascular 번들을 나누어 토끼 허혈성 귀에 상처 모델을 만들려면 최소한 침략적 기법을 개발했습니다. 피하 터널 그러면 모두 피하 조직이 생기죠. 이 절차는 최소한의 피부에 혼란을 초래하고 안전하게 당뇨병 동물에서 사용할 수 있습니다.

허혈성 상처 모델 생산을위한 단순화된 테크닉

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

이 연구는 내시경 지방 조직 유래 기질 세포 (ADSC)의 성공적인 방법을보고하는 돼지 모델의 확장 내시경 점막하 절제술 (ESD) 후 식도 협착 방지를위한 - 시트 이식.

ADSC 매 이식은 확장 식도 내시경 점막하 절개 후 협착을 방지하는

준비와 쥐 모델에서 부족 하 게 봉합 대 장 anastomoses에 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC) 시트의 이식 제공 됩니다. 이 새로운 응용 프로그램은 ASC 시트 대 장 문 합 누출을 줄일 수 있습니다 보여줍니다.

쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

수컷 SD 쥐의 스트렙토조토신 유발 당뇨병성 상처 모델은 현재 제1형 당뇨병의 상처 치유를 연구하는 데 가장 널리 사용되는 모델입니다. 이 프로토콜은 이 모델을 생성하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 또한 잠재적인 문제를 제시 및 해결하고 당뇨병성 상처의 진행 및 혈관신생 특성을 검사합니다.

제1형 당뇨병의 쥐 상처 모델을 구축하기 위한 프로토콜

현재 프로토콜은 만성 당뇨병성 족부궤양 치료를 위한 인간 탯줄 중간엽 줄기 세포 주사를 평가하는 전향적, 무작위, 대조 임상 연구를 설명합니다.

당뇨병성 족부궤양 치료를 위한 인간 탯줄 중간엽 줄기세포 주사의 전향적, 무작위 및 대조 연구

이 연구는 만성 상처 치유를 위한 코어피(core-sheath) 3D 바이오 프린팅 골격을 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포외 소포체는 중간엽 줄기세포에서 분리되어 카르복시메틸 셀룰로오스와 알기네이트 리아제로 만든 칼집을 통해 코어(알긴산)에 적재됩니다. 이 설계는 제어된 비계 성능 저하와 효율적인 EV 방출을 가능하게 합니다.

만성 상처 관리를 위한 Core-sheath 3D-Bioprinted Scaffold를 사용한 세포외 소포 전달 최적화

배우세요 지방유래줄기세포(ASC) 시트와 인공피부를 이용한 당뇨병 쥐의 만성 상처 치유 방법을. 이 기술은 세포 시트 공학으로 안정적인 이식을 가능하게 하여 당뇨병 환자의 난치성 상처 치료에 새로운 가능성을 제시합니다.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

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