Name: 효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 펩타이드 작용제의 직렬 희석을 위한 자동 음향 분배 방법으로 플라스틱 흡착을 최소화하여 약물 발견에서 정확한 효능 판별을 가능하게 합니다. 이 기법은 데이터 품질과 재현성을 향상시킵니다.

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1. 펩타이드 직렬 희석 <ol><li> 분석 완충액을 준비 : 행크스 25 mM의 HEPES, 0.1 % BSA 및 0.5 mM의 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 (IBMX), pH를 7.4로 보충 된 염 용액 (HBSS)에 버퍼링. </li><li> 체계적 다섯 384 웰 저용량 분석 플레이트의 각 웰에 분석 완충액 5 μL를 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용한다. <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 384 웰 플레이트의 각 웰에 5 μL 볼륨 추가를위한 분배 프로그램을 만들기 위해 내부 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 분석 버퍼와 주요 유체에 카세트 튜브를 분배 빠져. </li><li> 플레이트 캐리어 384도 낮은 볼륨 분석 플레이트를 놓습니다. </li><li> 를 눌러 시작. </li></ol></li><li> 100X 펩티드 스톡을 생성하는 분석 완충액에 관계없이 기억 차량의 모든 펩티드 시료를 희석. 주 : 스크리닝을 요구하는 펩타이드는 예를 들어, DMSO w (적절한 것으로 간주 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 또는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 제공 될 수있다병이 같은 PEG 화와 같은 보조 수정)과 펩티드에 해로운 영향을 미친다. </li><li> 열 음향 자격을 갖춘 384 웰 폴리 프로필렌 마이크로 1-5로 25 μL를 100 배 펩타이드 주식을 분배. 이 판은 &#39;소스 판 A&#39;지정됩니다. 해당 소스 판을 확인 있지만 대상 플레이트, 평면 바닥하고 어쿠스틱 악기의 제조 업체에 의해 정의 된 특정 음향 허용 오차를 준수합니다. </li><li> 우물 A23에 25 μL의 100 배 기준 제어를 분배 및 소스 판 A의 A24 </li><li> 소스 A. 플레이트의 컬럼에 컬럼 21-22 11-15 30 μL의 분석 완충액으로 10 ㎕의 분석 완충액을 분배 </li><li> 열 번째 음향 정규화 384- 웰 폴리 프로필렌 마이크로 6-10 및 16-20 칼럼에 10 μL의 분석 완충액을 분주한다. 이 판은 &#39;소스 판 B&#39;를 지정한다. </li><li> 1 분 300 XG에 원심 분리기 소스 판 A와 B. 적절한 균형 플레이트를 포함합니다. </li><li> 음향 flui를 사용하여소스 A에 열 1에서 100 배 펩타이드 주식 (분석 버퍼) (100) 중간 희석 : D 디스펜서는 세 연속 1을 제조 자동화 로봇 시스템에 통합 참고 : 프로그래밍 소스 A와 소스 B (플레이트 레이아웃 그림 1 참조) 사이의 세 가지 음향 전송을 허용하는 판 포맷하고 (음향 유체 디스펜서의 제조 업체에 의해 제공) 용량 반응 소프트웨어가 필요합니다. 구체적으로는 1.9 상세 자동화 로봇 제어하에,이 실험에서 사용되는 액체 분배기의 사용 단계 (재료 표 참조) : <ol><li> 로봇의 판 호텔 섹션에로드 소스 접시와 분석 플레이트. </li><li> 오픈 자동화 된 로봇 소프트웨어 및로드 플레이트 재 포맷 및 용량 반응 프로그램 확장 프로토콜. &#39;실행&#39;을 클릭합니다. 참고 : 자동화 소스 플레이트 B의 열 6-10로 소스 플레이트 (A)의 열 1-5에서 250 NL을 전송하는 음향 유체 디스펜서를 지시하고, 두 번째 ACOUSTI섞어 15 ㎕의 분석 완충액으로 백필 더 큰 유체 볼륨을 처리 할 수있는 C 액 디스펜서. 자동화는 통합 원심 분리기 1 분 동안 300 XG에 원심 분리기 (적절한 균형 판은 모든 원심 분리 단계를 포함)에 소스 판 B를 전송합니다. 소스 플레이트 B 소스 판 A의 열 11-15로 소스 플레이트 B의 열 6-10에서 250 NL의 전송을 위해 음향 유체 분배기로 돌아 혼합 15 μl를 분석 버퍼 백필됩니다. 통합 원심 분리기 1 분 동안 300 XG에 원심 분리기에 자동화 전송 소스 플레이트를했다. 소스 플레이트 (A)는 다음 소스 판 B의 열을 16-20로 소스 플레이트 (A)의 열이 11 ~ 15에서 250 NL의 전송을 위해 음향 유체 분배기로 돌아 혼합 15 μl를 분석 버퍼 백필됩니다. 자동화는 1 분 300 XG에 통합 원심 분리기 및 원심 분리기에 소스 판 B를 전송합니다. 주 : 마지막 투여 량 반응 프로토콜을 전송하는 탄성 분배 지시(소스 플레이트 A와 소스 플레이트 B 모두에서) 4 직렬 희석 소스 판 우물의 각에서 필요한 볼륨을 분석 플레이트에 중복으로 전체 11 점 곡선을 구성하는 (위의 단계 1.2에서 5 ㎕를 분석 버퍼로 미리 채워진 ). 자동화 통합 원심 분리기에 전송 분석 플레이트 및 원심 분리기 1 분 300 XG에. </li></ol></li></ol> 2. 셀 준비 <ol><li> 20 mL의 분석 완충액에서 37 ºC 수욕 재현 탁하고 빠르게 목표 마우스 GLP-1 수용체를 발현 녹여 동결 보존 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포. </li><li> 실온에서 200 XG (RT)에서 5 분 동안 원심 분리 세포 현탁액. 적절한 균형을 포함합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 ml의 분석 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 트리 판 블루 1 및 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 밀도를 결정 : 세포 스톡 1 희석. 아 당 8,000 세포 (동등한 ml의 1.6 × 10 6 세포에서 분석 버퍼에 재현 탁 세포분석 판 리터). </li><li> 실온에서 30 분 동안 (5 μL를 분석 완충액에 희석 한 펩티드를 포함)을 분석 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 5 μL를 추가 배양 벌크 시약 디스펜서를 사용한다. </li></ol> 3. HTRF 캠프 탐지 분석 <ol><li> 사용하기 전에 30 분 동안 실온 HTRF의 cAMP 분석 키트를 준비한다. </li><li> (캠프 검출법의 제조자에 의해 제공된 고유의 제제) 용해 완충액에 희석 1시 20분 별도로 각 HTRF 시약 (크립 테이트 및 D2)을 준비한다. 참고 :주의 : 용해 버퍼가 칼륨 독성 플루오 라이드 (KF)과 기형 (13)를 포함한다. 폐기, KF를 포함하는 분석 플레이트를 밀봉하고 소각 및 액체 폐기물은 이전 싱크대 아래로 폐기 물 &lt;1 밀리몰 / L로 희석해야한다. </li><li> 분석 플레이트의 모든 웰에 5 μL의 크립 테이트 시약을 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용합니다. </li><li> 콜럼 5 μL의 D2 시약을 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용NS 분석 판 1-22. </li><li> 수작업의 비 - 특이 적 결합 (NSB) 대조군 웰과 웰 E23-P24에 D2 시약 5 μl를 제공하기 위해 분석 플레이트의 웰 A23-D24에 5 ㎕의 용해 완충액을 피펫. </li><li> 우물을 섞어 실온에서 200 XG에서 1 분 동안 분석 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 증발 및 사진 표백을 최소화하고 1 시간 동안 실온에서 배양 분석 플레이트를 커버. </li><li> 620 nm에서 플레이트 리더를 사용하여 665 nm에서 320 nm의 여기 및 발광을 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 신호를 측정한다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 모든 우물에서 배경을 뺄 NSB을 의미합니다. </li><li> 다음과 같이 665 나노 미터 / 620 nm의 비율에서 % 델타 F를 계산합니다 : 비율 = (A 665nm / A 620 ㎚)는 10 (4) X 델타 F = ((샘플 비율 - 비율 NSB) / 비율 NSB는)) × 100 여기서 비율 NSB없이 D2 시약 우물을 =. </li><li> %의 activat을 계산다음 자극되지 않은 세포와 세포 사이의 이온 최대 GLP-1을 리간드로 자극 : % 활성 = (% Fsample 델타가 - %가 DeltaFunstimulated 셀) / (%의 DeltaFGLP-1 세포 자극 - % DeltaF 자극되지 않은 세포) × 100 </li><li> 기준 제어부 (1)에 의해 정의 된 바와 같은 활성 % 4- 매개 변수 병참 분석 그래프를 통해 농도 - 반응 곡선을 분석한다. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

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이 프로토콜은 직렬 샘플의 1 μl를 필요로하는 3 × 106의 농도 범위 펩티드 시료를 희석하는 자동 분배 탄성의 성공적인 적용을 설명한다. 이 방법의 가장 큰 장점은 일반적으로 시약 전송 및 믹싱에 필요한 실험 용기 (예 : 피펫 팁 등) plasticware에 샘플 감소 노출을 통해 plasticware에 펩타이드의 흡착을 최소화를 통해 데이터 품질을 높이는 것입니다. 탄성 분배 완전히 plasticware의 사용을 배제하지 않지만, 상당히 감소를 않는다. 또한, 팁 기반 피펫의 제거는 샘플 이월을 제거하고 오차의 농도 - 반응 곡선 (14, 15) 모두 안정적이고 재현성있게 제조, 전체 용액을 희석에 전파되지 않는다. 다른 그룹에 DMSO에 용해 시험 화합물의 직접 음향 전송을보고시간 (16, 17)을 통해 분석 플레이트 및 배양 반전 이외의 필요없이 혼합 단계와 장기 분석 (&gt; 48 시간)에 대한 세포....

GLP-1R은 제 2 형 당뇨병 (2)의 처리에서 설정된 약물 표적이다. 이 수용체에 대한 천연 펩티드 작용제, GLP-1은 2-3 분 (3)의 생체 내 반감기를 갖는다. 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화에 네이티브 G 단백질의 커플 링을 통해 제 메신저는 cAMP의 하류 생산의 G 단백질 결합 수용체 표적 결과 GLP-1의 결합. 축적 된 캠프의 측정은 강력한 분석 수용체 활성화를 모니터링하고 선호하는 물리 화학적 특성을 가진 활성 GLP-1 유사체에 대한 선별을 제공합니다. 이러한 분석은 농도 - 반응 곡선을 구성하기 시험 샘플의 일련의 희석을 필요로하고, 펩티드 샘플 나눠 때 특히 복잡하다. 팁 기반 일련 희석 준비에서 잠재적 인 오류는 이전에 1,4,5 설명 하였다. 펩타이드는 신뢰할 수없는 힘 추정 결과, plasticware에 흡착됩니다. 펩티드 손실 t 통해 최소화 될 수있다그는 소 혈청 버퍼에서 알부민 (BSA)와 실리콘 처리 plasticware의 사용, 아직 결합 단백질의 포함은 예측할 수없는 남아 있습니다. 특히, 실험 용기에 GLP-1의 결합의 편차가 6을 설명 하였다. 수성 분석 완충액으로 팁, 마이크로 타이 터 플레이트에서 침출 단백질 기능 (7, 8)을 방해 할 수 실험실 plasticware에 사용 된 안정 화제의 또 다른 합병증이있다. 따라서, 방법 plasticware 노출을 감소시키기는 측정의 정확성을 증가시킬 필요가있다. 어쿠스틱 액체 디스펜서 인접 분석 플레이트 (9)로 정밀한 나노 리터 액적 토출의 결과, 유체 시료의 표면에 고주파 음향 신호를 집중한다. 탄성 분사의 사용은 제조 및 대형 합성 화합물 라이브러리의 스크리닝을위한 제약 산업 표준 및 기술은 잘 작은 molecul 대한 검증되었습니다에스 10. 우리의 지식, 우리는 재조합 및 합성 펩타이드의 제조를위한 음향 분배를 설명하는 첫 번째 그룹이며, 우리는 이전에 기존의 팁 기반의 방법 1에 비해 향상된 정확도를보고했다. 이 문서에서는 완전히 자동화 된 플레이트 처리 로봇 시스템에 비접촉 음향 전송에 의한 펩타이드 직렬 및 직접 희석의 준비의 통합을 설명합니다. 샘플 음향 전달을 감싸는 다수의 방법은 이전에 11 설명되었다. 우리는 2 단계 방법의 중간 스톡 농도를 준비하고 직렬의 전체 용량 - 반응 곡선의 생성에 대한 펩타이드 유사체 희석을 이용한다. 제조 된 펩타이드는 세포를 대상 마우스 GLP-1R 발현과 함께 배양하고, 우리는 펩티드 작동 제의 액티브의 판독 이러한 세포 내에서의 cAMP 축적을 측정하기 위해, 시판 균질 시간 - 분해 형광 (HTRF) 분석을 사용하여성만. 상기 분석은 견고하고 높은 처리량 384- 웰 포맷 의무 일상적 모두 분석법 개발에 적용되는 약물 스크리닝 (12)을 투사한다.

<table><tbody><tr><td>행크스의 균형 잡힌 소금 용액</td><td>: 시그마 -알드리치</td><td>H8264</td><td></td></tr>, <tr><td>HEPES</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>I7018</td> DMSO GLP-1 (7-36) 아미드 Bachem H-6795<td>에서 0.5 M 스톡으로 제조</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>'100x reference control'이라고 하는 PBS에서 1mg/ml 스톡으로 제조</td></tr> 테스트 <tr><td>펩타이드</td><td>MedImmune</td><td></td>에서 자체 생산 <td>DMSO 또는 PBS에서 다양한 농도로 적절하게 공급</td></tr><tr><td>100x 펩타이드 스톡</td><td>MedImmune</td><td></td> Test에서 자체 생산 <td>펩타이드를 분석 버퍼에 희석하여 최종 요구 농도의 100배로</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS 세포 분석기</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384웰 플레이트, 저용량</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo 인증 384웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>에코 인증 저장소</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 리퀴드 핸들러</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>2.5nl 단위로 증가하는 액적 전달 부피</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>25nl 단위로 증가하는 액적 전달 부피</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp;</td>생명 과학 로봇 공학용 <td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario 실험실 자동화 스케줄링 소프트웨어</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi 시약 디스펜서</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>'벌크 시약 디스펜서'라고 함</td></tr> <tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>퍼킨엘머</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

소분자 약물 발견과 같이, 펩티드 작동 선별하여 농도 - 반응 곡선을 생성하는 펩티드의 일련의 희석을 필요로한다. 펩티드를 스크리닝 종래 팁 기반 시료 처리 방법을 통해 흡착 펩티드 손실 증가 된 기회를 제공 plasticware 큰 표면적에 노출 펩티드로 복잡한 계층을 제공한다. plasticware 과도한 노출을 방지하는 플라스틱에 대한 밀착성을 통해 펩티드 손실을 감소시키고, 따라서 효능 예측의 부정확성을 최소화하고, 우리는 이전 펩티드 작동 (1)의 시험 관내 높은 처리량 스크리닝 분배 비접촉 탄성의 장점을 설명하고있다. 여기서는 마우스 글루카곤 유사 펩타이드 -1 수용체 (GLP-1R)에 펩티드 작동 스크리닝의 예를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 펩티드 계열 희석 비접촉 탄성 제조 완전히 통합 된 자동화 솔루션을 논의한다. 우리의 방법은 높은 허용-throughput 작용제에 대한 화면을 분석 세포 기반 쉽게 증가 시료 처리를 지원하기 위해, 또는 (기타 표적 세포주 패널, 예) 분석 플레이트 사본 수가 증가를 허용하도록 확장 가능하다.

<html> 우리는 일상적 탄성 송금 펩티드 희석 두 단계 방법을 사용한다. 첫 번째 단계의 경우, 자동으로 정렬 음향 디스펜서는 두 개의 소스 판에서 네 재고 펩타이드 중간 희석액을 만드는 데 사용됩니다 (그림 1A, B). 두 번째 단계에서, 우리는 상기 각 테스트 펩티드 (도 1C)에 대한 11 점의 농도 범위를 만들기 위해 소스 판 A 및 B에서 스톡 희석 희석 음향 디스펜서를 사용한다. 각 펩타이드의 농도 범위는 16 개의 서로 다른 펩티드 384- 웰 분석 플레이트 (도 1C)에 따라 스크리닝 될 수 있도록 분석 플레이트 왼쪽에서 오른쪽으로, 이중에서 소성한다. 어 세이 버퍼 채움을 분석 플레이트 (도 1D)에 걸쳐 잘 당 일정한 양을 보장하기 위해 수행된다. 참조 펩타이드 양성 대조군은 최대 유효 농도에서 대...

전통적인 팁 기반 연속 희석 중 플라스틱 용기에 펩타이드 흡착은 효능 결정에 상당한 영향을 미치고 약물 발견의 선도 물질 식별 및 선도 물질 최적화 단계에 사용되는 구조-활성 관계의 이해를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 샘플의 자동화된 음향 비접촉 연속 희석 방법에 대해 설명합니다.

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

펩타이드 샘플의 연속 희석을 위한 이 자동화 프로토콜의 전반적인 목표는 플라스틱 용기에 대한 펩타이드 흡착을 최소화하여 신약 개발을 위한 정확한 역가 측정을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 데이터의 품질과 재현성을 높일 수 있으며, 팁 기반의 피펫팅을 제거함으로써 샘플의 오염(carryover)을 방지하여 전체 연속 희석 과정 동안 오차가 전파되지 않도록 합니다. 이 기술의 주요 장점은 플라스틱 용기에 대한 펩타이드 흡착을 최소화함으로써 데이터 품질을 향상시킨다는 점입니다.이는 특히 약물 발견 과정에서 구조-활성 관계를 도출하거나 리드 화합물 식별 캠페인을 추진할 때 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 분석 버퍼를 준비하고 벌크 디스펜서를 위한 분주 프로그램을 생성한 후, 분주 카세트 튜브를 분석 버퍼에 담가 액체로 프라이밍하십시오. 384-웰 저용량 분석 플레이트를 플레이트 캐리어 위에 놓으십시오.그 다음 시작 버튼을 누릅니다. 소스 플레이트 A로 지정될 음향 정밀도가 검증된 384-웰 평저 폴리프로필렌 마이크로플레이트의 1번부터 5번 컬럼에 100배 농축 펩타이드 스톡 25 µL를 분주합니다. A23 및 A24 웰에 100배 농축 참조 대조군 25 µL를 분주합니다. 이어서 11번부터 15번 컬럼에 분석 버퍼 10 µL를, 21번부터 22번 컬럼에 분석 버퍼 30 µL를 분주합니다.다음으로, 소스 플레이트 B로 지정된 두 번째 음향 인증 384 웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트의 6~10번 및 16~20번 열에 어세이 버퍼 10 µL를 분주합니다. 소스 플레이트 A와 B를 300 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 후, 소스 플레이트와 어세이 플레이트를 로봇 장치의 플레이트 호텔 섹션에 로드합니다.그 다음 텍스트 프로토콜에 따라 로봇 소프트웨어를 실행하고, 시스템에 통합된 음향 액체 분사기를 사용하여 1/100 단계 희석을 세 차례 연속으로 준비합니다. 먼저 소스 플레이트 A의 1번에서 5번 컬럼에서 소스 플레이트 B의 6번에서 10번 컬럼으로 옮기는 것부터 시작합니다. 첫 번째 1/100 희석 준비가 완료되면, 자동화 시스템이 소스 플레이트 B를 통합 원심분리기로 옮겨 300 ×g에서 1분 동안 원심분리한 후, 플레이트를 다시 음향 액체 분사기로 복귀시키도록 합니다. 이어서 두 번째 1/100 희석을 위해 소스 플레이트 B에서 소스 플레이트 A로 용액을 옮긴 후, 자동화 시스템이 소스 플레이트 A를 원심분리기로 옮겨 원심분리하고 다시 액체 분사기로 복귀시킵니다.마지막으로, 자동화 시스템이 100배 희석의 세 번째 단계로 플레이트 A에서 B로 용액을 옮긴 후, 플레이트 B를 다시 원심 분리합니다. 소스 플레이트 A와 소스 플레이트 B의 이러한 펩타이드 희석액은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 어세이에서 전체 농도 반응 곡선을 작성하는 데 사용됩니다. 비교 대상인 팁 기반 방법론은 펩타이드가 플라스틱 기구에 흡착되어 샘플의 역가가 급격히 감소하므로, 이 단계가 매우 중요합니다.표적 마우스 GLP1 수용체를 발현하는 동결 보존된 CHO 세포를 37 °C 항온 수조에서 빠르게 해동하고, 20 mL의 분석 버퍼를 사용하여 재현탁합니다. 세포 현탁액을 실온에서 200 ×g로 5분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 10 mL의 분석 버퍼를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.Trypan Blue를 사용하여 세포 스톡을 1:1로 희석하고, 자동 세포 계수기를 이용해 생존 세포 밀도를 측정합니다. 그 다음, 어세이 버퍼를 사용하여 세포를 mL당 1.6 million cells 농도로 재현탁합니다. 벌크 시약 분주기를 사용하여, 단계별로 희석된 펩타이드가 포함된 어세이 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 5 µL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.cyclic AMP 검출 분석을 수행하려면, 용해 버퍼를 사용하여 각 균질 시간 분해 형광(homogenous time-resolved fluorescence) 또는 HTRF 시약을 20배 희석하여 준비합니다. 대용량 시약 분주기를 사용하여 분석 플레이트의 모든 웰에 cryptate 시약 5 µL를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트의 1번부터 22번 컬럼까지 D2 시약 5 µL를 첨가합니다.다음으로, E23부터 P24까지의 웰에 D2 시약 5 µL를 첨가합니다. 즉시 수동 피펫을 사용하여 비특이적 결합 대조군 웰로 사용할 A23부터 D24까지의 웰에 lysis buffer 5 µL를 첨가합니다. 웰의 성분들이 섞이도록 분석 플레이트를 200 ×g, 상온에서 1분 동안 원심 분리합니다.그 다음 플레이트를 덮고 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트 리더를 사용하여 들뜸 파장 320 nanometers, 방출 파장 620 및 665 nanometers에서 fret 신호를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다.cyclic AMP 검출 분석을 위한 어쿠스틱 트랜스퍼(acoustic transfer)의 첫 번째 단계는 여기에서 보는 바와 같이 두 개의 소스 플레이트에 걸쳐 4개의 스톡 펩타이드 중간 희석액을 만드는 것입니다. 두 번째 단계에서는 어쿠스틱 디스펜서가 소스 플레이트 A와 B의 스톡 용액을 추가로 희석하여, 16가지의 서로 다른 펩타이드 각각에 대해 듀플리케이트(duplicate)로 11개 지점의 농도 범위를 생성합니다. 분석 플레이트 전체의 웰당 부피를 일정하게 유지하기 위해 분석 버퍼 백필(backfill)을 수행합니다.여기 제시된 것은 cyclic AMP 축적 분석을 통해 실행된 16가지 펩타이드가 중복으로 포함된 예시 플레이트의 히트맵입니다. 보라색으로 표시된 낮은 값은 높은 cyclic AMP 농도를 나타냅니다. 이러한 농도 반응 곡선은 중복 측정 지점의 재현성을 보여줍니다.시료 1은 분석의 양성 대조군을 나타냅니다. 시료 2, 3, 4는 비활성 상태이며 그래프 상의 평탄한 선으로 표시됩니다. 시료 5부터 16까지는 활성 테스트 펩타이드를 나타냅니다.여기에 제시된 방법은 광범위한 효능 범위에 걸쳐 전체 농도 반응 곡선을 생성할 수 있게 합니다. 이 기술에 숙달되면 3시간 이내에 완료할 수 있으나, 이는 준비가 필요한 샘플 수에 따라 달라질 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 펩타이드는 생물학적 샘플이므로 그에 맞게 취급해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.무결성을 유지하기 위해 반복적인 동결-해동 주기를 피해야 합니다. 이 기술은 펩타이드 신약 개발 분야의 연구자들에게 길을 열어줄 것이며, 구조-활성 관계(SAR) 연구에 필요한 정확한 효능 예측을 가능하게 할 것입니다. 이 영상을 시청하고 나면 펩타이드의 연속 희석을 위한 자동 음향 분주법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 이를 통해 흡착으로 인한 펩타이드 손실을 최소화하고 측정의 정확도를 높일 수 있을 것입니다.피코몰(picomolar) 수준의 효능을 가진 생물학적 활성 펩타이드물을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 개인 보호 장구와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)

이 종이 합성 및 펩 티 드 amphiphile micelles monocyte 대상의 특성을 포함 하는 메서드를 제공 하 고 해당 생체 적합성 및 monocytes에 바인딩할는 micelle의 능력에 대 한 테스트 분석 실험.

동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성

이 프로토콜은 라벨이 없는 임피던스 측정을 사용하여 단일 마이크로 전극에서 성장한 단일 세포 층으로부터 작용제 유발 GPCR 활성화에 대한 전체 용량 응답 관계를 실시간으로 기록하는 것을 보여줍니다. 새로운 도징 방식은 시간 해결 의 손실없이 처리량을 크게 증가시킵니다.

라벨없는 임피던스 기반 GPCR 분석에서 처리량 증가를위한 단계별 투약 프로토콜

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

배우세요 펩타이드 작용제의 직렬 희석을 위한 자동 음향 분배 방법으로 플라스틱 흡착을 최소화하여 약물 발견에서 정확한 효능 판별을 가능하게 합니다. 이 기법은 데이터 품질과 재현성을 향상시킵니다.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

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